本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及順鉑的用途，具體涉及順鉑在治療高水平粒系骨髓來(lái)源免疫抑制細(xì)胞膀胱癌中的應(yīng)用。經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)顯示，順鉑能有效減少膀胱癌組織中髓系粒細(xì)胞來(lái)源免疫抑制細(xì)胞(granulocyte-myeloid-derivedsuppressorcell,g-mdsc)，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤殺傷活性的cd8+效應(yīng)t細(xì)胞的數(shù)量與活性，殺傷膀胱癌細(xì)胞。順鉑可明顯減弱膀胱癌癌灶中免疫抑制作用，明顯抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步可用于膀胱癌治療。

背景技術(shù)：

膀胱癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì)。目前，男性中膀胱癌是繼前列腺癌、肺癌和結(jié)、直腸癌之后，發(fā)病率排第四位的惡性腫瘤。中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2015年中國(guó)大陸新發(fā)膀胱癌8.05萬(wàn)例，死亡3.29萬(wàn)例，居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤首位。膀胱癌可分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱non-muscle-invasivebc(nmibc)和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌muscle-invasivebc(mibc)；nmibc與mibc的五年生存率為90％與60％。一旦發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，近80％的患者五年內(nèi)死亡。目前，膀胱癌治療方式主要為手術(shù)治療與化學(xué)治療，手術(shù)方式與化療藥物的革新對(duì)延長(zhǎng)膀胱癌患者生存時(shí)間效果有限，因此尋找膀胱癌治療的新靶點(diǎn)，阻止膀胱癌進(jìn)程，是膀胱癌防治工作中亟待解決的問(wèn)題。

膀胱癌的發(fā)生發(fā)展與其免疫微環(huán)境密不可分。膀胱癌細(xì)胞的侵襲與生長(zhǎng)，造成局部正常組織的大量破壞，大量促炎細(xì)胞因子和趨化因子釋放，繼而招募包括nk細(xì)胞，巨噬細(xì)胞以及t細(xì)胞浸潤(rùn)。通過(guò)與腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)分子結(jié)合，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別，繼而發(fā)揮抗腫瘤作用。除了直接的細(xì)胞毒作用外，還分泌多種效應(yīng)分子，例如ifn-γ，其對(duì)抗腫瘤免疫反應(yīng)的發(fā)生具有關(guān)鍵作用。其中，cd8+t細(xì)胞通過(guò)t細(xì)胞受體(tcellreceptor,tcr)有效識(shí)別和殺傷腫瘤，同時(shí)產(chǎn)生大量ifn-γ等效應(yīng)分子，發(fā)揮抗腫瘤作用。研究提示，特異性地刪除野生型小鼠的cd8+t細(xì)胞，腫瘤會(huì)快速生長(zhǎng)。但是，大量臨床數(shù)據(jù)顯示：膀胱癌組織處于免疫抑制環(huán)境，浸潤(rùn)的免疫效應(yīng)細(xì)胞表現(xiàn)為不同程度的免疫功能低下，甚至嚴(yán)重缺陷。其中，誘導(dǎo)免疫抑制細(xì)胞增殖、分化以及向腫瘤部位募集是膀胱癌細(xì)胞免疫逃逸的重要方式。免疫抑制細(xì)胞在癌灶中的大量蓄積，加速了膀胱癌的進(jìn)程，嚴(yán)重危害患者健康。

髓系來(lái)源免疫抑制細(xì)胞是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的免疫細(xì)胞，研究表明，多種腫瘤患者腫瘤組織內(nèi)出現(xiàn)mdsc的蓄積，這群細(xì)胞腫瘤的免疫逃逸機(jī)制中發(fā)揮重要作用。mdsc主要包括單核細(xì)胞來(lái)源的mdsc(m-mdsc)與粒細(xì)胞來(lái)源的mdsc(g-mdsc)。mdsc可以通過(guò)產(chǎn)生精氨酸和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inos)以及產(chǎn)生大量活性氧(ros)等途徑來(lái)發(fā)揮免疫抑制作用，抑制效應(yīng)t細(xì)胞的功能，其中，g-mdsc作用尤為明顯。近年來(lái)關(guān)于腫瘤免疫和免疫逃逸的研究發(fā)現(xiàn)，免疫逃逸可能是影響膀胱癌治療療效的重要原因。由于mdsc在機(jī)體免疫調(diào)控中的負(fù)向作用，靶向mdsc進(jìn)行腫瘤免疫治療是膀胱癌治療的新策略。

順鉑自上世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn)可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)后，就廣泛應(yīng)用于癌癥治療，在化療藥物中占有重要位置，是目前膀胱癌一線化療方案中的主要藥物。然而，順鉑的副作用較強(qiáng)，主要表現(xiàn)在：1)惡心、嘔吐等胃腸道反應(yīng)。2)以腎小管為主的腎毒性作用。3)以聽(tīng)神經(jīng)損害為主的神經(jīng)毒性作用。4)白細(xì)胞和/或血小板下降等骨髓抑制作用。因此，根據(jù)患者的特點(diǎn)選擇合適的藥物是十分必要的。

基于現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究順鉑在高水平粒系骨髓來(lái)源免疫抑制細(xì)胞膀胱癌治療膀胱癌中的作用，進(jìn)一步評(píng)估順鉑在治療免疫功能異常所致膀胱癌進(jìn)展中的潛在價(jià)值，提供順鉑用于制備高水平粒系骨髓來(lái)源免疫抑制細(xì)胞膀胱癌治療的用途和方法，為膀胱癌的臨床治療提供新方法和新思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供順鉑的新用途。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用于非治療目的降低膀胱癌內(nèi)g-mdsc水平的方法。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供檢測(cè)g-mdsc含量的試劑的用途。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種檢測(cè)受試者健康狀態(tài)、監(jiān)測(cè)膀胱癌進(jìn)程或評(píng)估膀胱癌病因的方法

本發(fā)明的第五個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種治療高水平g-mdsc膀胱癌的藥物組合。

本發(fā)明的第六個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供如上所述藥物組合的用途。

為實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

順鉑在制備治療高水平g-mdsc膀胱癌的藥物中的用途。

進(jìn)一步，所述藥物殺傷膀胱癌組織中的g-mdsc，維持cd+8t細(xì)胞的腫瘤殺傷作用。

進(jìn)一步，所述藥物抑制因g-mdsc高水平而引起的膀胱癌進(jìn)程。

為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

一種用于非治療目的降低膀胱癌內(nèi)g-mdsc水平的方法，給對(duì)象施用順鉑。

為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

檢測(cè)g-mdsc含量的試劑在制備診斷膀胱癌、膀胱癌進(jìn)程或膀胱癌病因的試劑盒中的應(yīng)用

進(jìn)一步，所述診斷包括如下步驟：

(1)檢測(cè)膀胱癌癌灶及癌旁g-mdsc含量；

(2)將膀胱癌癌灶的g-mdsc含量與癌旁g-mdsc含量進(jìn)行對(duì)比，比較膀胱癌癌灶的g-mdsc含量與癌旁g-mdsc含量的差異，根據(jù)含量的差異診斷膀胱癌、評(píng)估膀胱癌進(jìn)程或評(píng)估膀胱癌病因。

為實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

一種檢測(cè)受試者健康狀態(tài)、監(jiān)測(cè)膀胱癌進(jìn)程或評(píng)估膀胱癌病因的方法，其包括如下步驟：

(1)檢測(cè)膀胱癌癌灶及癌旁g-mdsc含量；

(2)將膀胱癌癌灶的g-mdsc含量與癌旁g-mdsc含量進(jìn)行對(duì)比，比較膀胱癌癌灶的g-mdsc含量與癌旁g-mdsc含量的差異，根據(jù)含量的差異判斷受試者健康狀態(tài)、監(jiān)測(cè)膀胱癌進(jìn)程或評(píng)估膀胱癌病因。

為實(shí)現(xiàn)上述第五個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

一種治療高水平g-mdsc膀胱癌的藥物組合，所述藥物組合物包括順鉑及抗gr-1抗體。

為實(shí)現(xiàn)上述第六個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

如上所述藥物組合在制備具有高水平g-mdsc膀胱癌的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述藥物減少膀胱癌癌灶中g(shù)-mdsc的含量，促進(jìn)cd8+t細(xì)胞的腫瘤殺傷功能。

本發(fā)明中通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究順鉑對(duì)g-mdsc以及cd8+t細(xì)胞的作用，進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)評(píng)估過(guò)順鉑在治療膀胱癌的價(jià)值；提供了一種順鉑用于制備高水平粒系骨髓來(lái)源免疫抑制細(xì)胞膀胱癌免疫治療藥物的用途。結(jié)果顯示：1)膀胱癌患者外周血中cd8+t細(xì)胞較腎囊腫患者外周血中cd8+t細(xì)胞增多，但是膀胱癌癌灶中較膀胱癌周邊正常組織cd8+t細(xì)胞明顯減少，提示，膀胱癌癌灶中cd8+t細(xì)胞免疫作用受限；2)相對(duì)于正常膀胱組織，膀胱癌癌灶中g(shù)-mdsc明顯增多，該趨勢(shì)與cd8+t細(xì)胞減少有強(qiáng)相關(guān)性；3)順鉑聯(lián)合抗g-mdsc抗體耗竭膀胱癌癌灶中g(shù)-mdsc水平導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞增殖能力明顯減弱，膀胱癌進(jìn)程減緩。提示該聯(lián)合用藥可進(jìn)一步用于膀胱癌的免疫治療治療。

具體而言，本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)順鉑減少膀胱癌腫瘤微環(huán)境中g(shù)-mdsc，進(jìn)而發(fā)揮抑制g-mdsc腫瘤中異常增加引起的膀胱癌癌灶中免疫抑制作用，可用于制備治療高水平粒系骨髓來(lái)源免疫抑制細(xì)胞膀胱癌的藥物。

本發(fā)明收集膀胱癌患者的癌灶組織和癌旁對(duì)照組織，結(jié)果顯示膀胱癌患者癌灶組織較癌旁對(duì)照組織g-mdsc明顯增加，但是cd8+t細(xì)胞，二者之間存在明顯的負(fù)相關(guān)性(如圖1所示)。隨后通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)順鉑能抑制膀胱癌細(xì)胞t24增殖，并且能促進(jìn)其凋亡(如圖2所示)。除此之外，順鉑處理外周血免疫細(xì)胞后，g-mdsc與m-mdsc均明顯減少，并且mdsc分化的下游細(xì)胞，dc細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞均明顯降低(如圖3所示)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)cd8+t細(xì)胞能促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡，而g-mdsc與cd8+t細(xì)胞按照1：1比例共培養(yǎng)后能明顯抑制cd8+t細(xì)胞的促凋亡能力。順鉑能通殺傷g-mdsc間接恢復(fù)cd8+t細(xì)胞的腫瘤殺傷能力(如圖4所示)?？筭-mdsc抗體能有效減少腫瘤細(xì)胞中的g-mdsc。順鉑單獨(dú)運(yùn)用或者順鉑與抗g-mdsc抗體聯(lián)合應(yīng)用使g-mdsc進(jìn)一步降低，同時(shí)cd8+t細(xì)胞相應(yīng)的增加(如圖5所示)。小鼠膀胱癌細(xì)胞系mbt-2于c57小鼠體外構(gòu)建膀胱癌模型，順鉑單獨(dú)運(yùn)用或者順鉑與抗g-mdsc抗體聯(lián)合應(yīng)用能明顯減緩膀胱癌的生長(zhǎng)，腫瘤重量明顯降低。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

1、本發(fā)明提供了順鉑用于高水平粒系骨髓來(lái)源免疫抑制細(xì)胞膀胱癌治療的用途和方法；經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，順鉑用藥可明顯減少膀胱癌癌灶中g(shù)-mdsc的比例，進(jìn)而促進(jìn)了cd8+t細(xì)胞的腫瘤殺傷功能，表明順鉑可用于高水平粒系骨髓來(lái)源免疫抑制細(xì)胞膀胱癌的化學(xué)治療。

2、與單獨(dú)使用順鉑相比，本發(fā)明提供的抗gr-1抗體可以協(xié)同增強(qiáng)順鉑對(duì)膀胱癌生長(zhǎng)的抑制作用。

附圖說(shuō)明

附圖1是g-mdsc細(xì)胞與cd8+t細(xì)胞在膀胱癌癌灶與癌旁對(duì)照組織中的水平。

其中，normal：健康人外周血cd8+t細(xì)胞比例，

cancer：膀胱癌患者cd8+t細(xì)胞比例，

adjacentbladdertissues：癌旁膀胱組織，

pmn：多形核中性粒細(xì)胞，

g-mdsc：粒系骨髓來(lái)源的免疫抑制細(xì)胞，

*p<0.05,**p<0.01。

附圖2是順鉑抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡。

其中，ctrl：對(duì)照組，

cisplatin：順鉑處理組，

pi：propidiumiodide，溴化丙啶，

*p<0.05,and***p<0.001。

附圖3是順鉑殺傷mdsc。

其中，g-mdsc:粒系骨髓來(lái)源免疫抑制細(xì)胞，

m-mdsc：?jiǎn)魏讼倒撬鑱?lái)源免疫抑制細(xì)胞，

dendriticcell：樹(shù)突細(xì)胞，

macrophage:巨噬細(xì)胞，

granulocyte：粒細(xì)胞

wbc:whitebloodcell，白細(xì)胞，

*p<0.05,**p<0.01和***p<0.001。

附圖4是順鉑減弱g-mdsc對(duì)cd8+t細(xì)胞的抑制作用。

其中，tcells+g-mdsc:與g-mdsc細(xì)胞共培養(yǎng)后分離的cd8+t細(xì)胞，

tcells+cddptreatedg-mdsc:與順鉑處理的g-mdsc細(xì)胞共培養(yǎng)后分離的cd8+t細(xì)胞，

*p<0.05and**p<0.01；ns:無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

附圖5是順鉑和/或抗gr-1抗體有效減少膀胱癌癌灶中g(shù)-mdsc。

其中，cisplatin+anti-gr-1:順鉑+抗gr-1抗體，

*p<0.05and**p<0.01；ns:無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

附圖6是順鉑和/或抗gr-1抗體明顯抑制膀胱癌生長(zhǎng)，其中，*p<0.05。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。

實(shí)施例1分析膀胱癌癌組織粒系骨髓來(lái)源的免疫抑制細(xì)胞水平

1)膀胱癌癌灶組織中g(shù)-mdsc水平增加

首先收集相關(guān)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者外周血中cd8+t細(xì)胞較健康人增加(如圖1a所示)；隨后原代分離獲得膀胱癌癌灶組織和癌旁膀胱組織中的免疫細(xì)胞，利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)(流式抗體均來(lái)自biolegend公司)發(fā)現(xiàn)癌灶組織中cd3+cd8+t細(xì)胞較癌旁膀胱組織明顯減少(如圖1b所示)，且cd11b+cd33+cd15+cd14-g-mdsc較癌旁膀胱組織明顯增加(如圖1c，1d所示)。膀胱癌癌灶組織中g(shù)-mdsc比例與cd8+t細(xì)胞呈明顯負(fù)相關(guān)性(如圖1e所示)。說(shuō)明g-mdsc可能是膀胱癌癌灶中cd8+t細(xì)胞減少的重要原因。

實(shí)施例2體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)順鉑殺傷膀胱癌細(xì)胞和g-mdcs的功能

1)順鉑抑制膀胱癌細(xì)胞t24增殖并促進(jìn)凋亡

順鉑為含有鉑的化學(xué)物質(zhì)(如圖2a所示)。濃度梯度0，0.1，1，10μm順鉑處理t24細(xì)胞24h后應(yīng)用cellcountingkit-8試劑盒活檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量并且與對(duì)照組進(jìn)行比較。10μm順鉑處理t24細(xì)胞0，12，24，48，72小時(shí)后用cellcountingkit-8試劑盒檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)量(t24細(xì)胞來(lái)自上海南方模式動(dòng)物中心，cellcountingkit-8試劑盒來(lái)自yeasen公司)。發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，順鉑濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)均能有效抑制膀胱癌細(xì)胞t24的增殖(如圖2b，2c所示)。hochest染色法和流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)10μm順鉑處理48小時(shí)后t24細(xì)胞的凋亡情況(hochest溶液來(lái)自sigma)，發(fā)現(xiàn)順鉑明顯促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的凋亡(如圖2d、2e所示)。

2)順鉑殺傷骨髓來(lái)源的免疫抑制細(xì)胞

10μm順鉑處理外周血分離出的pbmc和pmn細(xì)胞，48小時(shí)后流式細(xì)胞技術(shù)分析pbmc中cd11b+cd33+cd14+cd15-m-mdsc和cd11b+cd33+cd14-cd15+g-mdsc的比例(流式抗體均來(lái)自biolegend)，發(fā)現(xiàn)m-mdsc和g-mdsc均明顯減少(如圖3a所示)。進(jìn)一步流式分析發(fā)現(xiàn)，m-mdsc下游分化的cd45+cd11b+cd11c+cd1c+骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞以及cd45+cd14+cd80+巨噬細(xì)胞與g-mdsc下游分化的cd11b+cd33-cd15+粒細(xì)胞明顯減少(如圖3b，3c，3d所示)。說(shuō)明順鉑能有效殺傷mdsc，并且導(dǎo)致其下游細(xì)胞相應(yīng)減少。

實(shí)施例3體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)順鉑能通過(guò)殺傷g-mdsc間接增強(qiáng)cd8+t細(xì)胞的免疫功能

首先我們用10μm順鉑處理外周血分離出的cd8+t細(xì)胞(cd8+t細(xì)胞分選磁珠購(gòu)自美天旎)，48小時(shí)后應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)分析cd8+t細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)經(jīng)順鉑處理后的cd8+t細(xì)胞并無(wú)明顯改變(如圖4a所示)。磁珠分選法從pmn中分離出cd33+細(xì)胞加入細(xì)胞因子il-6和gm-csf訓(xùn)導(dǎo)7天后加入10μm順鉑處理48小時(shí)，分別按照g-mdsc：cd8+t細(xì)胞為1:100、1:10、1:1共培養(yǎng)48h后，流式細(xì)胞技術(shù)分析cfse標(biāo)記的cd8+t細(xì)胞的增殖情況(cfse試劑來(lái)自biolegend)，發(fā)現(xiàn)g-mdsc：cd8+t細(xì)胞為1:1時(shí)g-mdsc對(duì)cd8+t細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，同時(shí)，順鉑能通過(guò)減少g-mdsc而間接促進(jìn)cd8+t細(xì)胞的增殖(如圖4b所示)。經(jīng)順鉑處理或者未處理的g-mdsc與cd8+t細(xì)胞共培養(yǎng)后分離出cd8+t細(xì)胞并且與t24細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)，hochest染色法和流式細(xì)胞技術(shù)分析t24細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)順鉑能通過(guò)殺傷g-mdsc間接促進(jìn)cd8+t細(xì)胞的腫瘤殺傷作用(如圖4c、4d所示)。

實(shí)施例4體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)順鉑和/或抗gr-1抗體能通過(guò)殺傷g-mdsc抑制裸鼠膀胱癌移植瘤的生長(zhǎng)

1)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)順鉑和/或抗gr-1抗體能有效殺傷膀胱癌癌灶中g(shù)-mdsc

首先我們驗(yàn)證了抗gr-1抗體對(duì)g-mdsc的殺傷作用，mbt-2小鼠膀胱癌細(xì)胞系(107/只)于c57小鼠皮下注射成瘤1周后(mbt-2小鼠膀胱癌細(xì)胞系來(lái)自南方模式動(dòng)物中心，c57小鼠來(lái)自斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，腹腔注射抗gr-1抗體(200mg/只)(抗gr-1抗體來(lái)自abcam)，對(duì)照組注射生理鹽水，每48小時(shí)注射一次?？筭r-1抗體注射2周后檢測(cè)小鼠膀胱癌皮下移植瘤中g(shù)-mdsc含量，流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)抗gr-1抗體能有效去除腫瘤中g(shù)-mdsc(如圖5a所示)。成瘤后一周，順鉑(7.5mg/kg)每3天腹腔注射一次，對(duì)照組注射生理鹽水，2周后流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)膀胱癌中g(shù)-mdsc比例明顯降低，cd8+t細(xì)胞比例明顯增加?？筭r-1抗體具有協(xié)同作用(如圖5b、5c所示)。

2)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)順鉑和/或抗gr-1抗體明顯抑制膀胱癌的生長(zhǎng)

將成瘤小鼠隨機(jī)分為3組，對(duì)照組注射生理鹽水，順鉑治療組成瘤后1周每3天腹腔注射順鉑(7.5mg/kg)，順鉑和抗gr-1抗體共同作用組除了注射順鉑外每48小時(shí)注射一次抗gr-1抗體(200mg/只)。成瘤后2周每3天測(cè)量一次腫瘤體積，計(jì)算公式為：體積＝(長(zhǎng)*寬²)/2。我們發(fā)現(xiàn)，順鉑處理組腫瘤的生長(zhǎng)、外觀、重量均明顯受限，抗gr-1抗體能增強(qiáng)這種作用(如圖6a、6b、6c所示)。上述結(jié)果說(shuō)明順鉑能有效抑制膀胱癌生長(zhǎng)，而抗gr-1抗體與順鉑發(fā)揮協(xié)同作用顯著增加抑癌效果。

3)兩藥聯(lián)合作用評(píng)價(jià)

兩藥協(xié)同作用判斷標(biāo)準(zhǔn)：采用國(guó)內(nèi)金(正均)氏公式評(píng)價(jià)順鉑和抗gr-1抗體的聯(lián)合作用是否具有協(xié)同性。公式為：q值＝e(a+b)/(ea+eb-ea×eb)。ea表示a藥單獨(dú)用藥的效應(yīng)，eb為b藥單獨(dú)用藥的效應(yīng)，e(a+b)表示藥物a和藥物b聯(lián)合用藥的效應(yīng)。通過(guò)判讀q值來(lái)評(píng)價(jià)兩個(gè)藥物在聯(lián)合使用后的治療效果是否優(yōu)于單獨(dú)給藥，如果q值介于0.85-1.15為單純相加，介于1.15-2.0為增強(qiáng)，大于2.0為明顯增強(qiáng)，介于0.85-0.55為拮抗，小于0.55為明顯拮抗。金氏公式計(jì)算得到：順鉑與抗gr-1抗體聯(lián)合使用，q＝2.06＞2.0，聯(lián)合作用為明顯增強(qiáng)，由此可以證實(shí)，抗gr-1抗體可以協(xié)同增強(qiáng)順鉑對(duì)膀胱癌生長(zhǎng)的抑制作用。

本發(fā)明經(jīng)體外和體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，順鉑能殺傷膀胱癌組織中的g-mdsc，間接維持cd8+t細(xì)胞的殺傷活性。應(yīng)用順鉑能通過(guò)限制腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制作用進(jìn)一步限制膀胱癌的生長(zhǎng)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。