本發(fā)明屬于藥劑領(lǐng)域，涉及一種脂質(zhì)體及其制備方法和應用，具體地，此脂質(zhì)體可以包載絕大部分結(jié)構(gòu)中含酚羥基的難溶性藥物。

背景技術(shù)：

眾所周知，藥物的水難溶性始終阻礙著藥物的有效傳遞。研究數(shù)據(jù)表明，高達40%的經(jīng)過高通量篩選出的、具有潛在應用前景的備選化合物，由于難溶于水，阻礙了其開發(fā)和應用。難溶性藥物在疾病治療應用中存在著諸多弊端，如：水溶性差會阻礙藥物的吸收，導致藥物生物利用度降低，尤其是口服藥物；難溶性藥物通過靜脈途徑給藥可能會發(fā)生血管阻塞，在局部組織發(fā)生沉積，引起多種疾病。然而，疏水性卻是許多活性物質(zhì)所固有的特性，因為其親脂性有利于藥物穿透細胞膜，使更多的藥物到達細胞內(nèi)部，在特定靶點發(fā)揮治療作用。因此，提高難溶性藥物的溶解度同時保留藥物的治療活性是當今藥劑學領(lǐng)域的一個難點和熱點。

目前，提高難溶性藥物溶解度的方法主要有：

一是加入酸或堿，調(diào)節(jié)藥物溶液的pH，使藥物形成可溶性的鹽類。專利文獻CN201010537215.9提供了一種加入有機胺增加藥物溶解度的方法，該方法簡單易行，適合工業(yè)化生產(chǎn)。但是形成鹽類之后，藥物的治療活性可能會受到影響。而且，成鹽的藥物進入人體后，由于溫度、pH、無機鹽、血漿蛋白等體內(nèi)環(huán)境因素，可能會使藥物的溶解度重新降低，有嚴重的安全隱患。

二是將難溶性藥物制成前體藥物。此方法雖然可以顯著提高藥物的穩(wěn)定性，使其進入人體后不易發(fā)生變化，但同時會破壞藥物原有的結(jié)構(gòu)，可能會使其藥物活性發(fā)生改變。

三是將難溶性藥物制備成包合物、固體分散體、納米粒、脂質(zhì)體或乳劑等新型制劑。此方法的優(yōu)點是在增加藥物溶解度的同時，完整地保留了藥物的結(jié)構(gòu)，不會對藥物活性產(chǎn)生影響。而且某些劑型存在緩釋效果，提高了療效并降低了毒副作用。專利文獻CN201310165276.0提供了一種難溶性藥物固體分散體及其制備方法，該發(fā)明將難溶性的染料木素等多酚羥基類藥物通過熔融法與高分子材料制備成固體分散體，顯著提高了藥物的溶出速率和溶解度。專利文獻CN201010023013.2提供了一種水難溶性藥物微膠囊的制備方法，該微膠囊具有增加藥物溶解度、控制藥物釋放速率等優(yōu)點。專利文獻CN201510870096.1提供了一種包載難溶性藥物的納米骨架系統(tǒng)及制備方法，此納米骨架系統(tǒng)具有提高藥物溶解度、溶出度和生物利用度等優(yōu)點。

脂質(zhì)體是一種新型藥物制劑，主要成分是磷脂，可以作為難溶性藥物的載體。磷脂是人體內(nèi)源性成分，有良好的生物相容性和安全性。經(jīng)靜脈給藥后，脂質(zhì)體被體內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，使藥物主要分布在肺、肝、脾和骨髓等器官。粒徑不同，主要的分布器官也不一樣。此外，如果機體中長有腫瘤，脂質(zhì)體也會通過EPR效應滯留于腫瘤部位，從而實現(xiàn)被動靶向。專利文獻CN200610021277.8提供了一種脂質(zhì)體的制備方法和應用，此脂質(zhì)體可以將難溶性藥物和厚樸酚包載其中，用于腫瘤靶向治療。然而，目前絕大多數(shù)脂質(zhì)體都是以磷脂和膽固醇為基本材料，這種脂質(zhì)體能夠包載的難溶性藥物的種類和數(shù)量都非常有限，而且載藥脂質(zhì)體的穩(wěn)定性欠佳，往往幾天之內(nèi)就會有藥物析出，極大地限制了其應用。

本發(fā)明旨在設(shè)計一種新型脂質(zhì)體，不以傳統(tǒng)的磷脂+膽固醇的組合為材料，此脂質(zhì)體可以將大多數(shù)或一大類難溶性藥物包載其中，增加藥物溶解度，同時具有優(yōu)秀的穩(wěn)定性，可以在一周之內(nèi)或更長時間內(nèi)無藥物析出且無明顯的粒徑變化。經(jīng)過一系列的篩選，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)以磷脂和15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯（商品名：Kolliphor HS15）為材料制備的脂質(zhì)體，可以滿足上述需求。此外，發(fā)明人在研究過程中進一步發(fā)現(xiàn)，此新型脂質(zhì)體可以將兩種難溶性藥物同時包載其中，且穩(wěn)定性極佳。眾所周知，聯(lián)合用藥是目前藥劑研究領(lǐng)域的一大熱門，有其特有的優(yōu)勢：一方面，聯(lián)合用藥可以讓多種藥物同時作用于同一病患部位，提高藥物靶向性；另一方面，利用藥物的互補特性，可以發(fā)揮協(xié)同或相加作用，可達到增效減毒的目的，從而更好地發(fā)揮藥效。此發(fā)現(xiàn)極大地拓展了本發(fā)明中新型脂質(zhì)體的應用，研究人員可以自由選擇用其包載一種藥物或同時包載兩種藥物用于聯(lián)合用藥治療。此外，該脂質(zhì)體也具有一定緩釋效果，延長藥物作用時間，降低毒副作用。而且，通過改變投料比可以得到不同粒徑的脂質(zhì)體，使其能夠分布到不同的器官。按照不同的病變器官選擇適宜粒徑的脂質(zhì)體，包載相應的治療藥物，達到靶向精準治療的目的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一，提供一種新型脂質(zhì)體，此脂質(zhì)體不以普通脂質(zhì)體常用的磷脂+膽固醇的組合為材料。

本發(fā)明的目的之一，提供一種可以包載大多數(shù)或一大類難溶性藥物的脂質(zhì)體，增加難溶性藥物的溶解度，拓展脂質(zhì)體的應用。

本發(fā)明的目的之一，提供一種可以同時將兩種難溶性藥物包載其中的脂質(zhì)體，能夠用作聯(lián)合用藥的載體。

本發(fā)明的目的之一，提供一種具有緩釋效果的脂質(zhì)體。

本發(fā)明的目的之一，提供一種具有被動靶向效果的脂質(zhì)體。改變處方可以得到不同粒徑的脂質(zhì)體，被動靶向到不同組織器官。

本發(fā)明人通過研究難溶性藥物的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，含酚羥基結(jié)構(gòu)的難溶性藥物由于酚羥基的負電性質(zhì)，可以與磷脂中帶正電性的季胺氮產(chǎn)生作用力，使藥物與磷脂形成復合物。此外，酚羥基結(jié)構(gòu)也可以與磷脂的親水性頭部形成氫鍵，進一步增加了用磷脂包載含酚羥基結(jié)構(gòu)的難溶性藥物的可能性。但是單獨使用磷脂無法穩(wěn)定地包載難溶性藥物。在進行了多種表面活性劑的篩選之后，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯與磷脂合用制備的脂質(zhì)體，能將大多數(shù)含酚羥基結(jié)構(gòu)的難溶性藥物包載其中，且穩(wěn)定性極佳。因而創(chuàng)造性地發(fā)明了這一載藥能力更強的新型脂質(zhì)體，此脂質(zhì)體具有載藥種類多、穩(wěn)定性好及應用廣等優(yōu)勢。

本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，此脂質(zhì)體可以同時包載兩種或兩種以上含酚羥基結(jié)構(gòu)的難溶性藥物，具有載藥能力強、可用于聯(lián)合給藥等優(yōu)勢。

本發(fā)明提供了一種以磷脂和15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯為材料的脂質(zhì)體；磷脂和15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯質(zhì)量比優(yōu)選為20:1~1:20，15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯比例越大，脂質(zhì)體粒徑越小。單獨使用磷脂或15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯無法將藥物穩(wěn)定地包載到其中。

所述的脂質(zhì)體，其粒徑優(yōu)選為40nm~200nm。

所述的脂質(zhì)體，其載藥量為0.1%~20%，優(yōu)選為2%~10%。

本發(fā)明的目的之一，提供上述脂質(zhì)體的應用。此脂質(zhì)體不但可以用于包載含酚羥基結(jié)構(gòu)的難溶性藥物，還可以用于聯(lián)合用藥、藥物緩釋、腫瘤等組織的被動靶向治療等。

本發(fā)明的目的之一，提供上述脂質(zhì)體的制備方法。

作為具體的實施方案之一，本發(fā)明的脂質(zhì)體的制備方法如下：

（1）將磷脂、15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和藥物按照一定質(zhì)量比例混合溶于有機溶劑，置于圓底燒瓶中；

（2）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加水水化，探頭超聲或高壓均質(zhì)，即得。

優(yōu)選地，所述水包括去離子水、注射用水、生理鹽水和5%葡萄糖溶液等。

步驟（1）中的磷脂選自商業(yè)來源不同規(guī)格的天然大豆磷脂、天然蛋黃磷脂、氫化磷脂以及合成磷脂，可以選自德國Lipoid公司磷脂S45、S75、S100、SPC、E80、EPCS、EPG、SPC-3、DSPE、DPPA、DSPA、DMPC等，日本丘比株式會社磷脂PC98-T、

PL-100M、HSPC、PGE、PGSH等，韓國斗山公司磷脂DS-PL95E等，優(yōu)選磷脂E80、S100、PC98-T、EPCS等常用市售磷脂。

步驟（1）中的有機溶劑優(yōu)選為乙醇、甲醇、二氯甲烷、氯仿、丙酮等及其混合溶劑。

步驟（1）中磷脂和15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯質(zhì)量比優(yōu)選為20:1~1:20。

步驟（1）中的載藥量優(yōu)選為2%~10%。適用于本發(fā)明的含酚羥基的難溶性藥物包括但不限于如下：

抗腫瘤藥物，包括但不限于，姜黃素及其衍生物、白藜蘆醇、和厚樸酚、替尼泊苷、替莫泊芬、柔紅霉素、去甲柔紅霉素、二乙氧二酰氧柔紅霉素、佐柔比星、伊達比星、阿柔比星、氨柔比星、吡柔比星、流柔比星、美多比星、美諾立爾、奈莫柔比星、羅多比星、地托比星、依索比星、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、諾拉霉素、司替霉素、米托蒽醌、吡咯蒽醌、依托泊苷、蘭瑞肽、伐普肽、依多曲肽、橄欖霉素、安曲霉素、羥基喜樹堿、考布他丁A-4等。

其他藥物，包括但不限于，左旋多巴、多巴酚丁胺、水飛薊賓、羥基香豆素、門冬托星、伐普肽、氯喹那多、氯胺羥喹、氯碘羥喹、雙碘喹啉、替布喹、甲羥喹、甲溴羥喹、異煙腙、曲格列酮、羥布宗、對乙酰氨基酚、沙丁胺醇等。

優(yōu)選和厚樸酚、姜黃素、水飛薊賓、白藜蘆醇、吡柔比星或替尼泊苷等。

可以同時包載兩種藥物的組合，包括但不限于，姜黃素及其衍生物+和厚樸酚，白藜蘆醇+和厚樸酚，替尼泊苷+和厚樸酚，柔紅霉素+和厚樸酚，阿霉素+和厚樸酚，羥基喜樹堿+和厚樸酚，水飛薊賓+和厚樸酚，姜黃素及其衍生物+白藜蘆醇，替尼泊苷+水飛薊賓，白藜蘆醇+阿霉素，水飛薊賓+白藜蘆醇等。

優(yōu)選以下組合：和厚樸酚+替尼泊苷，姜黃素+白藜蘆醇，阿霉素+白藜蘆醇，和厚樸酚+白藜蘆醇，和厚樸酚+姜黃素等。

有益效果

（1）本發(fā)明的脂質(zhì)體，載藥量大，穩(wěn)定性好，有很好的安全性和生物相容性。

（2）本發(fā)明的脂質(zhì)體，粒徑多樣，可以通過控制投料比例得到粒徑40nm~200nm的脂質(zhì)體，滿足不同的靶向需求。

（3）本發(fā)明的脂質(zhì)體，可以將含酚羥基結(jié)構(gòu)的這一大類難溶性藥物包載其中，載藥種類多，應用范圍廣。

（4）本發(fā)明的脂質(zhì)體，可以同時將兩種含酚羥基結(jié)構(gòu)的難溶性藥物包載其中，載藥能力強，適用于聯(lián)合給藥。

（5）本發(fā)明的脂質(zhì)體具有被動靶向性。不同粒徑的脂質(zhì)體可以選擇性地被動靶向到骨髓、肝臟、脾臟、腫瘤和肺等器官。

（6）本發(fā)明的脂質(zhì)體具有一定的緩釋效果。

（7）本發(fā)明脂質(zhì)體的制備工藝簡單、易控，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中：

圖1表示實施例1中脂質(zhì)體的透射電鏡圖（放大倍數(shù)為8萬倍）。

圖2表示實施例1中脂質(zhì)體的體外釋放實驗結(jié)果。

圖3表示DiD標記脂質(zhì)體的腫瘤細胞攝取實驗結(jié)果。

圖4表示DiD標記脂質(zhì)體的體內(nèi)分布結(jié)果。

圖5表示本發(fā)明脂質(zhì)體的安全性評價結(jié)果。

圖6表示本發(fā)明脂質(zhì)體用于聯(lián)合用藥的藥效結(jié)果。

圖7表示本發(fā)明脂質(zhì)體與常用脂質(zhì)體的穩(wěn)定性對比結(jié)果。

圖8表示本發(fā)明脂質(zhì)體與常用脂質(zhì)體的體內(nèi)藥代動力學對比結(jié)果。

具體實施方式

以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，但絕不是對本發(fā)明范圍的限制。下面參照實施例進一步詳細闡述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解，本發(fā)明并不限于這些實施例以及使用的制備方法。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述可以對本發(fā)明進行等同替換、組合、改良或修飾，但這些都將包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

實施例1

將40mg磷脂E80、25mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和6mg和厚樸酚溶于乙醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，探頭超聲即得和厚樸酚脂質(zhì)體，粒徑84nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實施例2

將100mg磷脂S100、5mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和3mg姜黃素溶于二氯甲烷置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，高壓均質(zhì)即得姜黃素脂質(zhì)體，粒徑200nm，靜脈注射緩釋用于炎癥治療。

實施例3

將5mg磷脂SPC、100mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和2mg水飛薊賓溶于丙酮置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，探頭超聲即得水飛薊賓脂質(zhì)體，粒徑40nm，靜脈注射用于肝纖維化治療。

實施例4

將50mg磷脂E80、15mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和3mg白藜蘆醇溶于乙醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，高壓均質(zhì)即得白藜蘆醇脂質(zhì)體，粒徑85nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實施例5

將60mg磷脂S45、60mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和3mg吡柔比星溶于氯仿置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，探頭超聲即得吡柔比星脂質(zhì)體，粒徑68nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實施例6

將40mg磷脂S75、25mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和2mg替尼泊苷溶于甲醇和丙酮的混合溶劑置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，探頭超聲即得替尼泊苷脂質(zhì)體，粒徑78nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實施例7

將20mg磷脂E80、40mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和3mg白藜蘆醇溶于二氯甲烷置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，高壓均質(zhì)即得白藜蘆醇脂質(zhì)體，粒徑65nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實施例8

將80mg磷脂S100、10mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和6mg姜黃素溶于甲醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，探頭超聲即得姜黃素脂質(zhì)體，粒徑110nm，靜脈注射用于腫瘤靶向或炎癥治療。

實施例9

將50mg磷脂EPCS、10mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和7mg和厚樸酚溶于乙醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，高壓均質(zhì)即得和厚樸酚脂質(zhì)體，粒徑86nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實施例10

將10mg磷脂PC98-T、100mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和4mg水飛薊賓溶于乙醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，探頭超聲即得水飛薊賓脂質(zhì)體，粒徑50nm，靜脈注射用于肝纖維化治療。

實施例11

將15mg磷脂E80、60mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和3mg吡柔比星溶于氯仿置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，探頭超聲即得吡柔比星脂質(zhì)體，粒徑60nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實施例12

將70mg磷脂EPG、7mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和2mg替尼泊苷溶于甲醇和丙酮的混合溶劑置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，高壓均質(zhì)即得替尼泊苷脂質(zhì)體，粒徑78nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實施例13

將4mg磷脂E80、48mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和5mg姜黃素溶于甲醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，探頭超聲即得姜黃素脂質(zhì)體，粒徑48nm，靜脈注射用于腫瘤靶向或炎癥治療。

實施例14

將15mg磷脂PL-100M、75mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和4mg和厚樸酚溶于丙酮置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，高壓均質(zhì)即得和厚樸酚脂質(zhì)體，粒徑57nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實施例15

將75mg磷脂E80、5mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和4mg白藜蘆醇溶于乙醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，探頭超聲即得白藜蘆醇脂質(zhì)體，粒徑150nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實施例16

將60mg磷脂S100、10mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和7mg水飛薊賓溶于二氯甲烷置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，高壓均質(zhì)即得水飛薊賓脂質(zhì)體，粒徑90nm，靜脈注射用于肝纖維化治療。

實施例17

將6mg磷脂E80、90mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和3mg吡柔比星溶于氯仿置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，探頭超聲即得吡柔比星脂質(zhì)體，粒徑45nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實施例18

將12mg磷脂EPCS、96mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和4mg替尼泊苷溶于甲醇和丙酮的混合溶劑置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，高壓均質(zhì)即得替尼泊苷脂質(zhì)體，粒徑55nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實施例19

將72mg磷脂E80、6mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和5mg白藜蘆醇溶于甲醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，探頭超聲即得白藜蘆醇脂質(zhì)體，粒徑130nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實施例20

將90mg磷脂S100、5mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和4mg和厚樸酚溶于丙酮置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，高壓均質(zhì)即得和厚樸酚脂質(zhì)體，粒徑180nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實施例21

將40mg磷脂E80、25mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯、3mg和厚樸酚和3mg替尼泊苷溶于甲醇和丙酮的混合溶劑置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，探頭超聲即得和厚樸酚-替尼泊苷共載藥脂質(zhì)體，粒徑90nm，靜脈注射用于腫瘤靶向協(xié)同給藥治療。

實施例22

將50mg磷脂S100、15mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯、4mg姜黃素和4mg白藜蘆醇溶于乙醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，高壓均質(zhì)即得姜黃素-白藜蘆醇共載藥脂質(zhì)體，粒徑100nm，靜脈注射用于腫瘤靶向協(xié)同給藥治療。

實施例23

將60mg磷脂EPCS、20mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯、4mg阿霉素和3mg白藜蘆醇溶于乙醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，探頭超聲即得阿霉素-白藜蘆醇共載藥脂質(zhì)體，粒徑95nm，靜脈注射用于腫瘤靶向協(xié)同給藥治療。

實施例24

將100mg磷脂E80、30mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯、5mg和厚樸酚和5mg白藜蘆醇溶于乙醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，高壓均質(zhì)即得和厚樸酚-白藜蘆醇共載藥脂質(zhì)體，粒徑110nm，靜脈注射用于腫瘤靶向協(xié)同給藥治療。

實施例25

將70mg磷脂PC98-T、20mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯、4mg和厚樸酚和3mg姜黃素溶于丙酮置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，高壓均質(zhì)即得和厚樸酚-姜黃素共載藥脂質(zhì)體，粒徑105nm，靜脈注射用于腫瘤靶向協(xié)同給藥治療。

實驗例1磷脂E80和15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯的投料比與脂質(zhì)體粒徑的關(guān)系

控制磷脂E80和15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯（表格中用HS15表示）的投料比例，可以得到不同粒徑的脂質(zhì)體，滿足不同給藥需求，如表1所示。結(jié)果表明，15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯比例越大，脂質(zhì)體粒徑越小。

表1. 投料比與粒徑的關(guān)系

實驗例2磷脂E80和15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯聯(lián)合使用的重要性

發(fā)明人考察了單獨使用磷脂E80或15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯（表格中用HS15表示）來制備載藥脂質(zhì)體，如表2所示。結(jié)果表明，單獨使用磷脂E80或15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯制備的脂質(zhì)體粒徑和PDI較大，且非常不穩(wěn)定。因此，磷脂E80和15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯必須在一定比例下聯(lián)合使用才能制備出符合發(fā)明人要求的脂質(zhì)體。

表2. 單獨使用磷脂E80或15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯制備載藥脂質(zhì)體

實驗例3載藥脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察

本發(fā)明選擇實施例1中的和厚樸酚脂質(zhì)體作為模型，研究此新型脂質(zhì)體包載一種難溶性藥物時的穩(wěn)定性；選擇實施例21中的共載藥脂質(zhì)體作為模型，研究此新型脂質(zhì)體同時包載兩種難溶性藥物時的穩(wěn)定性。將制備出的脂質(zhì)體，分別放置于4°C、室溫和37°C下保存，每隔一定時間取樣測粒徑，記錄粒徑的變化，如表3、表4所示。

表3. 單獨包載一種藥物的脂質(zhì)體的穩(wěn)定性考察

表4. 同時包載兩種藥物的脂質(zhì)體的穩(wěn)定性考察

結(jié)果表明，本發(fā)明的脂質(zhì)體包載一種或兩種藥物均有出色的穩(wěn)定性，10天之內(nèi)粒徑?jīng)]有明顯變化，也無藥物析出，且溫度對脂質(zhì)體的保存無明顯影響。

實驗例4脂質(zhì)體的形態(tài)、粒徑測定

將實施例1中和厚樸酚脂質(zhì)體的濃度（藥物+輔料）稀釋成1mg/ml，于透射電鏡下觀察脂質(zhì)體的形態(tài)和粒徑大小。

圖1為和厚樸酚脂質(zhì)體的透射電鏡圖。結(jié)果表明，和厚樸酚脂質(zhì)體外觀圓整，粒徑均一。在此實施例下，和厚樸酚脂質(zhì)體的粒徑約為80~100nm。

實驗例5和厚樸酚脂質(zhì)體的體外釋放

將2ml和厚樸酚原藥溶液（0.5mg/ml）和2ml實施例1中的和厚樸酚脂質(zhì)體混懸液（0.5mg/ml，按和厚樸酚濃度計算）分別置于透析袋中（分子截留量為1000Da）。將透析袋置于含100ml PBS（pH7.4）的棕色廣口瓶中，于37°C恒溫搖床（100rpm）中振搖。每隔一段時間取5.0ml透析袋外的透析液測定紫外吸收值，同時向廣口瓶中補加5.0ml新鮮PBS。將紫外吸收值代入標準曲線計算出和厚樸酚的濃度，進而計算出和厚樸酚原藥與和厚樸酚脂質(zhì)體在各個時間點的釋放度（n=3）。

圖2為實施例1中和厚樸酚脂質(zhì)體的體外釋放實驗結(jié)果。結(jié)果表明，和厚樸酚脂質(zhì)體在體外比和厚樸酚原藥有更好的緩釋效果，本發(fā)明的脂質(zhì)體可以用于藥物緩釋。

實驗例6腫瘤細胞攝取試驗

用親脂性熒光染料DiD標記脂質(zhì)體，對脂質(zhì)體進行示蹤，制備方法與實施例1相似，具體為：將40mg磷脂E80、25mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和0.6mg DiD溶于乙醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，探頭超聲即得DiD標記的脂質(zhì)體（DiD-Lip），粒徑82nm。

將小鼠黑色素瘤細胞（B16F10）接種于12孔板中，每孔1×10⁵個細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，50U/ml青霉素，50U/ml鏈霉素）在37°C、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細胞的單層覆蓋率達到80%。吸去培養(yǎng)基，每孔分別加入1ml DiD原藥溶液和DiD-Lip混懸液（用培養(yǎng)基將濃度稀釋成0.5μg/ml，按DiD濃度計算）。原藥組和脂質(zhì)體組各做三個復孔，另設(shè)三孔作為對照。繼續(xù)培養(yǎng)2h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，用胰酶消化細胞。1min后終止消化，將細胞轉(zhuǎn)移至2ml離心管中離心，棄去上清，加入300μl PBS重懸，用流式細胞儀測定DiD的熒光強度。

圖3為DiD-Lip的腫瘤細胞攝取結(jié)果（**：p<0.01）。結(jié)果表明，腫瘤細胞對脂質(zhì)體的攝取要明顯高于DiD原藥，本發(fā)明的脂質(zhì)體有作為腫瘤靶向藥物載體的潛力。

實驗例7體內(nèi)分布研究

將6周齡的C57小鼠腋下接種B16F10細胞（每只給予2×10⁶個細胞，分散在0.2ml PBS中）。待腫瘤長至約200mm³時（接種14天后）將小鼠分為2組：DiD原藥組和DiD-Lip組（制備方法同實驗例6），每組3只。分別靜脈注射原藥和脂質(zhì)體后（給藥劑量為10μg/kg，按DiD濃度計算），于2h后處死，取心、肝、脾、肺、腎、腫瘤，洗凈，用活體成像儀對各器官進行半定量，測定器官中的DiD含量。

圖4為DiD-Lip的體內(nèi)分布結(jié)果。結(jié)果表明，脂質(zhì)體在腫瘤組織中的分布要明顯高于原藥組，進一步證明本發(fā)明的脂質(zhì)體可作為腫瘤靶向治療的載體。

實驗例8安全性評價

將10只雄性SD大鼠隨機分為2組，每組5只。兩組分別靜脈注射生理鹽水和脂質(zhì)體（不載藥，處方同實施例1，濃度為50 mg/kg），每2天注射一次，連續(xù)注射4周。在給藥期間觀察大鼠進食、活動、精神狀態(tài)等生活情況，于末次給藥24h后取血測定血液學指標，包括白細胞計數(shù)（WBC）、紅細胞計數(shù)（RBC）和血小板數(shù)（Plt）。處死大鼠后取出心、肝、脾、肺、腎等各器官，4%多聚甲醛固定后，經(jīng)石蠟包埋切片和蘇木精-伊紅染色后在光學顯微鏡下做病理組織學檢查，觀察兩組大鼠的各個器官的病理變化情況。

圖5為脂質(zhì)體的安全性評價結(jié)果（a：血常規(guī)指標；b：各主要器官的病理切片，刻度代表200μm）。結(jié)果顯示，脂質(zhì)體組的血液學指標與生理鹽水組無明顯區(qū)別，表明脂質(zhì)體對骨髓造血無影響。此外，脂質(zhì)體對各主要器官沒有明顯毒性，進一步表明了本發(fā)明的脂質(zhì)體安全性好。

實驗例9脂質(zhì)體用于聯(lián)合用藥

發(fā)明人選取替尼泊苷與和厚樸酚兩種抗腫瘤藥物，將其分別單獨包載于脂質(zhì)體和同時包載于同一脂質(zhì)體中，比較聯(lián)合用藥與單獨用藥的抗腫瘤效果，探索此脂質(zhì)體在聯(lián)合用藥領(lǐng)域的應用前景。

將6周齡的C57小鼠腋下接種B16F10細胞（每只給予2×10⁶個細胞，分散在0.2ml PBS中）。待腫瘤長至約50mm³時（接種8天后）將小鼠分為5組：生理鹽水組（a）、替尼泊苷脂質(zhì)體組（b）、和厚樸酚脂質(zhì)體組（c）、替尼泊苷脂質(zhì)體+和厚樸酚脂質(zhì)體組（d）和替尼泊苷+和厚樸酚共載藥脂質(zhì)體組（e），每組3只。每組分別給與對應的制劑，此后每隔1天給藥一次，6次給藥后停止給藥，接種21天后停止實驗。最后一次給藥后解剖小鼠，將腫瘤取出后觀察各組腫瘤大小。各組制劑制備過程如下：

a組：生理鹽水；

b組：將替尼泊苷按照實施例1下的處方量包載到脂質(zhì)體中，給藥劑量為10mg/kg；

c組：將和厚樸酚按照實施例1下的處方量包載到脂質(zhì)體中，給藥劑量為10mg/kg；

d組：按照實施例1下的處方量分別制備替尼泊苷脂質(zhì)體與和厚樸酚脂質(zhì)體，然后將兩種脂質(zhì)體按體積比1:1混合后共給藥，給藥劑量按總藥量計算，為10mg/kg；

e組：將替尼泊苷與和厚樸酚按照實施例21下的處方量按質(zhì)量比1:1共同包載到同一脂質(zhì)體中，給藥劑量按總藥量計算，為10mg/kg。

實驗結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，脂質(zhì)體包載兩種藥物聯(lián)合用藥的治療效果明顯優(yōu)于使用單一藥物脂質(zhì)體進行治療。而且，將兩種藥物包載于同一脂質(zhì)體中進行治療比混合兩種單一藥物脂質(zhì)體進行治療效果更優(yōu)。因此，本發(fā)明的脂質(zhì)體有極大的用于聯(lián)合用藥的潛力。

對比實驗

為了進一步體現(xiàn)本發(fā)明的脂質(zhì)體相比于目前常用的脂質(zhì)體的優(yōu)越性，發(fā)明人設(shè)置了對比實驗。專利文獻CN200610021277.8提供了一種脂質(zhì)體，此脂質(zhì)體以常用的磷脂和膽固醇為材料進行制備，并添加了PEG化的磷脂，而且也包載了和厚樸酚，符合我們的對比需求。因此，本發(fā)明人以專利文獻CN200610021277.8中的脂質(zhì)體作為對比制劑。

包載藥物種類對比

發(fā)明人選擇了幾種有代表性的難溶性藥物，分別用本發(fā)明的脂質(zhì)體與專利文獻CN200610021277.8中的脂質(zhì)體包載，比較兩者的包載能力。本發(fā)明的脂質(zhì)體按照本發(fā)明實施例1下的處方量進行制備；對比脂質(zhì)體按照專利文獻CN200610021277.8中實施例1下的方法進行制備，結(jié)果如表5所示。

可以看出，本發(fā)明的脂質(zhì)體可以將所有選擇的藥物包載其中，粒徑和PDI較小，外觀較好；而對比脂質(zhì)體只能將和厚樸酚較好地包載其中，對其他選擇的藥物無法很好地包載。結(jié)果表明，本發(fā)明的脂質(zhì)體能包載種類更多的難溶性藥物，包載能力強。

表5. 包載藥物種類對比

2.脂質(zhì)體穩(wěn)定性對比

分別按照本發(fā)明實施例1下的處方和專利文獻CN200610021277.8中實施例1下的處方制備和厚樸酚脂質(zhì)體，于室溫下保存，每隔一定時間取樣測粒徑。用取樣粒徑與初始粒徑的比值表征粒徑的變化，考察兩種脂質(zhì)體各自的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖7所示。

可以看出，本發(fā)明的脂質(zhì)體在10天之內(nèi)粒徑幾乎沒有變化；而對比脂質(zhì)體粒徑一直在增加，10天之后粒徑從100nm左右增加到了300nm左右。結(jié)果表明，本發(fā)明的脂質(zhì)體具有更好的穩(wěn)定性。

脂質(zhì)體體內(nèi)藥代動力學對比

分別按照本發(fā)明實施例1下的處方和專利文獻CN200610021277.8中實施例1下的處方制備和厚樸酚脂質(zhì)體。將9只健康雄性Wistar大鼠（180±20g）隨機分為和厚樸酚原藥組、對比脂質(zhì)體組和本發(fā)明的脂質(zhì)體組三組，每組3只，分別給予各制劑，給藥劑量按和厚樸酚計算為20mg/kg。給藥后每隔一段時間，眼眶取血300μl于含有1%肝素鈉的EP管中，6000rpm離心5min。取100μl上清，加400ul甲醇沉淀蛋白，渦旋10min后水浴超聲10min，13000rpm離心10min，取上清，用HPLC測定各個時間點的血漿藥物濃度，結(jié)果如圖8所示。

結(jié)果表明，在沒有使用PEG化磷脂的情況下，本發(fā)明脂質(zhì)體的長循環(huán)效果還要略優(yōu)于處方中含有PEG化磷脂的對比脂質(zhì)體，體現(xiàn)了本脂質(zhì)體在長循環(huán)方面的優(yōu)越性，而且制備成本更加廉價。