本發(fā)明涉及一種雙層骨修復膜材料的制備方法，屬于生物材料領域，具體涉及一種以可降解脂肪族聚酯所形成的纖維作為主要基體材料并加載抗菌藥物的外層膜和加載促成骨物質的內層膜復合而成的雙層骨修復膜材料及其制備方法。

背景技術：

骨缺損是臨床上非常常見的創(chuàng)傷，骨的修復過程是非常漫長的，它主要包括血腫和炎癥期、初始骨痂反應期、軟骨形成期以及骨形成及改建期。在骨修復過程中細胞分泌多種生長因子以不同時序發(fā)揮作用，保證骨缺損的修復。

在臨床上，當骨缺損發(fā)生時，最好的辦法是進行骨移植，主要包括自體骨移植，同種異體骨移植以及非組織修補術等，其中對骨缺損修復效果最好的是自體骨移植。但是，自體骨取用過多會給患者帶來新的創(chuàng)傷及并發(fā)癥；同種異體骨移植可以克服部分自體骨移植帶來的問題，但是會受到供體來源、移植時組織狀況以及免疫原性等的限制；非組織修補術通常用于關節(jié)替代手術，主要問題就是不能跟周圍的組織整合進而形成感染的病灶。對于骨缺損或者組織缺損，理想的解決辦法就是要克服以上三個方面的問題。生物材料領域為解決這一問題提供了潛在的選擇。

作為一個理想的骨修復支架材料，需要滿足以下四個方面的要求：

(1)具有生物相容性、骨傳導性、骨誘導性，能夠為正常的細胞活動提供支持；

(2)可生物降解性，能夠為新組織的長入提供空間并逐漸被新組織取代；

(3)一定的力學性能，能承受手術操作過程以及骨生長過程中的應力；

(4)連貫多孔結構，為新組織的生成運輸營養(yǎng)物質和廢物。

靜電紡絲技術是一種制備納米纖維的簡單通用方法，由于其藥物加載方式簡單易行，在靜電紡絲過程中可以將不同的藥物容易的加載到纖維中，另外，藥物在載入纖維中后不會發(fā)生性能變化，仍能保持其性能，可以用來預防術后感染或促進骨的生成。因此，靜電紡絲制備的納米纖維載藥膜具有良好的臨床應用前景。同時骨缺損處多種生長因子缺乏或是活性不足是影響骨再生的重要原因，因此，研究一種既可以抗菌消炎又可以促進骨修復的生物材料是十分重要的。同時，由于抗感染藥物主要作用于發(fā)炎的周圍組織，而促成骨物質則需直接作用于骨骼。為了提高藥物的利用率，使用雙層膜結構來分別加載這兩種藥物是一種很有效的方法。

本專利中涉及的促成骨物質主要指羥基磷灰石、氧化石墨烯、碳納米管、磷酸三鈣、淫羊藿苷；生物玻璃包括有45s5、磷灰石-硅灰石活性玻璃、可切削生物活性玻璃；生長因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bmp)、成纖維細胞生長因子(fgf)、轉化生長因子(tgf-β)、血小板衍生生長因子(pdgf)、血管內皮細胞生長因子(vegf)和胰島素樣生長因子(igf)。其中，生物玻璃是指由sio2，na2o，cao和p2o5等基本成分組成的硅酸鹽玻璃。它具有良好的生物相容性，可以與骨組織緊密結合。由于其良好的促成骨性能和優(yōu)良的加工性能，生物玻璃在修復骨缺損方面有著廣闊的前景。然而，生物玻璃材料本身較硬脆，因此不適合獨立作為支架誘導骨再生。通過靜電紡絲技術將生物玻璃作為促成骨因子混入纖維中，可以有效的規(guī)避這個問題。同時，生物玻璃的加入也可以有效的改善纖維膜的機械性能，大大擴展了材料的應用范圍。生長因子是指一類通過與特異的、高親和的細胞膜受體結合，調節(jié)細胞生長與其他細胞功能等多效應的多肽類物質。生長因子對不同種類細胞具有一定的專一性，具有促成骨作用的生長因子可以促進生成大量的成骨細胞、抑制破骨細胞。在治療骨質疏松、股骨頭壞死、關節(jié)炎、風濕病和因鈣缺乏導致的疾病方面具有很好的效果。

由于材料植入過程中的感染而引起的發(fā)炎主要發(fā)生在材料周圍的組織中，而促成骨物質則要作用骨組織，二者的作用位置并不相同。為了提高藥物的利用效率，提高治療效果，可以將兩種藥物添加到不同的兩層膜中。內層膜貼近骨骼，添加促進骨生成物質；外層膜貼近組織，添加抑菌藥物。由于兩層膜成分相近，因此可以較為緊密的結合在一起，不易脫落或分離。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是提供一種雙層骨修復膜材料的制備方法，實現抗菌藥物和促成骨藥物的定向釋放，可以促進骨缺損修復，不必二次手術，還可抑制缺損發(fā)生后易發(fā)生的細菌性感染及炎癥。

雙層骨修復膜材料，其特征是：以具有生物相容性的可降解脂肪族聚酯及天然可降解聚合物作為基體材料，具有多孔結構；材料中含有兩層緊密結合的膜，并在內層膜中添加促成骨成分，外層膜添加抗菌藥物，其中：

外層膜以可降解脂肪族聚酯及可降解天然高分子的混合物作為基體材料，其中可降解脂肪族聚酯與可降解天然高分子的質量比為10/90-50/50，抗菌藥物質量與基體材料即可降解脂肪族聚酯和可降解天然高分子的總質量之比為1/100-30/100，內層膜以可降解脂肪族聚酯及可降解天然高分子的混合物作為基體材料，其中可降解脂肪族聚酯與可降解天然高分子的質量比為50/50-90/10，促成骨物質的質量與基體材料即可降解脂肪族聚酯和可降解天然高分子的總質量之比為1/100-40/100，含有多載藥緩釋系統(tǒng)骨修復材料的結構特征為具有多孔結構，平均搭橋孔徑為2-6μm。

進一步，該材料由兩層緊密結合的膜組成；內層膜貼近骨組織，添加有促成骨物質；外層膜貼近組織，含有抑菌藥物。

進一步，可降解合成高分子包括：聚乳酸、聚己內酯、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚乳酸-己內酯共聚物、聚乳酸-羥基乙酸-己內酯共聚物其中的一種或兩種以上的混合物；可降解天然高分子材料包括：i型膠原、明膠、殼聚糖、淀粉、纖維素、彈性蛋白中的一種或兩種以上的混合物。

進一步，載入外層膜基體的藥物a包含青霉素類、頭孢霉素類、四環(huán)素類、氯霉素類、大環(huán)內脂類、林可霉素、氟喹諾酮類、硝基咪唑類、多肽類及季銨鹽類抗菌藥；載入內層膜基體的促成骨物質b羥基磷灰石、氧化石墨烯、碳納米管、磷酸三鈣、淫羊藿苷；生物玻璃包括有45s5、磷灰石-硅灰石活性玻璃、可切削生物活性玻璃；生長因子包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp、成纖維細胞生長因子fgf、轉化生長因子tgf-β、血小板衍生生長因子pdgf、血管內皮細胞生長因子vegf和胰島素樣生長因子igf。

進一步，通過調節(jié)膜材料雙層膜結構的內外層基體材料組成來控制膜材料的降解速度；外層膜在抑制骨缺損發(fā)生后初期易出現的細菌性感染及炎癥之后，降解完全；內層膜則將為骨修復全程提供促成骨物質，直至骨修復完成后再行完全降解。

所述的雙層骨修復膜材料制備方法有如下步驟：

(1)將可降解脂肪族聚酯溶于有機溶劑中，烘箱中靜置0.5-1h，得到可降解脂肪族聚酯質量濃度為0.04-0.4g/ml的溶液a；

(2)向a溶液中加入可降解天然高分子，室溫磁力攪拌6-12h，得到可降解脂肪族聚酯質量濃度為0.04-0.4g/ml的溶液b，溶液b中可降解脂肪族聚酯與可降解天然高分子的質量比為10/90-50/50；

(3)向溶液b中加入抗菌藥物1，室溫磁力攪拌6-12h，得到可降解天然高分子濃度為0.04-0.4g/ml的溶液c，溶液c中抗菌藥物1與可降解脂肪族聚酯和可降解天然高分子總質量的比為1/100-30/100。

(4)將可降解脂肪族聚酯溶于有機溶劑中，烘箱中靜置0.5-1h，得到可降解脂肪族聚酯質量濃度為0.04-0.4g/ml的溶液d；

(5)d溶液中加入可降解天然高分子，室溫磁力攪拌6-12h，得到可降解脂肪族聚酯質量濃度為0.04-0.4g/ml的溶液e，溶液e中可降解脂肪族聚酯與可降解天然高分子的質量比為50/50-90/10；

(6)向溶液e中加入促成骨物質2中的一種或多種，室溫磁力攪拌6-12h，得到可降解天然高分子濃度為0.04-0.4g/ml的溶液f，溶液f中促成骨物質2的總質量與可降解脂肪族聚酯和可降解天然高分子總質量的比為1/100-40/100。

(7)用溶液c進行靜電紡絲，以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉動速率為100-600rpm，紡絲液流動速率為0.5-3ml/h，電壓7-30kv，接收距離8-30cm，紡絲0.5-30h，得到厚度50-200μm的電紡絲纖維膜；

(8)用溶液f進行靜電紡絲，以步驟(7)中帶有纖維膜的以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉動速率為100-600rpm，紡絲液流動速率為0.5-3ml/h，電壓7-30kv，接收距離8-30cm，紡絲0.5-30h，得到厚度250-500μm的靜電紡絲纖維膜；

(9)靜電紡絲結束后，將紡絲膜在通風櫥中室溫放置2-7天，包裝消毒。

本發(fā)明采用靜電紡絲的方法制備納米纖維，但是本發(fā)明不限于靜電紡絲，溶液澆注、3d打印等制備的材料以及水凝膠等都適用于本發(fā)明。

附圖說明

圖1為雙層骨修復膜材料示意圖；

圖2為實施例1的雙層骨修復膜材料的電鏡圖片；

圖3為實施例1-6的雙層骨修復膜材料的抑菌圈照片，模型菌為金黃色葡萄球菌。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。

實施例1

(1)取4g的聚己內酯，加入20ml三氟乙醇溶劑中，在烘箱中靜置1h，得到聚己內酯質量濃度為0.2g/ml的溶液a；

(2)向a溶液中加入4g的明膠，室溫磁力攪拌12h，得到溶液b，溶液b中聚己內酯與明膠的質量比為50/50；

(3)向溶液b中加入0.08g抗菌藥物環(huán)丙沙星，室溫磁力攪拌6h，得到溶液c，溶液c中環(huán)丙沙星與聚己內酯和明膠總質量的比為1/100；

(4)取7.2g的聚己內酯，加入20ml三氟乙醇溶劑中，在烘箱中靜置1h，得到聚己內酯質量濃度為0.36/ml的溶液d；

(5)向d溶液中加入0.8g的明膠，室溫磁力攪拌12h，得到溶液e，溶液e中聚己內酯與明膠的質量比為90/10；

(6)向溶液e中加入0.08g促成骨物質45s5生物玻璃，室溫磁力攪拌6h，得到溶液f，溶液f中生物玻璃與聚己內酯和明膠總質量的比為1/100；

(7)用溶液c進行靜電紡絲，以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉動速率為300rpm，紡絲液流動速率為2.5ml/h，電壓28kv，接收距離10cm，紡絲8h；

(8)用溶液f進行靜電紡絲，以步驟(7)中帶有纖維膜的以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉動速率為300rpm，紡絲液流動速率為2.5ml/h，電壓28kv，接收距離10cm，紡絲8h，得到電紡絲纖維膜；

(9)靜電紡絲結束后，將紡絲膜在通風櫥中室溫放置2天，包裝消毒。

實施例2

(1)取0.8g的聚己內酯，加入20ml三氟乙醇溶劑中，在烘箱中靜置1h，得到聚己內酯質量濃度為0.04g/ml的溶液a；

(2)向a溶液中加入7.2g的明膠，室溫磁力攪拌12h，得到溶液b，溶液b中聚己內酯與明膠的質量比為10/90；

(3)向溶液b中加入2.4g抗菌藥物環(huán)丙沙星，室溫磁力攪拌6h，得到溶液c，溶液c中環(huán)丙沙星與聚己內酯和明膠總質量的比為30/100；

(4)取4g的聚己內酯，加入20ml三氟乙醇溶劑中，在烘箱中靜置1h，得到聚己內酯質量濃度為0.2/ml的溶液d；

(5)向d溶液中加入4g的明膠，室溫磁力攪拌12h，得到溶液e，溶液e中聚己內酯與明膠的質量比為50/50；

(6)向溶液e中加入3.2g促成骨物質45s5生物玻璃，室溫磁力攪拌6h，得到溶液f，溶液f中生物玻璃與聚己內酯和明膠總質量的比為40/100；

(7)用溶液c進行靜電紡絲，以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉動速率為300rpm，紡絲液流動速率為2.5ml/h，電壓28kv，接收距離10cm，紡絲8h；

(8)用溶液f進行靜電紡絲，以步驟(7)中帶有纖維膜的以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉動速率為300rpm，紡絲液流動速率為2.5ml/h，電壓28kv，接收距離10cm，紡絲8h，得到電紡絲纖維膜；

(9)靜電紡絲結束后，將紡絲膜在通風櫥中室溫放置2天，包裝消毒。

實施例3

(1)取0.8g的聚己內酯，加入20ml三氟乙醇溶劑中，在烘箱中靜置1h，得到聚己內酯質量濃度為0.04g/ml的溶液a；

(2)向a溶液中加入7.2g的明膠，室溫磁力攪拌12h，得到溶液b，溶液b中聚己內酯與明膠的質量比為10/90；

(3)向溶液b中加入0.08g抗菌藥物環(huán)丙沙星，室溫磁力攪拌6h，得到溶液c，溶液c中環(huán)丙沙星與聚己內酯和明膠總質量的比為1/100；

(4)取7.2g的聚己內酯，加入20ml三氟乙醇溶劑中，在烘箱中靜置1h，得到聚己內酯質量濃度為0.36/ml的溶液d；

(5)向d溶液中加入0.8g的明膠，室溫磁力攪拌12h，得到溶液e，溶液e中聚己內酯與明膠的質量比為90/10；

(6)向溶液e中加入3.2g促成骨物質生物玻璃，室溫磁力攪拌6h，得到溶液f，溶液f中生物玻璃與聚己內酯和明膠總質量的比為40/100；

(7)用溶液c進行靜電紡絲，以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉動速率為300rpm，紡絲液流動速率為2.5ml/h，電壓28kv，接收距離10cm，紡絲8h；

(8)用溶液f進行靜電紡絲，以步驟(7)中帶有纖維膜的以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉動速率為300rpm，紡絲液流動速率為2.5ml/h，電壓28kv，接收距離10cm，紡絲8h，得到電紡絲纖維膜；

(9)靜電紡絲結束后，將紡絲膜在通風櫥中室溫放置2天，包裝消毒。

實施例4

(1)取4g的聚乳酸，加入20ml三氟乙醇溶劑中，在烘箱中靜置1h，得到聚乳酸質量濃度為0.2g/ml的溶液a；

(2)向a溶液中加入4g的殼聚糖，室溫磁力攪拌12h，得到溶液b，溶液b中聚乳酸與殼聚糖的質量比為50/50；

(3)向溶液b中加入0.08g抗菌藥物甲硝唑，室溫磁力攪拌6h，得到溶液c，溶液c中甲硝唑與聚乳酸和殼聚糖總質量的比為1/100；

(4)取7.2g的聚乳酸，加入20ml三氟乙醇溶劑中，在烘箱中靜置1h，得到聚乳酸質量濃度為0.36/ml的溶液d；

(5)向d溶液中加入0.8g的殼聚糖，室溫磁力攪拌12h，得到溶液e，溶液e中聚乳酸與殼聚糖的質量比為90/10；

(6)向溶液e中加入0.08g促成骨物質磷酸三鈣，室溫磁力攪拌6h，得到溶液f，溶液f中磷酸三鈣與聚乳酸和殼聚糖總質量的比為1/100；

(7)用溶液c進行靜電紡絲，以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉動速率為300rpm，紡絲液流動速率為2.5ml/h，電壓28kv，接收距離10cm，紡絲8h；

(8)用溶液f進行靜電紡絲，以步驟(7)中帶有纖維膜的以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉動速率為300rpm，紡絲液流動速率為2.5ml/h，電壓28kv，接收距離10cm，紡絲8h，得到電紡絲纖維膜；

(9)靜電紡絲結束后，將紡絲膜在通風櫥中室溫放置3天，包裝消毒。

實施例5

(1)取0.8g的聚乳酸，加入20ml三氟乙醇溶劑中，在烘箱中靜置1h，得到聚乳酸質量濃度為0.04g/ml的溶液a；

(2)向a溶液中加入7.2g的殼聚糖，室溫磁力攪拌12h，得到溶液b，溶液b中聚乳酸與殼聚糖的質量比為10/90；

(3)向溶液b中加入2.4g抗菌藥物甲硝唑，室溫磁力攪拌6h，得到溶液c，溶液c中甲硝唑與聚乳酸和殼聚糖總質量的比為30/100；

(4)取4g的聚乳酸，加入20ml三氟乙醇溶劑中，在烘箱中靜置1h，得到聚乳酸質量濃度為0.2/ml的溶液d；

(5)向d溶液中加入4g的殼聚糖，室溫磁力攪拌12h，得到溶液e，溶液e中聚乳酸與殼聚糖的質量比為50/50；

(6)向溶液e中加入3.2g促成骨物質磷酸三鈣，室溫磁力攪拌6h，得到溶液f，溶液f中磷酸三鈣與聚乳酸和殼聚糖總質量的比為40/100；

(7)用溶液c進行靜電紡絲，以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉動速率為300rpm，紡絲液流動速率為2.5ml/h，電壓28kv，接收距離10cm，紡絲8h；

(8)用溶液f進行靜電紡絲，以步驟(7)中帶有纖維膜的以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉動速率為300rpm，紡絲液流動速率為2.5ml/h，電壓28kv，接收距離10cm，紡絲8h，得到電紡絲纖維膜；

(9)靜電紡絲結束后，將紡絲膜在通風櫥中室溫放置3天，包裝消毒。

實施例6

(1)取0.8g的聚乳酸，加入20ml三氟乙醇溶劑中，在烘箱中靜置1h，得到聚乳酸質量濃度為0.04g/ml的溶液a；

(2)向a溶液中加入7.2g的殼聚糖，室溫磁力攪拌12h，得到溶液b，溶液b中聚乳酸與殼聚糖的質量比為10/90；

(3)向溶液b中加入0.08g抗菌藥物甲硝唑，室溫磁力攪拌6h，得到溶液c，溶液c中甲硝唑與聚乳酸和殼聚糖總質量的比為1/100；

(4)取7.2g的聚乳酸，加入20ml三氟乙醇溶劑中，在烘箱中靜置1h，得到聚乳酸質量濃度為0.36/ml的溶液d；

(5)向d溶液中加入0.8g的殼聚糖，室溫磁力攪拌12h，得到溶液e，溶液e中聚乳酸與殼聚糖的質量比為90/10；

(6)向溶液e中加入3.2g促成骨物質磷酸三鈣，室溫磁力攪拌6h，得到溶液f，溶液f中磷酸三鈣與聚乳酸和殼聚糖總質量的比為40/100；

(7)用溶液c進行靜電紡絲，以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉動速率為300rpm，紡絲液流動速率為2.5ml/h，電壓28kv，接收距離10cm，紡絲8h；

(8)用溶液f進行靜電紡絲，以步驟(7)中帶有纖維膜的以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉動速率為300rpm，紡絲液流動速率為2.5ml/h，電壓28kv，接收距離10cm，紡絲8h，得到電紡絲纖維膜；

靜電紡絲結束后，將紡絲膜在通風櫥中室溫放置3天，包裝消毒。