本發(fā)明屬于干細(xì)胞培養(yǎng)液化妝品領(lǐng)域，涉及一種HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉，還涉及了該凍干粉的制備方法，及其在化妝品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：干細(xì)胞美容最早是在整形外科中的應(yīng)用，而整形外科中應(yīng)用的較多的干細(xì)胞種類(lèi)是間充質(zhì)干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞及前脂肪細(xì)胞等。傳統(tǒng)上所謂的干細(xì)胞美容術(shù)，一般都是直接注射干細(xì)胞針劑。而這種注射用干細(xì)胞的來(lái)源主要是從流產(chǎn)的胚胎中提取的，所以難免會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)，而且存在一定的倫理問(wèn)題。即使是采用自體干細(xì)胞，但是在干細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增過(guò)程中會(huì)引入外源性的蛋白(胎牛血清)，容易引起免疫排斥反應(yīng)。人間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell，MSC)在培養(yǎng)中分泌堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)在內(nèi)的多種促進(jìn)皮膚細(xì)胞再生的生長(zhǎng)因子。這些具有生物活性的生長(zhǎng)因子能夠有效的促進(jìn)皮膚細(xì)胞的新陳代謝；促進(jìn)細(xì)胞外透明質(zhì)酸、糖蛋白等大分子的合成和分泌，增強(qiáng)皮膚的親水性；促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和修復(fù)，使衰老死亡的細(xì)胞得以及時(shí)補(bǔ)充；同時(shí)能夠加速角質(zhì)層修復(fù)，加速基底新老細(xì)胞更替，使肌膚回到年輕姿態(tài)。液態(tài)的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清在常溫保存時(shí)間很短，細(xì)胞生長(zhǎng)因子易失活，即使是通過(guò)冷凍干燥技術(shù)除去水分做成凍干粉，也很難直接添加到各種劑型的化妝品中，因此在很大程度上限制了其在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉，解決液態(tài)干細(xì)胞培養(yǎng)上清保存期有限這一瓶頸，同時(shí)解決干細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性保存問(wèn)題。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述人臍帶MSC無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的提供上述人臍帶MSC無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉的應(yīng)用，解決現(xiàn)有美容用人臍帶MSC培養(yǎng)液難以直接加入化妝品的問(wèn)題。本發(fā)明所采用的第一個(gè)技術(shù)方案是，一種HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉，按質(zhì)量百分比包括以下組分：人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液活性蛋白成分5～12％，CS(殼聚糖)20～65％，TPP(三聚磷酸鈉)1～15％，HA(透明質(zhì)酸)20～65％，水≤5％，以上各組分的質(zhì)量總和是100％。本發(fā)明所采用的第二個(gè)技術(shù)方案是，上述HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉的制備方法，包括以下步驟：步驟1，制備負(fù)載人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒；將人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液加入CS酸溶液中，并加入TPP，室溫反應(yīng)。將反應(yīng)后的納米粒混懸液離心，所得沉淀洗滌、冷凍干燥，得到負(fù)載人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒。步驟2，制備HA修飾的負(fù)載人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉；對(duì)HA中的羧基進(jìn)行活化，然后將負(fù)載人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒加入到活化后的HA中反應(yīng)，取反應(yīng)后的納米混懸液，離心，所得沉淀洗滌并冷凍干燥，即得HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉。其中，步驟1中人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液的制備方法為：取新生兒臍帶，將靜脈內(nèi)血跡洗滌干凈；去除表皮、兩條動(dòng)脈血管及一條靜脈血管，將組織剪碎，加入含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；當(dāng)細(xì)胞融合度為80％-90％時(shí)，胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代培養(yǎng)，取傳代細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度80％-90％時(shí)，棄含F(xiàn)BS的培養(yǎng)上清，PBS洗滌細(xì)胞，加入無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，收集無(wú)血清培養(yǎng)液。殼聚糖(CS)又叫脫乙酰甲殼素，可溶性甲殼素和聚氨基葡萄糖等，其化學(xué)名為β-(1-4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖，系甲殼素用濃堿處理后脫去乙酰基而得到的產(chǎn)物。殼聚糖是天然高分子中少有的堿性多糖，不溶于水和有機(jī)溶劑，可溶于pH＜6.5的稀酸，在稀酸中，其葡萄糖氨基轉(zhuǎn)化為R-NH3+,形成聚陽(yáng)離子凝膠溶液。殼聚糖具有優(yōu)良的生物可降解性、低毒、良好的生物相容性，因此非常適合用于生物醫(yī)藥及化妝品行業(yè)。本發(fā)明采用離子交聯(lián)法制備CS納米粒，利用無(wú)不良反應(yīng)的三聚磷酸鈉(TPP)對(duì)CS進(jìn)行離子誘導(dǎo)凝膠化形成納米粒。在攪拌下，將TPP溶液加入到CS的酸溶液中，通過(guò)帶負(fù)電的磷酸根離子與CS分子鏈上帶正電的質(zhì)子化氨基發(fā)生分子內(nèi)和分子間交聯(lián)凝膠化，便可迅速生成納米粒。透明質(zhì)酸(HA)是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的高分子多糖，是最佳的保濕成分之一。在一定的pH值條件下，透明質(zhì)酸帶負(fù)電荷，而CS納米粒帶正電荷，兩者之間能夠通過(guò)靜電力相互吸引，使CS納米粒具有良好的保濕作用。本發(fā)明的特點(diǎn)還在于：優(yōu)選地，步驟1中CS和人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液中活性蛋白的質(zhì)量比為2:1～10:1，CS與TPP的質(zhì)量比為2:1～5:1，CS的分子量為2-30萬(wàn)。優(yōu)選地，步驟1所述CS酸溶液中用于溶解CS的酸是甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、抗壞血酸、草酸、丁二酸、丙二酸、脂肪酸、丙酮酸、戊二酸、酒石酸、天冬氨酸、水楊酸或乙醇酸中的一種或幾種。優(yōu)選地，步驟1中離心參數(shù)為：離心溫度2～8℃，離心時(shí)間10～60min，離心力1.0×103～1.0×105g。優(yōu)選地，步驟2中HA的分子量為8-30Kda，HA和負(fù)載人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒的質(zhì)量比為1:1～5:1。優(yōu)選地，步驟2中HA的羧基活化方法為，采用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)對(duì)HA中的羧基進(jìn)行活化，然后調(diào)節(jié)pH至7.5，37℃孵育。優(yōu)選地，步驟1和步驟2中冷凍干燥參數(shù)均為：預(yù)凍溫度-60℃±2℃，預(yù)凍時(shí)間6h以上，冷凍溫度-50～-56℃，真空度≤80mT，凍干時(shí)間24-36h。本發(fā)明所采用的第三個(gè)技術(shù)方案是，上述人臍帶MSC無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉在化妝品中的應(yīng)用。制備化妝品時(shí)，將上述HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉水化后，直接加入化妝品中。該凍干粉可直接添加于常見(jiàn)的乳液、霜膏、精華液、凝膠等多種劑型的化妝品。本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明所用的干細(xì)胞培養(yǎng)上清液為無(wú)血清培養(yǎng)上清，減小了干細(xì)胞用于美容中存在的免疫排斥反應(yīng)。(2)采用CS納米粒制備工藝將具有多種活性細(xì)胞因子的干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)上清液包覆，進(jìn)而凍干，保質(zhì)期可長(zhǎng)達(dá)三年，遠(yuǎn)高于現(xiàn)有人間充質(zhì)干細(xì)胞的保質(zhì)期，解決了上清液保存期短的問(wèn)題。(3)CS納米粒表面的活性氨基與HA表面的羧基發(fā)生共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)，制得HA修飾CS納米粒，這樣不僅解決了CS納米粒穩(wěn)定性差的問(wèn)題，同時(shí)在CS納米粒中引入了化妝品高效保濕劑HA。(4)本發(fā)明所用的CS作為一種天然堿性多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，安全性較高、成本低廉，采用CS制備納米粒，反應(yīng)條件溫和，工藝簡(jiǎn)單、成本低。(5)經(jīng)CS納米粒包覆后的干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)上清液可直接添加于乳液、霜膏、精華液、凝膠等多種劑型的化妝品，拓寬了其在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉的制備方法流程圖；圖2MSC-CS-NPs和HA-MSC-CS-NPs48h流式細(xì)胞測(cè)定結(jié)果；圖3MSC-CS-NPs和HA-MSC-CS-NPs72h流式細(xì)胞測(cè)定結(jié)果；圖4MSC-CS-NPs和HA-MSC-CS-NPs48h和72h正?；罴?xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)百分比；圖5MSC-CS-NPs和HA-MSC-CS-NPs48h和72h早期凋亡細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)百分比；圖6Rz和Ra結(jié)果(產(chǎn)品區(qū)、對(duì)照區(qū)與初始值的比較)比較圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施方式。實(shí)施例1制備一種HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉，參照?qǐng)D1，其方法如下：步驟(1)，制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提?。簾o(wú)菌條件下，取新生兒臍帶5～10cm，置臍帶保存液，4℃儲(chǔ)存(時(shí)間不超過(guò)8小時(shí))。用D-Hanks液沖洗直至靜脈內(nèi)無(wú)血跡。去除表皮、兩條動(dòng)脈血管及一條靜脈血管，將組織剪碎至大約1mm3/塊，加入含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基(含雙抗)培養(yǎng)大約一個(gè)星期，培養(yǎng)條件為37℃、飽和濕度、5％CO2，即可得到原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。收集無(wú)血清培養(yǎng)液：細(xì)胞融合度80％時(shí)，胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代培養(yǎng)，取6代的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度80％時(shí)，棄含10％FBS的培養(yǎng)上清，PBS(pH＝7.0)洗滌細(xì)胞三次，加入無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，收集無(wú)血清培養(yǎng)液。步驟(2)，離子交聯(lián)法制備負(fù)載人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒稱(chēng)取分子量為2萬(wàn)的CS粉末25mg，溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的25mL醋酸溶液中，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的CS溶液，超聲脫除氣泡，然后過(guò)0.45μm水系濾膜，得到澄清透亮的CS溶液。將活性蛋白濃度為998μg/mL的2.5mL人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液緩慢滴加到CS溶液中，攪拌10min，得混合液。將0.2％的TPP溶液5mL滴加至上述混合液中，室溫反應(yīng)30min。其中CS與TPP的質(zhì)量比為2.5:1，CS與人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液中活性蛋白的質(zhì)量比為10:1。將反應(yīng)后的納米?；鞈乙焊咚匐x心，離心溫度4℃，離心時(shí)間10min，離心力1.0×105g。離心所得沉淀用蒸餾水洗滌3次，然后進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥參數(shù)為：預(yù)凍溫度-60℃±2℃，預(yù)凍時(shí)間6h以上，冷凍溫度-50～-56℃，真空度≤80mT，凍干時(shí)間24h。冷凍干燥后得負(fù)載人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒。步驟(3)，HA活化；配制分子量為8KDa的HA濃度為0.05％的HA水溶液50mL，加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)137.5mg,待其完全溶解后再加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)165mg，用0.1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH為7.5，37℃孵育1h。步驟(4)，制備HA修飾的負(fù)載人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉將步驟(2)得到的負(fù)載人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒加入到步驟(3)活化后的HA中，HA和CS納米粒的投料質(zhì)量比為1:1。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h，取反應(yīng)后的納米混懸液，高速離心，離心參數(shù)為：離心溫度4℃，離心時(shí)間30min，離心力1.0×104g。所得沉淀用蒸餾水洗滌10次，然后進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥參數(shù)為：預(yù)凍溫度-60℃±2℃，預(yù)凍時(shí)間6h以上，冷凍溫度-50～-56℃，真空度≤80mT，凍干時(shí)間24h。冷凍干燥后即得HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉。本實(shí)施例得到的HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉，通過(guò)測(cè)定清洗CS納米粒液體中及離心上清液中TPP的含量確定已交聯(lián)的TPP的含量，檢測(cè)方法采用分光光度法(GB/T13171-1997)，TPP的投料量為10mg，已交聯(lián)的為6.4mg。通過(guò)檢測(cè)HA的結(jié)合率得知，HA和CS納米粒的結(jié)合率為36.0％，其中，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液活性蛋白成分5.5％CS55.2％，TPP14.1％，HA21.9％，水3.3％。實(shí)施例2制備一種HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉，其方法如下：步驟(1)，制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液，具體方法同實(shí)施例1。其中不同之處在于收集無(wú)血清培養(yǎng)液時(shí)細(xì)胞融合度為85％。步驟(2)，離子交聯(lián)法制備負(fù)載人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒稱(chēng)取分子量為20萬(wàn)的CS粉末20mg，溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0％的10mL檸檬酸溶液中，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％的CS溶液，超聲脫除氣泡，然后過(guò)0.45μm水系濾膜，得到澄清透亮的CS溶液。將活性蛋白濃度為1015μg/mL的9.9mL人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液緩慢滴加到CS溶液中，攪拌20min，得混合液。將0.2％的TPP溶液2.5mL滴加至上述混合液中，室溫反應(yīng)30min。其中CS與TPP的質(zhì)量比為4:1，CS與人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液中活性蛋白的質(zhì)量比為2:1。將反應(yīng)后的納米?；鞈乙焊咚匐x心，離心溫度4℃，離心時(shí)間30min，離心力1.0×104g。離心所得沉淀用蒸餾水洗滌5次，然后進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥參數(shù)為：預(yù)凍溫度-60℃±2℃，預(yù)凍時(shí)間6h以上，冷凍溫度-50～-56℃，真空度≤80mT，凍干時(shí)間30h。冷凍干燥后得負(fù)載人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒。步驟(3)，HA活化；配制分子量為15KDaHA濃度為0.14％的HA水溶液100mL，加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)700mg,待其完全溶解后再加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)840mg，用0.1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH為7.5，37℃孵育5h。步驟(4)，制備HA修飾的負(fù)載人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉將步驟(2)得到的負(fù)載人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒加入到步驟(3)活化后的HA中，HA和CS納米粒的投料比為4.7:1。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)10h，取反應(yīng)后的納米混懸液，高速離心，離心參數(shù)為：離心溫度4℃，離心時(shí)間60min，離心力1.0×103g。所得沉淀用蒸餾水洗滌3次，然后進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥參數(shù)為：預(yù)凍溫度-60℃±2℃，預(yù)凍時(shí)間6h以上，冷凍溫度-50～-56℃，真空度≤80mT，凍干時(shí)間30h。冷凍干燥后即得HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉。本實(shí)施例得到的HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉，通過(guò)測(cè)定清洗CS納米粒液體中及離心上清液中TPP的含量確定已交聯(lián)的TPP的含量，檢測(cè)方法采用分光光度法(GB/T13171-1997)，TPP的投料量為5mg，已交聯(lián)的為3.3mg。檢測(cè)HA的結(jié)合率得知，HA和CS納米粒的結(jié)合率為42.3％，其中，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液活性蛋白成分10.8％，CS21.3％，TPP3.5％，HA63.2％，水1.3％。實(shí)施例3制備一種HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉，其方法如下：步驟(1)，制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液，具體方法同實(shí)施例1。其中不同之處在于收集無(wú)血清培養(yǎng)液時(shí)細(xì)胞融合度為90％。步驟(2)，離子交聯(lián)法制備負(fù)載人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒稱(chēng)取分子量為30萬(wàn)的CS粉末50mg，溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3％的10mL酒石酸溶液中，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％的CS溶液，超聲脫除氣泡，然后過(guò)0.45μm水系濾膜，得到澄清透亮的CS溶液。將活性蛋白濃度為950μg/mL的10.5mL人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液緩慢滴加到CS溶液中，攪拌30min，得混合液。將0.18％的TPP溶液5.5mL滴加至上述混合液中，室溫反應(yīng)30min。其中CS與TPP的質(zhì)量比為5:1，CS與人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液中活性蛋白的質(zhì)量比為5:1。將反應(yīng)后的納米粒混懸液高速離心，離心溫度4℃，離心時(shí)間60min，離心力1.0×103g。離心所得沉淀用蒸餾水洗滌10次，然后進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥參數(shù)為：預(yù)凍溫度-60℃±2℃，預(yù)凍時(shí)間6h以上，冷凍溫度-50～-56℃，真空度≤80mT，凍干時(shí)間36h。冷凍干燥后得負(fù)載人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒。步驟(3)，HA活化；配制分子量為30KDaHA濃度為0.1％的HA水溶液150mL，加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)750mg,待其完全溶解后再加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)900mg，用0.1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH為7.5，37℃孵育10h。步驟(4)，制備HA修飾的負(fù)載人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液殼聚糖納米粒凍干粉將步驟(2)得到的負(fù)載人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒加入到步驟(3)活化后的HA中，HA和CS納米粒的投料比為2.5:1。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，取反應(yīng)后的納米混懸液，高速離心，離心參數(shù)為：離心溫度4℃，離心時(shí)間10min，離心力1.0×105g。所得沉淀用蒸餾水洗滌6次，然后進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥參數(shù)為：預(yù)凍溫度-60℃±2℃，預(yù)凍時(shí)間6h以上，冷凍溫度-50～-56℃，真空度≤80mT，凍干時(shí)間36h。冷凍干燥后即得HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉。本實(shí)施例得到的HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉，通過(guò)測(cè)定清洗CS納米粒液體中及離心上清液中TPP的含量確定已交聯(lián)的TPP的含量，檢測(cè)方法采用分光光度法(GB/T13171-1997)，TPP的投料量為10mg，已交聯(lián)的為6.8mg。檢測(cè)HA的結(jié)合率得知，HA和CS納米粒的結(jié)合率為28.6％，其中，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液活性蛋白成分8.8％，CS44.1％，TPP6.0％，HA37.8％，水3.3％。按照上述方法，在本發(fā)明范圍內(nèi)更改原料組分或調(diào)整工藝參數(shù)，均可制得HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉，且均能添加于化妝品中。對(duì)本發(fā)明的HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉的各項(xiàng)性能進(jìn)行檢測(cè)，樣品組為實(shí)施例1制備出的HA-MSC-CS-NPs，對(duì)照組采用不用HA進(jìn)行修飾的MSC-CS-NPs，其他工藝參數(shù)和實(shí)施例1完全相同。(一)粒徑及粒徑分布表1MSC-CS-NPs和HA-MSC-CS-NPs粒徑分布及PDI組別納米粒粒徑分布/nmPDI對(duì)照組MSC-CS-NPs185.3±25.80.289±0.041樣品組HA-MSC-CS-NPs209.5±14.90.125±0.032從表1可以看出，經(jīng)HA修飾后的MSC-CS-NPs粒徑稍有增大趨勢(shì)，但是PDI指數(shù)明顯減小(PDI是多分散指數(shù)，其大小表示粒徑分布的寬窄)，說(shuō)明HA-MSC-CS-NPs的粒徑分布比對(duì)照組更均一，體系也更趨向于穩(wěn)定。(二)流式細(xì)胞儀考察HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)CS納米粒凍干粉對(duì)細(xì)胞的增殖力。采用小鼠成纖維細(xì)胞L929為靶細(xì)胞，對(duì)比對(duì)照組——人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉(MSC-CS-NPs)，樣品組——HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)液CS納米粒凍干粉(HA-MSC-CS-NPs)在培養(yǎng)48h和72h，對(duì)L929細(xì)胞增殖活力的影響。如圖2、3所示，在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限代表對(duì)于X軸及Y軸所代表的參數(shù)呈雙陰性反應(yīng)的細(xì)胞即正?；罴?xì)胞,右下象限代表對(duì)于X軸所代表的參數(shù)呈陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)于Y軸所代表的參數(shù)呈陰性反應(yīng)的細(xì)胞即早期凋亡細(xì)胞,右上象限代表對(duì)于X軸及Y軸所代表的參數(shù)呈雙陽(yáng)反應(yīng)的細(xì)胞即晚期凋亡及死亡細(xì)胞,左上象限代表對(duì)于Y軸所代表的參數(shù)呈陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)于X軸所代表的參數(shù)呈陰性反應(yīng)的細(xì)胞即碎片及損傷細(xì)胞。如圖4、5所示，與對(duì)照組MSC-CS-NPs比較，HA-MSC-CS-NPs在加入后48h，正?；罴?xì)胞數(shù)為總數(shù)的92.51％，對(duì)照組僅為88.95％，比對(duì)照組高出3.56個(gè)百分點(diǎn)；而早期凋亡細(xì)胞數(shù)為總數(shù)的4.00％，對(duì)照組為8.30％，比對(duì)照組低出4.30個(gè)百分點(diǎn)。與對(duì)照組MSC-CS-NPs比較，HA-MSC-CS-NPs在加入后72h，正常活細(xì)胞數(shù)為總數(shù)的96.13％，對(duì)照組僅為93.05％，比對(duì)照組高出3.08個(gè)百分點(diǎn)；而早期凋亡細(xì)胞數(shù)為總數(shù)的2.38％，對(duì)照組為3.87％，比對(duì)照組低出1.49個(gè)百分點(diǎn)。從這個(gè)結(jié)果可以看出，MSC-CS-NPs中引入HA后，和未修飾的納米粒相比，不僅提高了促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，同時(shí)還具有延緩細(xì)胞凋亡的作用。(三)HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)CS納米粒凍干粉用于化妝品中的抗衰修復(fù)功效評(píng)價(jià)。將本發(fā)明的HA修飾的人臍帶MSC無(wú)血清培養(yǎng)CS納米粒凍干粉(HA-MSC-CS-NPs)添加到護(hù)膚霜中，對(duì)照組采用不添加HA-MSC-CS-NPs的護(hù)膚霜，采用兩款護(hù)膚霜對(duì)48位女性進(jìn)行效果測(cè)試。HA-MSC-CS-NPs護(hù)膚霜的成分見(jiàn)表2。表2HA-MSC-CS-NPs護(hù)膚霜成分表護(hù)膚霜的制備方法為：A相、B相加熱至80℃后，B相緩慢加入A相，攪拌15min，加入C相后攪拌10min，均質(zhì)5min(4000r/min)，降溫(緩慢，降溫速率1℃/min左右，降溫時(shí)攪拌速率不得超過(guò)500r/min)至35℃加入D相，攪拌5min，降溫至30℃加入E相，慢速攪拌5min后出料。受試對(duì)象：48位無(wú)皮膚敏感史的年齡在37～55歲的女性志愿者，測(cè)試期間志愿者隨機(jī)一側(cè)臉部使用對(duì)照產(chǎn)品——不含HA-MSC-CS-NPs的基底護(hù)膚霜(除了不含HA-MSC-CS-NPs，其它成分與HA-MSC-CS-NPs護(hù)膚霜成分完全相同)，另外一側(cè)使用HA-MSC-CS-NPs護(hù)膚霜，每天早晚各使用一次，連續(xù)使用8周，測(cè)試期間志愿者不可使用除測(cè)試產(chǎn)品及對(duì)照產(chǎn)品以外的任何護(hù)膚品。在產(chǎn)品使用前，使用4周和8周后，對(duì)兩側(cè)眼角進(jìn)行皮膚快速光學(xué)成像(FOITS)，并對(duì)圖片進(jìn)行分析，Rz表示皮膚平均粗糙度，Ra表示皮膚算術(shù)平均粗糙度。統(tǒng)計(jì)方法采用ANOVA，顯著性：“+”表示顯著性差異(p≤0.05)；“-”表示非顯著性差異(p＞0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖6和表3。表3Rz和Ra統(tǒng)計(jì)結(jié)果在該功效測(cè)試中，48位受試者無(wú)一有免疫排斥反應(yīng)或不適感。由圖6和表3看出，與初始值比較，產(chǎn)品使用4周后，產(chǎn)品區(qū)的Rz和Ra分別降低了6.2％和11.1％，對(duì)照區(qū)的Rz和Ra分別降低了1.6％和7.0％，產(chǎn)品使用8周后，產(chǎn)品區(qū)的Rz和Ra分別降低了9.6％和20.6％，對(duì)照區(qū)的Rz和Ra分別降低了3.8％和13.4％，與初始值比較，在產(chǎn)品使用4周及8周后，產(chǎn)品區(qū)域Rz(皮膚平均粗糙度)和Ra(皮膚算術(shù)平均粗糙度)均有顯著性差異，對(duì)照區(qū)域Rz(皮膚平均粗糙度)和Ra(皮膚算術(shù)平均粗糙度)均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明含有HA-MSC-CS-NPs的護(hù)膚霜具有顯著改善皮膚粗糙度和紋理的效果，即具有延緩衰老的功效。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3