本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體是指一種自組裝溶菌酶多層膜制備方法。

背景技術(shù)：

層層自組裝技術(shù)是一種有效制備薄膜的方法，可適用于多種材料的組裝，操作簡(jiǎn)單，易于控制。其中聚電解質(zhì)層層自組裝技術(shù)是通過(guò)將基底在陰陽(yáng)離子聚電解質(zhì)溶液中交替浸泡，從而在基底表面制備聚電解質(zhì)薄膜。自組裝過(guò)程的結(jié)合力主要包括共價(jià)鍵，配位鍵，電荷轉(zhuǎn)移，氫鍵和靜電引力等形式的作用力。層層自組裝技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)在玻璃，鈦合金，陶瓷,石英，單晶硅片，云母，金，銀，氧化鋁以及聚合物等底上的組裝，并且基底形狀不受限制。目前，層層自組裝技術(shù)得到了很大發(fā)展，制備自組裝膜的聚合物也從聚電解質(zhì)擴(kuò)展到蛋白質(zhì)，dna，染料分子，納米顆粒，膠束等等。

隨著組織工程的發(fā)展,組裝工程材料表面的生物相容性的改善已成為生物醫(yī)用材料研究的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。層層自組裝由于具有溫和的組裝條件,對(duì)生物分子和基材的廣泛適應(yīng)性及其能在納米和亞微米尺度設(shè)計(jì)的可調(diào)性等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)越來(lái)越多地被應(yīng)用于組織工程材料的表面改性中。然而，植入體表面若促進(jìn)細(xì)胞粘附生長(zhǎng)，往往也有利于細(xì)菌，因?yàn)榧?xì)菌與細(xì)胞有較多相同的粘合機(jī)制。臨床上，植入體感染是最常見(jiàn)的并發(fā)癥。細(xì)菌粘附在植入體表面，逐漸形成細(xì)菌生物被膜，引發(fā)嚴(yán)重的醫(yī)源性感染。因此，組裝工程材料面臨的挑戰(zhàn)是提高細(xì)胞相容性的同時(shí)還具有抗菌能力。

溶菌酶是一種糖苷水解酶（又稱胞壁質(zhì)酶），主要通過(guò)破壞細(xì)胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡萄糖胺之間的β-1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性粘多糖分解，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁破裂。溶菌酶化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有有抗菌、抗病毒、止血、消腫止痛及加快組織功能恢復(fù)等作用，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。目前，鄧紅兵等利用靜電紡絲技術(shù)以及靜電層層組裝技術(shù)制備出溶菌酶和絲蛋白修飾的纖維素納米纖維膜（申請(qǐng)?zhí)枮閏n201310456538.9）。馬余強(qiáng)等通過(guò)溶液澆鑄法制備得到氧化石墨烯/溶菌酶抗菌納米復(fù)合薄膜材料（申請(qǐng)?zhí)枮閏n201010610000.5）。與上述發(fā)明相比，本發(fā)明采用植物多酚和溶菌酶分子間強(qiáng)氫鍵作用進(jìn)行自組裝結(jié)合，制備過(guò)程更加簡(jiǎn)單溫和，可適用于多種基底的表面改性。

綜上，目前還沒(méi)有現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)公開(kāi)將溶菌酶與植物多酚利用分子間強(qiáng)氫鍵作用進(jìn)行自組裝獲得有抗菌性和生物相容性的生物多層膜的技術(shù)方案，因此有必要對(duì)此進(jìn)行改進(jìn)和創(chuàng)新。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，而提供一種具有抗菌性和生物相容性的自組裝溶菌酶多層膜制備方法，該制備方法，利用植物多酚和溶菌酶分子間的氫鍵作用，采用層層自組裝的方法，制備出具有生物活性和抗菌性的溶菌酶多層膜。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是包括如下步驟：

（1）自組裝膜的基材預(yù)處理

將基材進(jìn)行表面處理后，浸入到濃度為0.01～10mg/ml的陽(yáng)離子聚電解質(zhì)溶液中自組裝形成底層；

（2）植物多酚水溶液的配制

在緩沖溶液中，調(diào)節(jié)ph4-11，依次加入氯化鈉、抗壞血酸和植物多酚，攪拌至完全溶解，配置成濃度為0.01～50mg/ml的植物多酚水溶液；

（3）溶菌酶水溶液的配制

在緩沖溶液中，調(diào)節(jié)ph4-11，依次加入氯化鈉、抗壞血酸和溶菌酶，攪拌至完全溶解，配置成濃度為0.01～50mg/ml的溶菌酶水溶液；

（4）自組裝多層膜的制備

把經(jīng)過(guò)步驟（1）處理基材浸入到經(jīng)過(guò)步驟（2）制備的植物多酚水溶液中，平衡吸附后用步驟（2）中緩沖溶液洗去游離的植物多酚，再浸入到經(jīng)過(guò)步驟（3）制備的溶菌酶水溶液中，平衡吸附后用步驟（3）中緩沖溶液洗去游離的溶菌酶，植物多酚與溶菌酶通過(guò)氫鍵作用進(jìn)行層層自組裝；

（5）多次循環(huán)操作步驟（4），得到自組裝溶菌酶多層膜。

進(jìn)一步設(shè)置是陽(yáng)離子聚電解質(zhì)為聚乙烯亞胺(pei)或聚烯丙胺鹽酸鹽(pah)。

進(jìn)一步設(shè)置是所述緩沖溶液為1~50mmna2hpo4-nah2po4緩沖溶液或1~50mm醋酸-醋酸鈉緩沖液或1~50mmhepes緩沖溶液的一種。

進(jìn)一步設(shè)置是基材為陶瓷、鎳合金、鎂合金、鈦合金、不銹鋼、石英片、玻璃片、金、銀、氧化鋁中的任一種。

進(jìn)一步設(shè)置是植物多酚為單寧酸、咖啡酸、雞納酸、茶多酚、兒茶素，葡萄籽多酚、仙鶴素、地榆素、玫瑰素、老鸛草素、云實(shí)素、柯子酸，月見(jiàn)草素、蝦子花素、石榴素或山茱萸素中的任一種。

進(jìn)一步設(shè)置是所述的抗壞血酸，濃度為1~50mm。

進(jìn)一步設(shè)置是所述的氯化鈉濃度為0.01~0.5mol/l。

本發(fā)明通過(guò)層層自組裝技術(shù)把溶菌酶直接固定在材料表面,使材料的細(xì)胞相容性和抗菌性顯著提高，是一種高效方法,可以有效克服傳統(tǒng)抗菌素的耐藥性問(wèn)題。

本發(fā)明采用植物多酚和溶菌酶的分子間強(qiáng)氫鍵作用作為沉積過(guò)程的推動(dòng)力。該自組裝膜的主體部分沒(méi)有使用聚陽(yáng)離子，可以有效減少傳統(tǒng)自組裝膜中多層聚陽(yáng)離子對(duì)細(xì)胞所產(chǎn)生的傷害。該多層膜主要由植物多酚和溶菌酶成，生物相容性好，可以顯著促進(jìn)人體細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)與增殖。其中溶菌酶具有抗菌作用，且不會(huì)產(chǎn)生耐藥性。將該自組裝多層膜裝飾在人體植入材料表面，能顯著提高植入材料的生物相容性和抗菌性，應(yīng)用前景十分廣闊。

本發(fā)明的創(chuàng)新機(jī)理是：

植物多酚分子中具有大量酚羥基和溶菌酶分子中的酰胺鍵可以形成穩(wěn)定的氫鍵作用。自組裝多層膜中溶菌酶提供細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，可以顯著地促進(jìn)細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。單寧酸和溶菌酶都具有抗菌性，能夠長(zhǎng)時(shí)間抗菌而不會(huì)產(chǎn)生耐藥性。在生理環(huán)境條件下,該層層組裝的溶菌酶多層膜具有良好的穩(wěn)定性，同時(shí)具有生物相容性和抗菌性，方法簡(jiǎn)單易行，條件溫和，符合環(huán)保要求。本發(fā)明的多層膜可用于植入材料和器件的生物界面構(gòu)建，提高醫(yī)用植入體的生物活性和抗菌性。

下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步介紹。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明實(shí)施例1（單寧酸和溶菌酶）的qcm測(cè)試圖，從qcm測(cè)試圖看出，單寧酸和溶菌酶可以進(jìn)行連續(xù)組裝。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定，該領(lǐng)域的技術(shù)工程師可根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。

實(shí)施例1

本實(shí)施例包括如下步驟：

（1）自組裝膜的基材預(yù)處理

將玻璃進(jìn)行表面處理后，浸入到濃度為0.01mg/ml的聚乙烯亞胺溶液中自組裝形成底層；

（2）植物多酚水溶液的配制

配置10mm的hepes緩沖液10ml，ph=4，依次加入抗壞血酸至5mm和單寧酸（ta）至0.01mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度0.01mg/ml的單寧酸水溶液；

（3）蛋白質(zhì)水溶液的配制

配置10mm的hepes緩沖液10ml，調(diào)節(jié)ph至4，，依次加入5mm至抗壞血酸和溶菌酶至0.01mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度為0.01mg/ml的溶菌酶水溶液；

（4）自組裝多層膜的制備

把經(jīng)過(guò)步驟（1）處理基材浸入到經(jīng)過(guò)步驟（2）制備的單寧酸的水溶液中，平衡吸附后用步驟（2）中緩沖溶液洗去游離的植物多酚，再浸入到經(jīng)過(guò)步驟（3）制備的蛋白質(zhì)水溶液中，平衡吸附后用步驟（3）中緩沖溶液洗去游離的蛋白質(zhì)，利用單寧酸與溶菌酶通過(guò)氫鍵作用進(jìn)行層層自組裝，如此循環(huán)10次，得到自組裝蛋白質(zhì)多層膜。

如圖1可知，單寧酸和溶菌酶可以進(jìn)行連續(xù)組裝，形成蛋白質(zhì)多層膜。

實(shí)施例2

本實(shí)施例包括如下步驟：

（1）自組裝膜的基材預(yù)處理

將玻璃進(jìn)行表面處理后，浸入到濃度為1mg/ml的聚乙烯亞胺溶液中自組裝形成底層；

（2）植物多酚水溶液的配制

配置50mm的hepes緩沖液，ph=6，依次加入氯化鈉至0.15mol/l，抗壞血酸至10mm和單寧酸（ta）至1mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度1mg/ml的單寧酸水溶液；

（3）蛋白質(zhì)水溶液的配制

配置50mm的hepes緩沖液，ph=6，依次加入氯化鈉至0.15mol/l，抗壞血酸至10mm和溶菌酶至1mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度為1mg/ml的溶菌酶水溶液；

（4）自組裝多層膜的制備

把經(jīng)過(guò)步驟（1）處理基材浸入到經(jīng)過(guò)步驟（2）制備的單寧酸的水溶液中，平衡吸附后用步驟（2）中緩沖溶液洗去游離的單寧酸，再浸入到經(jīng)過(guò)步驟（3）制備的蛋白質(zhì)水溶液中，平衡吸附后用步驟（3）中緩沖溶液洗去游離的蛋白質(zhì)，利用單寧酸與溶菌酶通過(guò)氫鍵作用進(jìn)行層層自組裝，如此循環(huán)4次，得到自組裝蛋白質(zhì)多層膜。

實(shí)施例3

本實(shí)施例包括如下步驟：

（1）自組裝膜的基材預(yù)處理

將玻璃進(jìn)行表面處理后，浸入到濃度為10mg/ml的聚乙烯亞胺溶液中自組裝形成底層；

（2）單寧酸水溶液的配制

配置50mm的hepes緩沖液，ph=8，依次加入氯化鈉至0.5mol/l，抗壞血酸至50mm和單寧酸（ta）至10mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度10mg/ml的單寧酸水溶液；

（3）溶菌酶水溶液的配制

配置50mm的hepes緩沖液，ph=8，依次加入氯化鈉至0.5mol/l，抗壞血酸至50mm和溶菌酶至10mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度為10mg/ml的溶菌酶水溶液；

（4）自組裝多層膜的制備

把經(jīng)過(guò)步驟（1）處理基材浸入到經(jīng)過(guò)步驟（2）制備的單寧酸的水溶液中，平衡吸附后用步驟（2）中緩沖溶液洗去游離的植物多酚，再浸入到經(jīng)過(guò)步驟（3）制備的溶菌酶水溶液中，平衡吸附后用步驟（3）中緩沖溶液洗去游離的溶菌酶，利用單寧酸與溶菌酶通過(guò)氫鍵作用進(jìn)行層層自組裝，如此循環(huán)20次，得到自組裝蛋白質(zhì)多層膜。

實(shí)施例4

本實(shí)施例包括如下步驟：

（1）自組裝膜的基材預(yù)處理

將玻璃進(jìn)行表面處理后，浸入到濃度為0.01mg/ml的聚乙烯亞胺溶液中自組裝形成底層；

（2）植物多酚水溶液的配制

配置10mm的na2hpo4-nah2po4緩沖溶液，ph=9，依次加入抗壞血酸至1mm和單寧酸（ta）至0.01mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度0.01mg/ml的單寧酸水溶液；

（3）蛋白質(zhì)水溶液的配制

配置10mm的na2hpo4-nah2po4緩沖溶液，ph=9，，依次加入抗壞血酸至1mm和溶菌酶至0.01mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度為0.01mg/ml的溶菌酶水溶液；

（4）自組裝多層膜的制備

把經(jīng)過(guò)步驟（1）處理基材浸入到經(jīng)過(guò)步驟（2）制備的單寧酸的水溶液中，平衡吸附后用步驟（2）中緩沖溶液洗去游離的植物多酚，再浸入到經(jīng)過(guò)步驟（3）制備的蛋白質(zhì)水溶液中，平衡吸附后用步驟（3）中緩沖溶液洗去游離的蛋白質(zhì)，利用單寧酸與溶菌酶通過(guò)氫鍵作用進(jìn)行層層自組裝，如此循環(huán)30次，得到自組裝蛋白質(zhì)多層膜。

如圖1可知，單寧酸和溶菌酶可以進(jìn)行連續(xù)組裝，形成蛋白質(zhì)多層膜。

實(shí)施例5

本實(shí)施例包括如下步驟：

（1）自組裝膜的基材預(yù)處理

將玻璃進(jìn)行表面處理后，浸入到濃度為10mg/ml的聚乙烯亞胺溶液中自組裝形成底層；

（2）植物多酚水溶液的配制

配置50mm的na2hpo4-nah2po4緩沖溶液，ph=11，依次加入氯化鈉至0.15mol/l，抗壞血酸至50mm和單寧酸（ta）至50mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度50mg/ml的單寧酸水溶液；

（3）蛋白質(zhì)水溶液的配制

配置50mm的na2hpo4-nah2po4緩沖溶液，ph=11，依次加入氯化鈉至0.15mol/l，抗壞血酸至50mm和溶菌酶至50mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度為50mg/ml的溶菌酶水溶液；

（4）自組裝多層膜的制備

把經(jīng)過(guò)步驟（1）處理基材浸入到經(jīng)過(guò)步驟（2）制備的單寧酸的水溶液中，平衡吸附后用步驟（2）中緩沖溶液洗去游離的單寧酸，再浸入到經(jīng)過(guò)步驟（3）制備的蛋白質(zhì)水溶液中，平衡吸附后用步驟（3）中緩沖溶液洗去游離的蛋白質(zhì)，利用單寧酸與溶菌酶通過(guò)氫鍵作用進(jìn)行層層自組裝，如此循環(huán)50次，得到自組裝蛋白質(zhì)多層膜。

實(shí)施例6

本實(shí)施例包括如下步驟：

（1）自組裝膜的基材預(yù)處理

將玻璃進(jìn)行表面處理后，浸入到濃度為5mg/ml的聚乙烯亞胺溶液中自組裝形成底層；

（2）單寧酸水溶液的配制

配置50mm的na2hpo4-nah2po4緩沖溶液，ph=14，依次加入氯化鈉至0.05mol/l，抗壞血酸至50mm和單寧酸（ta）至50mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度50mg/ml的單寧酸水溶液；

（3）溶菌酶水溶液的配制

配置50mm的na2hpo4-nah2po4緩沖溶液，ph=14，依次加入氯化鈉至0.05mol/l，抗壞血酸至50mm和溶菌酶至50mg/ml，攪拌至完全溶解，配置成濃度為50mg/ml的溶菌酶水溶液；

（4）自組裝多層膜的制備

把經(jīng)過(guò)步驟（1）處理基材浸入到經(jīng)過(guò)步驟（2）制備的單寧酸的水溶液中，平衡吸附后用步驟（2）中緩沖溶液洗去游離的植物多酚，再浸入到經(jīng)過(guò)步驟（3）制備的溶菌酶水溶液中，平衡吸附后用步驟（3）中緩沖溶液洗去游離的溶菌酶，利用單寧酸與溶菌酶通過(guò)氫鍵作用進(jìn)行層層自組裝，如此循環(huán)100次，得到自組裝蛋白質(zhì)多層膜。