本發(fā)明涉及醫(yī)療用品技術領域，具體是涉及一種殼聚糖基海綿敷料及其制備方法。
背景技術：
近年來，海綿在藥物緩釋、傷口敷料、細胞培養(yǎng)和組織工程等領域得到廣泛的應用，利用天然的生物高分子開發(fā)生物醫(yī)用海綿和多孔材料成為研究的熱點。殼聚糖(chitosan)化學名稱為(1,4)-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖，是一種含氨基的天然均態(tài)直鏈多糖，它是天然第二大高分子甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物。殼聚糖含有大量的游離氨基使其反應性和功能化大大加強。由于殼聚糖具有來源廣泛、生物相容性好和可降級等優(yōu)點，因此在人造皮膚、止血材料及傷口包扎材料等方面的研究與應用成為目前研究最熱門的材料之一，在生物醫(yī)用領域表現(xiàn)出極大的應用價值。作為生物醫(yī)用敷料材料，殼聚糖的力學性能和抗菌性能往往達不到要求，為了提高此類天然高分子材料的強度和抗菌性能，人們常常通過交聯(lián)反應和負載抗菌藥物而達到增強和抗菌的目的。
物理交聯(lián)的殼聚糖凝膠強度不高，且該凝膠受環(huán)境pH影響較大。化學交聯(lián)所選用的交聯(lián)劑大多為醛類交聯(lián)劑，而這類交聯(lián)劑具有相對較高的毒性，影響傷口的愈合和功能的恢復。京尼平是傳統(tǒng)中藥杜仲的活性成分之一，含有-OH、-COO-等多個活性官能團，可自發(fā)與氨基反應達到交聯(lián)殼聚糖的效果。與傳統(tǒng)交聯(lián)劑相比，天然生物交聯(lián)劑京尼平具有低毒性和良好的生物相容性，因此，以京尼平交聯(lián)的殼聚糖凝膠在生物材料領域具有廣泛的應用價值。
氨芐西林(Ampicillin)為半合成的廣譜青霉素。氨芐西林對革蘭陽性球菌和桿菌(包括厭氧菌)的抗菌作用基本與青霉素相同，但對糞腸球菌的作用較青霉素更強。能有效對抗革蘭氏陰性細菌中腦膜炎球菌、淋球菌、流感桿菌、百日咳桿菌、布氏桿菌、奇異變形桿菌、沙門菌等。某些大腸桿菌及某些志賀菌屬也對氨芐西林敏感。目前，氨芐西林在臨床上主要適應于治療敏感菌所致的下列感染：1)呼吸系統(tǒng)感染，如急性和慢性支氣管炎、支氣管擴張、肺炎、扁桃腺炎、咽炎、喉炎、鼻竇炎；2)胃腸道感染，如傷寒、副傷寒、菌痢、沙門菌屬和志賀菌引起的菌痢、細菌性腹瀉；3)泌尿系統(tǒng)感染，如尿道炎、淋病、膀膚炎；4)其它感染，如腦膜炎、心內膜炎、中耳炎、敗血癥等。更有報道顯示，氨芐西林用于治療慢性淺表性胃炎、類風濕性關芐炎也有效。但是，臨床表明大量使用氨芐西林會產(chǎn)生的一些毒副作用：如肝毒性、腎毒性、神經(jīng)系統(tǒng)毒性癥狀及耳毒性。為了提高氨芐西林的生物利用度，避免大量使用氨芐西林所產(chǎn)生的毒副作用，以氨芐西林作為抗菌劑接枝到殼聚糖基底，得到的殼聚糖基海綿敷料為新型醫(yī)用敷料的發(fā)展開辟了新的領域。因此，一種殼聚糖基醫(yī)用海綿敷料的制備方法的研究對新型抗菌敷料的制備和開發(fā)具有重要的意義。
技術實現(xiàn)要素：
發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明提供一種工藝簡單，操作方便，反應條件溫和，綠色、環(huán)境友好的殼聚糖基海綿敷料的制備方法。
技術方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術方案如下：
一種殼聚糖基海綿敷料的制備方法，包括以下步驟：
1)將殼聚糖溶解到醋酸水溶液中，得到1～5wt％的殼聚糖溶液；
2)取(3-氨丙基)三乙氧基硅烷，按照與殼聚糖的摩爾比4:1～1:8加入到殼聚糖溶液中充分攪拌，反應18-24h；
3)將京尼平溶解到去離子水中，得到0.01～0.2wt％的京尼平溶液；
4)將京尼平溶液加入到步驟2)所得溶液混合，充分攪拌；倒入模具中，40～70℃反應4～8h，冷凍干燥后得到氨基修飾的殼聚糖海綿；
5)將殼聚糖海綿浸泡在含有氨芐西林、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的混合溶液中，反應2～10h，冷凍干燥后得到殼聚糖基海綿敷料。
所述的殼聚糖醋酸溶液重量百分比優(yōu)選為1.5～4wt％。
所述的(3-氨丙基)三乙氧基硅烷與殼聚糖的摩爾比優(yōu)選4:1～1:4。
所述的京尼平溶液重量百分比優(yōu)選為0.01～0.08wt％。
所述的氨芐西林的加入量為殼聚糖重量的1～6wt％。
所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的加入量與殼聚糖的摩爾比為5:5:1～5:1:1。
所述的殼聚糖基敷料的制備方法所得到的殼聚糖基海綿敷料。
有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明通過化學交聯(lián)和冷凍干燥制備出殼聚糖基海綿敷料，該敷料使用生物交聯(lián)劑京尼平，避免使用具有毒性的醛交聯(lián)劑，具有無毒或低毒性的特點。再通過接枝氨芐西林賦予敷料優(yōu)越的抗菌性能。本發(fā)明敷料具有三維網(wǎng)絡結構，具有較高的孔隙率和吸水率。所制備的殼聚糖基海綿敷料，作用于大腸桿菌和白色念珠菌的菌液，搖床培養(yǎng)6-8h，抑菌率可達到100％，抑菌效果顯著。本發(fā)明工藝簡單，操作方便，反應條件溫和，綠色、環(huán)境友好，適用于醫(yī)用止血傷口敷料。
附圖說明
圖1是殼聚糖基海綿敷料截面的掃描電鏡照片圖。
具體實施例
為了更好的理解本發(fā)明，下面結合實施例進一步闡明本發(fā)明的內容，但本發(fā)明的內容不僅僅局限于下面的實施例。
實施例1
一種殼聚糖基海綿敷料的制備方法，步驟如下：
1)首先將殼聚糖溶于3％的醋酸的水溶液得到1wt％的殼聚糖溶液；
2)按照(3-氨丙基)三乙氧基硅烷與殼聚糖的摩爾比1:1混合，充分攪拌得混合溶液，反應18h；
3)將京尼平溶液與步驟2)所得溶液混合，充分攪拌；混合后京尼平的質量分數(shù)為0.06wt％；
4)倒入模具中，40℃反應5h，冷凍干燥得殼聚糖海綿；
5)將殼聚糖海綿浸泡在20mL的含有氨芐西林、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的混合溶液中，反應4h，冷凍干燥既得產(chǎn)品。
其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的加入量與殼聚糖的摩爾比為2:5:1，氨芐西林的加入量為殼聚糖重量的2wt％。
實施例2
一種殼聚糖基海綿敷料的制備方法，步驟如下：
1)將殼聚糖溶于2％的醋酸的水溶液得到2wt％的殼聚糖溶液；
2)按照(3-氨丙基)三乙氧基硅烷與殼聚糖的摩爾比1:8混合，充分攪拌得混合溶液，反應24h；
3)將京尼平溶液與步驟2)所得溶液混合，充分攪拌；混合后京尼平的質量分數(shù)為0.1wt％；
4)倒入模具中，50℃反應4h，冷凍干燥得殼聚糖海綿；
5)將殼聚糖海綿膠浸泡在20mL的含有氨芐西林、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的混合溶液中，反應8h，冷凍干燥既得產(chǎn)品。
其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的加入量與殼聚糖的摩爾比為5:5:1，氨芐西林的加入量為殼聚糖重量的4.5wt％。
實施例3
一種殼聚糖基海綿敷料的制備方法，步驟如下：
1)將殼聚糖溶于2％的醋酸的水溶液得到1wt％的殼聚糖溶液；
2)按照(3-氨丙基)三乙氧基硅烷與殼聚糖的摩爾比1:4混合，充分攪拌得混合溶液，反應24h；
3)將京尼平溶液與步驟2)所得溶液混合，充分攪拌；混合后京尼平的質量分數(shù)為0.08wt％；
4)倒入模具中，45℃反應5h，冷凍干燥得殼聚糖海綿；
5)將殼聚糖海綿膠浸泡在20mL的含有氨芐西林、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的混合溶液中，反應6h，冷凍干燥既得產(chǎn)品。
其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的加入量與殼聚糖的摩爾比為4:5:1，氨芐西林的加入量為殼聚糖重量的5wt％。
實施例4
一種殼聚糖基海綿敷料的制備方法，步驟如下：
1)將殼聚糖溶于1.5％的醋酸的水溶液得到2wt％的殼聚糖溶液；
2)按照(3-氨丙基)三乙氧基硅烷與殼聚糖的摩爾比1:1混合，充分攪拌得混合溶液，反應20h；
3)將京尼平溶液與步驟2)所得溶液混合，充分攪拌；混合后京尼平的質量分數(shù)為0.08wt％；
4)倒入模具中，40℃反應8h，冷凍干燥得殼聚糖海綿；
5)將殼聚糖海綿浸泡在20mL的含有氨芐西林、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的混合溶液中，反應6h，冷凍干燥既得產(chǎn)品。
其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的加入量與殼聚糖的摩爾比為3:5:1，氨芐西林的加入量為殼聚糖重量的5wt％。
殼聚糖基海綿敷料截面的掃描電鏡照片，如圖1所示，可以看到殼聚糖基海綿敷料具有典型的三維網(wǎng)絡結構，使其具有較高的孔隙率和吸水率，具有吸收傷口滲液和透氣性的優(yōu)點。
實施例5
一種殼聚糖基海綿敷料的制備方法，包括如下步驟：
1)將殼聚糖溶于3％的醋酸的水溶液得到2.5wt％的殼聚糖溶液；
2)按照(3-氨丙基)三乙氧基硅烷與殼聚糖的摩爾比2:1混合，充分攪拌得混合溶液，反應18h；
3)將京尼平溶液與步驟2)所得溶液混合，充分攪拌；混合后京尼平的質量分數(shù)為0.01wt％；
4)倒入模具中，50℃反應6h，冷凍干燥得殼聚糖海綿；
5)將殼聚糖海綿浸泡在20mL的含有氨芐西林、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的混合溶液中，反應6h，冷凍干燥既得產(chǎn)品。
其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的加入量與殼聚糖的摩爾比為1:3:1，氨芐西林的加入量為殼聚糖重量的5.5wt％。
實施例6
一種殼聚糖基海綿敷料的制備方法，包括如下步驟：
1)將殼聚糖溶于4％的醋酸的水溶液得到3wt％的殼聚糖溶液；
2)按照(3-氨丙基)三乙氧基硅烷與殼聚糖的摩爾比4:1混合，充分攪拌得混合溶液，反應20h；
3)將京尼平溶液與步驟2)所得溶液混合，充分攪拌；混合后京尼平的質量分數(shù)為0.02wt％；
4)倒入模具中，35℃反應8h，冷凍干燥得殼聚糖海綿；
5)將殼聚糖海綿浸泡在20mL的含有氨芐西林、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的混合溶液中，反應8h，冷凍干燥既得產(chǎn)品。
其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的加入量與殼聚糖的摩爾比為4:1:1，氨芐西林的加入量為殼聚糖重量的6wt％。
實施例7
對實施例1-6制備獲得的殼聚糖基海綿敷料進行性能檢測以及抗菌活性檢測，具體如下：
1、孔隙率測定：1)將樣品剪成直徑為D的圓形并稱重，記m1；2)用千分尺測量樣品的厚度，記H；3)將樣品分別放入10mL無水乙醇中，24h后取出樣品擦干表面的乙醇，并稱重，記m2?？紫堵视嬎愎饺缦拢?/p>
孔隙率％＝(m2-m1)/(ρ乙醇×V)*100％
式中，V＝π×(D/2)2×H。
測試結果見表1。從表中可以看到殼聚糖基海綿敷料的孔隙率均高于70％，證明所制備的海綿敷料具有非常好的透氣性能，適合于做敷料。
2、吸水率的測定：1)將樣品干燥后放入干燥器中24小時后，稱量的樣品質量，記W1；2)將樣品放入去離子水中溶脹24小時后，擦干表面的水后稱重，記為W2。吸水率計算公式如下：
吸水率％＝(W2-W1)/W1*100％
測試結果見表1。從表中可以看到殼聚糖基海綿敷料都具有較高的吸收率，說明所制備的海綿敷料具有良好的吸收傷口滲液的性能，適合于做敷料。
3、抑菌實驗
實驗采用液態(tài)培養(yǎng)體系，以加入等量的無菌水作為空白對照樣計算抑菌率，細菌計數(shù)采用平板計數(shù)法進行。具體步驟為：
a)菌液制備：培養(yǎng)大腸桿菌采用的固體培養(yǎng)基為胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)，培養(yǎng)基組成為：酪蛋白胰酶消化物15.0g/L，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g/L，氯化鈉5.0g/L，瓊脂15.0g/L，pH值7.2，高壓蒸汽121℃滅菌20分鐘后，倒平板。用滅菌接種環(huán)取冷凍保存的大腸桿菌和白色念珠菌菌種分別接種到TSA培養(yǎng)板上，置于培養(yǎng)箱37℃恒溫培養(yǎng)24小時，用滅菌接種環(huán)挑取菌落分別到盛有100mL滅菌的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)的無菌錐形瓶中，培養(yǎng)基組成為：酪蛋白胰酶消化物15.0g/L，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g/L，氯化鈉5.0g/L，pH值7.2，高壓蒸汽121℃滅菌20分鐘。采用比濁法測量使其細菌濃度在1×107CFU/mL左右，劇烈振蕩使其混合均勻。
b)樣品準備：將殼聚糖基海綿敷料剪成直徑為10mm的圓形，經(jīng)紫外線滅菌30min后測試抑菌性能。
c)搖床培養(yǎng)：向50mL錐形瓶中分別添加40mL的無菌胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，再分別添加10μL的步驟a)中的大腸桿菌菌液和白色念珠菌菌液，分別加入步驟b)中樣品，其中一只錐形瓶中不添加，作為空白對照樣。將錐形瓶置于轉速為150rpm/min，37℃的搖床中培養(yǎng)6小時。
d)抑菌率計算：采用逐級稀釋涂平板的方法，分別對錐形瓶內的存活細菌進行計數(shù)，抑菌率由下列公式計算：
R(％)＝(N空白-N試樣)/N試樣×100％
其中，N空白和N試樣分別為空白對照錐形瓶和添加殼聚糖基海綿敷料錐形瓶內的菌落數(shù)。
殼聚糖基海綿敷料的抑制大腸桿菌的抑菌率結果，如表1所示?？梢钥闯霰景l(fā)明的殼聚糖基海綿敷料的抑菌率可以達到100％，具有優(yōu)越的抑制大腸桿菌效果。
表1，各結果匯總表