本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架的阿霉素明膠微球及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

骨肉瘤是常見的骨骼系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤之一，起源于骨間葉細(xì)胞，其特征為增殖的腫瘤細(xì)胞直接形成未成熟骨或骨樣組織。典型的骨肉瘤比較罕見，其發(fā)病率約為百萬分之0.3，其中包括0.2％的惡性腫瘤和15％的原發(fā)性骨腫瘤。典型的骨肉瘤好發(fā)于8-25歲的男性，好發(fā)部位為長骨，最常見于股骨遠(yuǎn)端或脛骨近端，其次為肱骨近端，其他部位少見，其血行轉(zhuǎn)移發(fā)生早且發(fā)生率高。1970年之前，骨肉瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方法為截肢，然而80％的患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移。從外科治療到出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移的平均時(shí)間為8個月，5年生存率較低，大部分患者于確診后1年內(nèi)死亡。近年來，隨著化療的開展、手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)，骨骼重建以及其他的治療方法的引進(jìn)，骨肉瘤保肢治療已逐漸取代截肢治療，80％的患者更愿意接受保肢治療，患者的5年生存率也從20％左右提高到了55％～75％。

20世紀(jì)70年代至今，化療始終在骨肉瘤治療過程中占據(jù)重要地位，現(xiàn)今，常常將化療與手術(shù)切除聯(lián)合應(yīng)用以治療骨肉瘤。在骨肉瘤的化療中，阿霉素的治療具有顯著的作用，其治療的機(jī)理在于其能夠插入細(xì)胞DNA，引發(fā)拓?fù)洚悩?gòu)酶II介導(dǎo)的DNA單鏈以及雙鏈結(jié)構(gòu)的斷裂。

雖然阿霉素是治療骨肉瘤非常有效的化療藥物，但其副作用也是顯而易見的，阿霉素最顯著的副作用在于它的心臟毒性和骨髓抑制作用，當(dāng)使用劑量過大時(shí)，將會導(dǎo)致不可逆的心力衰竭，阿霉素的以上副作用大大限制了其在骨肉瘤治療中的應(yīng)用。

此外，骨肉瘤的治療可能會導(dǎo)致大范圍的骨缺損，即使骨肉瘤疾病被治愈也會嚴(yán)重影響到患者的生活質(zhì)量，較常用的填充骨間隙的方法為骨移植或者使用替代性骨材料。目前，人們已經(jīng)認(rèn)識到骨膜是植骨愈合與重建起始的關(guān)鍵，因此，也逐漸加大了對骨膜相似材料的研究。

因此，如何將骨膜與藥物化療相結(jié)合，以治療骨肉瘤疾病，并保證治療的效果，具有重要的研究意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架的阿霉素明膠微球，以緩解骨肉瘤治療中出現(xiàn)的嚴(yán)重骨缺損的問題。

本發(fā)明提供了一種聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架的阿霉素明膠微球。

進(jìn)一步的，所述聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架的阿霉素明膠微球的載藥量為6.0-6.4μg/mg。

本發(fā)明的第二個目的在于提供聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架的阿霉素明膠微球的制備方法。

本發(fā)明提供了一種聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架的阿霉素明膠微球的制備方法，該方法包括：將所述阿霉素明膠微球與所述骨膜去細(xì)胞支架用交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)。

進(jìn)一步的，所述骨膜去細(xì)胞支架由骨膜經(jīng)過物理凍融操作和去污劑洗脫操作獲得。

進(jìn)一步的，所述物理凍融操作的溫度為-80℃，所述物理凍融操作的時(shí)間為1-2h。

進(jìn)一步的，所述去污劑包括tritonX-100和SDS。

進(jìn)一步的，所述骨膜去細(xì)胞支架的具體制備步驟如下：

步驟(a)，取骨膜于-80℃放置2h，取出后于20℃下用PBS溶液震蕩去血，得到去血的骨膜；

步驟(b)，將所述去血的骨膜在搖床上依次用1％tritonX-100震蕩6h，2.4％SDS震蕩12h，重復(fù)操作1-2次，然后用去離子水震蕩24h，得到所述骨膜去細(xì)胞支架，所述震蕩的頻率為100r/min。

進(jìn)一步的，所述阿霉素明膠微球的具體制備步驟如下：

步驟(a)，用蒸餾水配制含有1mg/mL阿霉素以及0.05g/mL明膠的溶液，作為水相；

步驟(b)，取Tween-80、Span-80和液體石蠟混勻，作為油相，所述油相中Tween-80、Span-80和液體石蠟的體積比為0.24:0.96:25；

步驟(c)，在攪拌下，將所述水相緩慢加入到所述油相中，乳化形成W/O型乳劑，所述水相與所述油相的體積比為5:13；

步驟(d)，將所述W/O型乳劑迅速冷卻至5℃以下；

步驟(e)，向所述W/O型乳劑中滴加交聯(lián)劑，進(jìn)行固化，得到所述阿霉素明膠微球。

進(jìn)一步的，所述交聯(lián)劑包括戊二醛。

另外，本發(fā)明還提供了聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架的阿霉素明膠微球在制備治療骨肉瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架的阿霉素明膠微球，其制備方法為將阿霉素與骨膜去細(xì)胞支架交聯(lián)，所制得的聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架的阿霉素明膠微球的載藥量為6.0-6.4μg/m。本發(fā)明提供的聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架的阿霉素明膠微球，體現(xiàn)了阿霉素明膠微球和骨膜的優(yōu)點(diǎn)，在保障了藥物緩釋特性、抑制成骨細(xì)胞增殖效果的同時(shí)，也有利于骨組織的再生，為骨肉瘤的治療提供了新的方法和思路。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為D-periosteum的照片圖；

圖2A1為N-periosteum經(jīng)HE染色后的顯微圖；

圖2A2為N-periosteum經(jīng)HE染色后的顯微圖；

圖2B1為D-periosteum經(jīng)HE染色后的顯微圖；

圖2B2為D-periosteum經(jīng)HE染色后的顯微圖；

圖3A1為N-periosteum的Fibrous層的電鏡圖；

圖3A2為N-periosteum的Fibrous層的電鏡圖；

圖3B1為N-periosteum的Cambium層的電鏡圖；

圖3B2為N-periosteum的Cambium層的電鏡圖；

圖3C1為D-periosteum的Fibrous層的電鏡圖；

圖3C2為D-periosteum的Fibrous層的電鏡圖；

圖3D1為D-periosteum的Cambium層的電鏡圖；

圖3D2為D-periosteum的Cambium層的電鏡圖；

圖3E為ADM-GMS的電鏡圖；

圖3F1為ADM-GMS D-periosteum的電鏡圖；

圖3F2為ADM-GMS D-periosteum的電鏡圖；

圖4為D-periosteum和N-periosteum的DNA含量分析數(shù)據(jù)圖；

圖5為N-periosteum、D-periosteum和ADM-GMS D-periosteum的吸水性測定數(shù)據(jù)圖；

圖6為ADM濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖7為ADM、ADM-GMS和ADM-GMS D-periosteum的藥物體外釋放曲線圖；

圖8為D-periosteum細(xì)胞毒性檢測數(shù)據(jù)；

圖9為ADM-GMS D-periosteum細(xì)胞毒性檢測數(shù)據(jù)；

圖10為ADM、ADM-GMS和ADM-GMS D-periosteum抑制細(xì)胞增殖率曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明提供了一種聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架的阿霉素明膠微球，是將骨膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理后形成骨膜去細(xì)胞支架，并制備阿霉素明膠微球，然后將阿霉素明膠微球交聯(lián)于骨膜去細(xì)胞支架上。其中，阿霉素明膠微球的平均直徑為20.13μm。

為了有助于更清楚的理解本發(fā)明的內(nèi)容，現(xiàn)結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)的介紹。需要注意的是，如未明確指出，說明書中涉及的操作方法為常規(guī)的方法，涉及的試劑、儀器等為常規(guī)市售。

為了敘述方便，實(shí)施例部分涉及了英文單詞或者簡稱，其中，N-periosteum指未經(jīng)過去細(xì)胞處理的骨膜支架，D-periosteum指去細(xì)胞骨膜支架，ADM指阿霉素，GMS指明膠微球，ADM-GMS指阿霉素明膠微球，ADM-GMS D-periosteum指聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架的阿霉素明膠微球。

實(shí)施例1骨膜去細(xì)胞支架的制備

取SD大鼠稱重，用5％水合氯醛按照0.6mL/100g的量腹腔注射麻醉后俯臥位固定，頭部備皮，于雙耳間做4cm長縱向切口，暴露顱骨骨膜，剝離后的骨膜用PBS(含100U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素)清洗兩次，然后固定于專用支具。

骨膜隨后先置于-80℃，2小時(shí)后取出，然后在20℃恒溫水浴搖床先用PBS震蕩去血，后依次用1％tritonX-100震蕩6h，2.4％SDS震蕩12h，再依次用1％triton X-100震蕩6h，2.4％SDS震蕩12h(即tritonX-100和SDS清洗操作重復(fù)了1次)，最后用去離子水震蕩24h，震蕩頻率為100r/min。

實(shí)施例2阿霉素明膠微球的制備

用蒸餾水配制含有1mg/mL阿霉素以及0.05g/mL明膠的溶液10mL，作為水相；取Tween-80 0.24mL，Span-80 0.96mL，液體石蠟25mL混勻，作為油相；在攪拌下，將水相緩慢加入到油相中，乳化形成W/O型乳劑，該乳化過程控制溫度55℃；將W/O型乳劑迅速冷卻至5℃以下；向W/O型乳劑中滴加200μL戊二醛，進(jìn)行固化；最后用丙酮脫水三次。

實(shí)施例3骨膜去細(xì)胞支架與阿霉素明膠微球交聯(lián)

將制備好的骨膜去細(xì)胞支架，加入到用戊二醛固化后的明膠微球中(尚未用丙酮脫水)，置于搖床上震蕩30min，并滴加100μL戊二醛。獲得的支架自然干燥保存，即得到了聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架的阿霉素明膠微球。

為了評價(jià)本發(fā)明提供的聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架的阿霉素明膠微球的效果，現(xiàn)通過以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測定或者觀察，以下效果例中涉及的骨膜去細(xì)胞支架、阿霉素明膠微球以及聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架的阿霉素明膠微球均按照上述實(shí)施例進(jìn)行制備。

以下效果例中涉及的D-periosteum、AMD-GMS和ADM-GMS D-periosteum，均按照本發(fā)明實(shí)施例的方法制得。另外，效果例中還涉及了GMS D-periosteum，其制備方法與ADM-GMS D-periosteum的制備方法相同，僅不添加ADM。

效果例1 D-periosteum以及ADM-GMS D-periosteum的形態(tài)觀察

(一)D-periosteum的形態(tài)和結(jié)構(gòu)

肉眼觀察骨膜的形態(tài)，并拍照如圖1所示(bar＝1cm)，D-periosteum的形態(tài)為半透明的白色片狀。

(二)N-periosteum和D-periosteum光學(xué)顯微鏡觀察

用N-periosteum和D-periosteum制作組織標(biāo)本，組織標(biāo)本經(jīng)4％多聚甲醛固定、包埋、切片，HE染色后觀察組織結(jié)構(gòu)，如圖2A1，圖2A2，圖2B1和圖2B2所示。

由圖可以看出，骨膜去細(xì)胞支架經(jīng)HE染色后，未見明顯細(xì)胞，而N-periosteum樣本則可見明顯的染色后細(xì)胞，表明實(shí)施例的制備方法成功去除了骨膜的大部分細(xì)胞。

圖2A1表示N-periosteum經(jīng)HE染色后的顯微圖(bar＝1cm)，圖2A2表示N-periosteum經(jīng)HE染色后的顯微圖(bar＝100μm)；圖2B1表示D-periosteum經(jīng)HE染色后的顯微圖(bar＝1cm)，圖2B2表示D-periosteum經(jīng)HE染色后的顯微圖(bar＝100μm)。

(三)N-periosteum、D-periosteum和ADM-GMS D-periosteum的電鏡觀察

將樣品N-periosteum、D-periosteum和ADM-GMS D-periosteum均用含2.5％戊二醛的PBS溶液固化12h，然后用乙醇梯度干燥(依次用50％,70％,80％,95％和100％的乙醇分別干燥15min)，然后用真空干燥箱(HMDS,Sigma,USA)干燥，對干燥后的樣品噴金。用S-3000N掃描電鏡(HITACHI,Japan)進(jìn)行觀察。電鏡圖如圖3A1，圖3A2，圖3B1，圖3B2，圖3C1，圖3C2，圖3D1，圖3D2，圖3E，圖3F1和圖3F2所示。

圖3A1和圖3A2表示N-periosteum Fibrous層的電鏡圖，圖3B1和圖3B2表示N-periosteum Cambium層的電鏡圖；圖3C1和圖3C2表示D-periosteum Fibrous層的電鏡圖，圖3D1和圖3D2表示D-periosteum Cambium層的電鏡圖；圖3E表示ADM-GMS的電鏡圖；圖3F1和圖3F2表示ADM-GMS D-periosteum的電鏡圖。(bar＝20μm)。

由電鏡圖可以看出，與N-periosteum相比，D-periosteum的Fibrous層和Cambium層更為光滑；在ADM-GMS D-periosteum中，ADM-GMS成球形，平均直徑為21.3μm，ADM-GMS粘附于D-periosteum上。

效果例2 D-periosteum的DNA含量分析

此外，還通過DNA含量分析對D-periosteum的去細(xì)胞程度進(jìn)行了檢測。將D-periosteum和N-periosteum樣本凍干后，切割成小塊，用蛋白酶K和Rnase水解4h后，對其進(jìn)行DNA含量分析。

結(jié)果如圖4所示，D-periosteum的DNA含量顯著低于N-periosteum，同樣表明實(shí)施例1的制備方法成功去除了骨膜的大部分細(xì)胞成分。

效果例3 N-periosteum、D-periosteum和ADM-GMS D-periosteum的吸水性

將N-periosteum、D-periosteum和ADM-GMS D-periosteum樣本用足量PBS在4℃下浸泡12h，然后凍干至恒重，記錄凍干前和凍干后的質(zhì)量，計(jì)算膨脹率。

膨脹率(％)＝(Ws-Wd)/Wd

其中，Ws代表凍干前的質(zhì)量，Wd代表凍干前的質(zhì)量。

測定結(jié)果如圖5所示，由圖5可以看出，由于去除了細(xì)胞組織，D-periosteum較N-periosteum相比，在吸水性上有很大的提升；而用戊二醇交聯(lián)ADM-GMS后制備的ADM-GMS D-periosteum則比D-periosteum更緊密，ADM-GMS D-periosteum的吸水性也比D-periosteum有所降低。

效果例4 ADM-GMS和ADM-GMS D-periosteum的載藥量和體外釋放曲線的測定

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取阿霉素5mg，配制成25mL含有0.05％胰酶的溶液，在磁力攪拌機(jī)中37℃中，緩慢攪拌48h。分別取1mL、2mL、4mL、6mL、10mL，定容到10mL，測定每個濃度的溶液于482nm處測量吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，結(jié)果如圖6所示。

(2)載藥量的測定：稱取ADM-GMS 100mg，配制成30mL含有0.05％胰酶的溶液，37℃條件下，磁力攪拌2h，攪拌速度600r/min，微球完全溶解，測定溶液在482nm處測量吸光度，結(jié)合上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算ADM-GMS的載藥量。

按照同樣的方法測定ADM-GMS D-periosteum的載藥量。最終測得ADM-GMS的載藥量為19.9μg/mg，ADM-GMS D-periosteum的載藥量為6.2μg/mg。

(3)體外釋放曲線的測定：精密稱取ADM-GMS 300mg分散于300mL PH7.4PBS中。水浴恒溫于(37±0.5℃)，攪拌速度為100r/min，定時(shí)取樣200μL，同時(shí)補(bǔ)充同體積PBS，以同樣操作的明膠微球作為空白，482nm處測量吸光度，結(jié)合上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算ADM-GMS累積釋藥百分?jǐn)?shù)，繪制體外釋放曲線。

用同樣的方法測定ADM-GMS D-periosteum的體外釋放速率，數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 ADM、ADM-GMS和ADM-GMS D-periosteum的累積釋藥百分?jǐn)?shù)

將表1的數(shù)據(jù)繪制曲線，如圖7所示，由圖7可以看出，ADM-GMS D-periosteum的藥物釋放過程具有緩釋的特性，于兩小時(shí)左右藥物基本全部釋放。此外，ADM-GMS D-periosteum的藥物釋放速率與ADM-GMS的藥物釋放速率基本一致，表明D-periosteum的聯(lián)合不會對ADM-GMS中藥物的釋放產(chǎn)生顯著的影響。

效果例5細(xì)胞毒性檢測

(一)D-periosteum毒性檢測

(1)成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

取大鼠關(guān)節(jié)處結(jié)締組織，剪切成2×2cm左右的塊狀，用PBS(含100U/mL青霉素和100mg/mL鏈霉素)清洗三次，加入3mL 0.25％胰酶37℃消化20min，然后加入6mL高糖培養(yǎng)基HAMF12(DMEM/F12,Gibco,USA)(含10％FBS)，10000r/min離心5min，棄上清后，細(xì)胞沉淀用高糖培養(yǎng)基HAMF12(含20％FBS，100U/mL青霉素，100mg/mL鏈霉素)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37℃，5％CO₂，此后按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，傳代三次后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(2)CCK8檢測

D-periosteum樣本用PBS(含100U/mL青霉素和100mg/mL鏈霉素)浸泡24h后剪切成塊狀，加入50mL高糖培養(yǎng)基HAMF12(含20％FBS)備用。

成骨細(xì)胞按照5×10³cells/well的密度接種于96孔板中，用HAMF12(含10％FBS)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組中加入上述D-periosteum樣本，對照組中加入相同體積的培養(yǎng)基。分別于第1，3，5和7天時(shí)，用CCK8試劑盒(CCK-8,DOJINDO,Japan)測定細(xì)胞活性。結(jié)果如圖8所示。

圖8的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，D-periosteum沒有對成骨細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制作用，而且在第1天和第3天，D-periosteum反而促進(jìn)了細(xì)胞的增長。這表明，本發(fā)明制備出了合格的、符合要求的骨膜去細(xì)胞支架。

(二)ADM-GMS D-periosteum毒性檢測

按照上述D-periosteum毒性檢測的方法，將成骨細(xì)胞按照5×10⁵cells/well的密度接種于96孔板中，并分成五個實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)中，共包含5個實(shí)驗(yàn)組，各實(shí)驗(yàn)組在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)所用的培養(yǎng)基如下，

對照組(Control組)：HAMF12(含10％FBS)；

ADM組：用HAMF12(含10％FBS)+20mg/L ADM；

ADM-GMS組：用HAMF12(含10％FBS)+1g/L ADM-GMS；

ADM-GMS D-periosteum組：用HAMF12(含10％FBS)+4g/L ADM-GMS D-periosteum；

GMS D-periosteum組：用HAMF12(含10％FBS)+4g/L GMS D-periosteum。

對上述五組實(shí)驗(yàn)組，分別于2h，12h和24h用CCK8試劑盒測定細(xì)胞活性。結(jié)果如圖9所示。圖9的柱形圖中，每個時(shí)刻的五個柱形圖從左到右，依次為Control組、ADM組、ADM-GMS組、ADM-GMS D-periosteum組和GMS D-periosteum組。

其中，將ADM組、ADM-GMS組和ADM-GMS D-periosteum組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)列于表2，并繪制曲線如圖10所示。

表2 CCK-8實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

由圖10可知，ADM-GMS D-periosteum能夠抑制成骨細(xì)胞的增殖，而且D-periosteum與ADM-GMS聯(lián)合之后，并沒有降低ADM-GMS對成骨細(xì)胞的抑制作用。

以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，按照本發(fā)明提供的方法制備的聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架的阿霉素明膠微球，阿霉素作為治療藥物，以明膠微球作為載體，并聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架上，具有抑制成骨細(xì)胞增殖的作用。其阿霉素的體外釋放速率具有緩釋的特性，于2h左右藥物基本釋放完全，且在體外能夠抑制成骨細(xì)胞的增殖，預(yù)示著其在治療骨肉瘤疾病中的作用。此外，由于骨膜的存在，將會有利于促進(jìn)骨組織的再生，對骨肉瘤治療過程造成的骨缺損有一定的緩解作用。

本發(fā)明提供的聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架的阿霉素明膠微球，在保證了阿霉素治療骨肉瘤疾病效果的同時(shí)，聯(lián)合了骨膜，有助于骨組織再生，增加了治療效果。

此外，本發(fā)明提供的聯(lián)合于骨膜去細(xì)胞支架的阿霉素明膠微球，還可進(jìn)一步與其他藥物進(jìn)行聯(lián)合，增大治療的效果，為骨肉瘤的治療提供了一種新的方法以及思路。

最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。