本發(fā)明涉及組織工程關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)治療領(lǐng)域，具體來說是一種豬源膠原膜-自體軟骨細(xì)胞復(fù)合支架的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)問題比較常見，其發(fā)生在人的各個(gè)年齡階段，關(guān)節(jié)軟骨缺損可導(dǎo)致受傷，關(guān)節(jié)受傷由超出正常的的運(yùn)動引起，或過度使用、肌無力、一般磨損引起，不同的軟骨缺損需要不同的治療。
目前軟骨缺損常用的治療方法包括骨髓刺激法、同種骨軟骨移植、同種軟骨細(xì)胞移植法、自體軟骨細(xì)胞移植、組織工程修復(fù)法等，但這些技術(shù)依然存在各種各樣的問題。
骨髓刺激法破壞軟骨缺損部位的軟骨下骨的連續(xù)性，來自骨髓的基質(zhì)干細(xì)胞及生長因子促進(jìn)軟骨修復(fù)，具體實(shí)施方法有：磨削關(guān)節(jié)成形術(shù)、軟骨下骨鉆孔術(shù)、微骨折術(shù)，其中微骨折術(shù)較為容易實(shí)施，因此應(yīng)用最為廣泛，但修復(fù)結(jié)果并不理想，多數(shù)為纖維軟骨修復(fù)，而不是透明軟骨修復(fù)，纖維軟骨修復(fù)在后期極易引起骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。
同種骨軟骨移植是一種將非負(fù)重區(qū)及非重要關(guān)節(jié)部分的骨或軟骨植入軟骨缺損表面以達(dá)到修復(fù)目的的技術(shù)，具有保持軟骨生物化學(xué)和生物機(jī)械特性的優(yōu)點(diǎn)，但低溫冷凍保存的軟骨極易壞死，且極易出現(xiàn)感染癥狀，而且出現(xiàn)大面積軟骨缺損失時(shí)，很難找到合適的供體軟骨，目前該方法進(jìn)一步優(yōu)化，將缺損區(qū)域清創(chuàng)，從非負(fù)重關(guān)節(jié)區(qū)域取相應(yīng)大小的柱狀軟骨移植到缺損區(qū)域，但這仍然無法修復(fù)大面積軟骨缺損，也有一些移植物會脫落。
同種軟骨細(xì)胞移植法是將分離培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞直接注射到軟骨缺損部位，但修復(fù)效果并不能令人滿意，主要是由于移植軟骨細(xì)胞無法在移植部位固定和生長。后來纖維蛋白膠的應(yīng)用改良了固定的效果，修復(fù)效果也因此得到提高。但同種軟骨細(xì)胞移植可能引起免疫排斥反應(yīng)及感染或引起疾病傳播。
自體軟骨細(xì)胞移植是從關(guān)節(jié)軟骨活體組織中分離軟骨細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增的自體軟骨細(xì)胞注射到缺損區(qū)域并用骨膜瓣覆蓋，優(yōu)點(diǎn)是不存在免疫排斥及感染問題，臨床上應(yīng)用比較容易，缺點(diǎn)是采集軟骨而對正常軟骨造成損傷，且軟骨細(xì)胞分布不均勻等。
組織工程修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損是在體外培養(yǎng)擴(kuò)增軟骨組織細(xì)胞，并且以較高濃度將其種植在具有良好的生物兼容性和降解性的合適支架材料上構(gòu)建組織工程軟骨，然后植入組織缺損部位，軟骨組織工程有三個(gè)要素：一定數(shù)量的種子細(xì)胞、合適的支架材料、體外培養(yǎng)條件優(yōu)化，近來人們在人工合成材料表面復(fù)合生物高分子，如膠原蛋白、瓊脂糖凝膠、藻酸鹽、殼聚糖等，使其兼具生物和人工合成材料的優(yōu)點(diǎn)，目前仍存在一些問題，如種子細(xì)胞選擇以及體外培養(yǎng)體系不成熟、構(gòu)建的支架材料不理想、體內(nèi)吸收過快、機(jī)械性能不理想、形成的軟骨組織力學(xué)性能差、后期容易退化、對修復(fù)的分子機(jī)制還不清楚等，尚需進(jìn)一步研究。
如前所述，以上治療方法存在著各種各樣的問題，限制了這些技術(shù)的臨床應(yīng)用，需要進(jìn)行改進(jìn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的治療效果不好的缺陷，提供一種豬源膠原膜-自體軟骨細(xì)胞復(fù)合支架的構(gòu)建方法來解決上述問題。
本發(fā)明公開了一種豬源膠原膜-自體軟骨細(xì)胞復(fù)合支架的構(gòu)建方法，具體步驟為：
（1）、取患者非承重區(qū)的關(guān)節(jié)軟骨約200-300mg，剔除干凈軟組織，將剩余透明的軟骨組織塊放入盛有pbs緩沖液的離心管中，震蕩清洗，直至殘留的血液漂洗干凈為止；
（2）、在無菌平皿中，用眼科剪刀將軟骨組織剪碎成1mm3的碎片；
（3）、用0.25%（m/v）胰酶消化上述碎塊30min，吸棄上清；
（4）、再用0.02%（m/v）ⅱ型膠原酶5ml于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中對碎片消化8-10h，其中每隔1小時(shí)震蕩一次，直至成絮狀，得到細(xì)胞懸液；
（5）、采用100um濾網(wǎng)對細(xì)胞懸液進(jìn)行過濾，加入含fbs的高糖dmem培養(yǎng)基終止消化，其中高糖dmem培養(yǎng)基中的fbs的體積濃度為10%，在1000-1500rpm的條件下,離心5min，棄上清，沉淀即為軟骨細(xì)胞；
（6）、將軟骨細(xì)胞用含fbs、慶大霉素的高糖dmem培養(yǎng)基懸浮，調(diào)節(jié)至1×108/l，其中高糖dmem培養(yǎng)基中的fbs的體積濃度為10%，高糖dmem培養(yǎng)基中的慶大霉素的濃度為45ug/ml，然后接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶5ml，置于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔3天更換高糖dmem培養(yǎng)基一次，其中該高糖dmem培養(yǎng)基中也含10%fbs、45ug/ml慶大霉素；
（7）、待軟骨細(xì)胞貼壁達(dá)到80%以上后，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞兩次；
（8）、向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25%（m/v）胰蛋白酶消化液，置于37℃，5%的co2溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里滴入高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（9）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm的條件下，離心7min，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管內(nèi)，再加入45ml高糖dmem培養(yǎng)基，在1200rpm的條件下，離心7min，去上清后，重復(fù)上述步驟兩次，即得到清洗后的沉淀；
（10）、用含10%（v/v）fbs、慶大霉素45ug/ml的高糖dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×108/l，將細(xì)胞接種于75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；
（11）、細(xì)胞培養(yǎng)3-4周后，細(xì)胞傳代3次，可擴(kuò)增至15-20×106；
（12）、吸干培養(yǎng)液，培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25%胰蛋白酶消化液，置于溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里滴入高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（13）、將細(xì)胞懸液在1200rpm的條件下，離心7min，棄上清，再用生理鹽水洗滌細(xì)胞3次；
（14）、用0.3-1ml生理鹽水重懸細(xì)胞；
（15）、取無菌干燥豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜，并修剪成與軟骨損傷處一樣的形狀，置于無菌塑料平皿中，再根據(jù)膜的面積，細(xì)胞數(shù)為0.5-2×106/cm2，用塑料套管緩慢滴加細(xì)胞懸液于準(zhǔn)備好的豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜的糙面上，直至膠原膜達(dá)到濕飽和狀態(tài)；
（16）、待膠原膜吸附細(xì)胞10-15min后，即可。
作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的pbs緩沖液中含有慶大霉素，所述的pbs緩沖液中的慶大霉素的濃度為45ug/ml。
作為優(yōu)選，所述的步驟（4）中，所述的0.02%（m/v）ⅱ型膠原酶采用含10%（v/v）fbs的高糖dmem培養(yǎng)基進(jìn)行配制；
作為優(yōu)選，所述的步驟（15）中，所述的無菌干燥豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜在無菌塑料平皿中的放置方式為無菌干燥豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜的糙面朝上、光面朝下放置。
作為優(yōu)選，所述的步驟（16）的時(shí)間為15min。
作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的豬源膠原膜-自體軟骨細(xì)胞復(fù)合支架的使用方法為：將本發(fā)明制備得到的豬源膠原膜-自體軟骨細(xì)胞復(fù)合支架的糙面朝向關(guān)節(jié)軟骨缺損處，光面朝向關(guān)節(jié)腔，固定于軟骨缺損處，即可修復(fù)軟骨損傷。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1、本發(fā)明采用了一種豬腹膜源的ⅰ/ⅲ型膠原雙分子層膜結(jié)構(gòu)，其一面具有相對較高密度的膠原纖維，表面摩擦較低，細(xì)胞不通透，可阻止細(xì)胞向關(guān)節(jié)腔擴(kuò)散，另一面為粗糙的表面，上面空隙較大，有利于軟骨細(xì)胞附著其中，這種膜具有持久性、耐撕裂，其可承受切割、打孔、縫合等操作，其具有彈性，可修成不同形狀，不會隨著時(shí)間的推移而收縮，其具有可吸收性，移植2周后可被降解吸收，治療效果好可作為極佳的組織工程支架材料；
2、無菌干燥豬膠ⅰ/ⅲ型膠原膜接種高濃度軟骨細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)約0.5-2×106/cm2使其達(dá)到飽和濕度，使膠原膜吸附細(xì)胞10-15min，細(xì)胞即可均勻吸附，可用于臨床手術(shù)；
3、本發(fā)明簡化了外科手術(shù)操作，縮短了手術(shù)時(shí)間，創(chuàng)傷小，減輕了患者的痛苦，可生成更多透明軟骨，這種技術(shù)不會有軟骨細(xì)胞泄露和分布不均勻的風(fēng)險(xiǎn)；
4、本發(fā)明可用于治療3-20cm2的軟骨損傷面積，修復(fù)面大。
具體實(shí)施方式
下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
本發(fā)明公開了一種豬源膠原膜-自體軟骨細(xì)胞復(fù)合支架的構(gòu)建方法，具體步驟為：
（1）、取患者非承重區(qū)的關(guān)節(jié)軟骨約200-300mg，剔除干凈軟組織，將剩余透明的軟骨組織塊放入盛有pbs緩沖液的離心管中，震蕩清洗，直至殘留的血液漂洗干凈為止；
（2）、在無菌平皿中，用眼科剪刀將軟骨組織剪碎成1mm3的碎片；
（3）、用0.25%（m/v）胰酶消化上述碎塊30min，吸棄上清；
（4）、再用0.02%（m/v）ⅱ型膠原酶5ml于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中對碎片消化8-10h，其中每隔1小時(shí)震蕩一次，直至成絮狀，得到細(xì)胞懸液；
（5）、采用100um濾網(wǎng)對細(xì)胞懸液進(jìn)行過濾，加入含fbs的高糖dmem培養(yǎng)基終止消化，其中高糖dmem培養(yǎng)基中的fbs的體積濃度為10%，在1000-1500rpm的條件下,離心5min，棄上清，沉淀即為軟骨細(xì)胞；
（6）、將軟骨細(xì)胞用含fbs、慶大霉素的高糖dmem培養(yǎng)基懸浮，調(diào)節(jié)至1×108/l，其中高糖dmem培養(yǎng)基中的fbs的體積濃度為10%，高糖dmem培養(yǎng)基中的慶大霉素的濃度為45ug/ml，然后接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶5ml，置于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔3天更換高糖dmem培養(yǎng)基一次，其中該高糖dmem培養(yǎng)基中也含10%fbs、45ug/ml慶大霉素；
（7）、待軟骨細(xì)胞貼壁達(dá)到80%以上后，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞兩次；
（8）、向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25%（m/v）胰蛋白酶消化液，置于37℃，5%的co2溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里滴入高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（9）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm的條件下，離心7min，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管內(nèi)，再加入45ml高糖dmem培養(yǎng)基，在1200rpm的條件下，離心7min，去上清后，重復(fù)上述步驟兩次，即得到清洗后的沉淀；
（10）、用含10%（v/v）fbs、慶大霉素45ug/ml的高糖dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×108/l，將細(xì)胞接種于75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；
（11）、細(xì)胞培養(yǎng)3-4周后，細(xì)胞傳代3次，可擴(kuò)增至15-20×106；
（12）、吸干培養(yǎng)液，培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25%胰蛋白酶消化液，置于溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里滴入高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（13）、將細(xì)胞懸液在1200rpm的條件下，離心7min，棄上清，再用生理鹽水洗滌細(xì)胞3次；
（14）、用0.3-1ml生理鹽水重懸細(xì)胞；
（15）、取無菌干燥豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜，并修剪成與軟骨損傷處一樣的形狀，置于無菌塑料平皿中，再根據(jù)膜的面積，細(xì)胞數(shù)為0.5-2×106/cm2，用塑料套管緩慢滴加細(xì)胞懸液于準(zhǔn)備好的豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜的糙面上，直至膠原膜達(dá)到濕飽和狀態(tài)；
（16）、待膠原膜吸附細(xì)胞10-15min后，即可。
作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的pbs緩沖液中含有慶大霉素，所述的pbs緩沖液中的慶大霉素的濃度為45ug/ml。
作為優(yōu)選，所述的步驟（4）中，所述的0.02%（m/v）ⅱ型膠原酶采用含10%（v/v）fbs的高糖dmem培養(yǎng)基進(jìn)行配制；
作為優(yōu)選，所述的步驟（15）中，所述的無菌干燥豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜在無菌塑料平皿中的放置方式為無菌干燥豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜的糙面朝上、光面朝下放置。
作為優(yōu)選，所述的步驟（16）的時(shí)間為15min。
作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的豬源膠原膜-自體軟骨細(xì)胞復(fù)合支架的使用方法為：將本發(fā)明制備得到的豬源膠原膜-自體軟骨細(xì)胞復(fù)合支架的糙面朝向關(guān)節(jié)軟骨缺損處，光面朝向關(guān)節(jié)腔，固定于軟骨缺損處，即可修復(fù)軟骨損傷。
實(shí)施例1
本發(fā)明公開了一種豬源膠原膜-自體軟骨細(xì)胞復(fù)合支架的構(gòu)建方法，具體步驟為：
（1）、取患者非承重區(qū)的關(guān)節(jié)軟骨約300mg，剔除干凈軟組織，將剩余透明的軟骨組織塊放入盛有pbs緩沖液的離心管中，震蕩清洗，直至殘留的血液漂洗干凈為止；
（2）、在無菌平皿中，用眼科剪刀將軟骨組織剪碎成1mm3的碎片；
（3）、用0.25%（m/v）胰酶消化上述碎塊30min，吸棄上清；
（4）、再用0.02%（m/v）ⅱ型膠原酶5ml于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中對碎片消化8h，其中每隔1小時(shí)震蕩一次，直至成絮狀，得到細(xì)胞懸液；
（5）、采用100um濾網(wǎng)對細(xì)胞懸液進(jìn)行過濾，加入含fbs的高糖dmem培養(yǎng)基終止消化，其中高糖dmem培養(yǎng)基中的fbs的體積濃度為10%，在1200rpm的條件下,離心5min，棄上清，沉淀即為軟骨細(xì)胞；
（6）、將軟骨細(xì)胞用含fbs、慶大霉素的高糖dmem培養(yǎng)基懸浮，調(diào)節(jié)至1×108/l，其中高糖dmem培養(yǎng)基中的fbs的體積濃度為10%，高糖dmem培養(yǎng)基中的慶大霉素的濃度為45ug/ml，然后接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶5ml，置于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔3天更換高糖dmem培養(yǎng)基一次，其中該高糖dmem培養(yǎng)基中也含10%fbs、45ug/ml慶大霉素；
（7）、待軟骨細(xì)胞貼壁達(dá)到80%以上后，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞兩次；
（8）、向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25%（m/v）胰蛋白酶消化液，置于37℃，5%的co2溫箱3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里滴入高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（9）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm的條件下，離心7min，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管內(nèi)，再加入45ml高糖dmem培養(yǎng)基，在1200rpm的條件下，離心7min，去上清后，重復(fù)上述步驟兩次，即得到清洗后的沉淀；
（10）、用含10%（v/v）fbs、慶大霉素45ug/ml的高糖dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×108/l，將細(xì)胞接種于75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；
（11）、細(xì)胞培養(yǎng)4周后，細(xì)胞傳代3次，可擴(kuò)增至20×106；
（12）、吸干培養(yǎng)液，培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25%胰蛋白酶消化液，置于溫箱3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里滴入高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（13）、將細(xì)胞懸液在1200rpm的條件下，離心7min，棄上清，再用生理鹽水洗滌細(xì)胞3次；
（14）、用1ml生理鹽水重懸細(xì)胞；
（15）、取無菌干燥豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜，并修剪成與軟骨損傷處一樣的形狀，置于無菌塑料平皿中，再根據(jù)膜的面積，細(xì)胞數(shù)為2×106/cm2，用塑料套管緩慢滴加細(xì)胞懸液于準(zhǔn)備好的豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜的糙面上，直至膠原膜達(dá)到濕飽和狀態(tài)；
（16）、待膠原膜吸附細(xì)胞15min后，即可。
所述的步驟（1）中，所述的pbs緩沖液中含有慶大霉素，所述的pbs緩沖液中的慶大霉素的濃度為45ug/ml。
所述的步驟（4）中，所述的0.02%（m/v）ⅱ型膠原酶采用含10%（v/v）fbs的高糖dmem培養(yǎng)基進(jìn)行配制；
所述的步驟（15）中，所述的無菌干燥豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜在無菌塑料平皿中的放置方式為無菌干燥豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜的糙面朝上、光面朝下放置。
本發(fā)明所述的豬源膠原膜-自體軟骨細(xì)胞復(fù)合支架的使用方法為：將本發(fā)明制備得到的豬源膠原膜-自體軟骨細(xì)胞復(fù)合支架的糙面朝向關(guān)節(jié)軟骨缺損處，光面朝向關(guān)節(jié)腔，固定于軟骨缺損處，即可修復(fù)軟骨損傷。
實(shí)施例2
本發(fā)明公開了一種豬源膠原膜-自體軟骨細(xì)胞復(fù)合支架的構(gòu)建方法，具體步驟為：
（1）、取患者非承重區(qū)的關(guān)節(jié)軟骨約250mg，剔除干凈軟組織，將剩余透明的軟骨組織塊放入盛有pbs緩沖液的離心管中，震蕩清洗，直至殘留的血液漂洗干凈為止；
（2）、在無菌平皿中，用眼科剪刀將軟骨組織剪碎成1mm3的碎片；
（3）、用0.25%（m/v）胰酶消化上述碎塊30min，吸棄上清；
（4）、再用0.02%（m/v）ⅱ型膠原酶5ml于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中對碎片消化9h，其中每隔1小時(shí)震蕩一次，直至成絮狀，得到細(xì)胞懸液；
（5）、采用100um濾網(wǎng)對細(xì)胞懸液進(jìn)行過濾，加入含fbs的高糖dmem培養(yǎng)基終止消化，其中高糖dmem培養(yǎng)基中的fbs的體積濃度為10%，在1200rpm的條件下,離心5min，棄上清，沉淀即為軟骨細(xì)胞；
（6）、將軟骨細(xì)胞用含fbs、慶大霉素的高糖dmem培養(yǎng)基懸浮，調(diào)節(jié)至1×108/l，其中高糖dmem培養(yǎng)基中的fbs的體積濃度為10%，高糖dmem培養(yǎng)基中的慶大霉素的濃度為45ug/ml，然后接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶5ml，置于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔3天更換高糖dmem培養(yǎng)基一次，其中該高糖dmem培養(yǎng)基中也含10%fbs、45ug/ml慶大霉素；
（7）、待軟骨細(xì)胞貼壁達(dá)到80%以上后，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞兩次；
（8）、向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25%（m/v）胰蛋白酶消化液，置于37℃，5%的co2溫箱2.5min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里滴入高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（9）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm的條件下，離心7min，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管內(nèi)，再加入45ml高糖dmem培養(yǎng)基，在1200rpm的條件下，離心7min，去上清后，重復(fù)上述步驟兩次，即得到清洗后的沉淀；
（10）、用含10%（v/v）fbs、慶大霉素45ug/ml的高糖dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×108/l，將細(xì)胞接種于75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；
（11）、細(xì)胞培養(yǎng)3周后，細(xì)胞傳代3次，可擴(kuò)增至16×106；
（12）、吸干培養(yǎng)液，培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25%胰蛋白酶消化液，置于溫箱2min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里滴入高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；
（13）、將細(xì)胞懸液在1200rpm的條件下，離心7min，棄上清，再用生理鹽水洗滌細(xì)胞3次；
（14）、用0.5ml生理鹽水重懸細(xì)胞；
（15）、取無菌干燥豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜，并修剪成與軟骨損傷處一樣的形狀，置于無菌塑料平皿中，再根據(jù)膜的面積，細(xì)胞數(shù)為0.8×106/cm2，用塑料套管緩慢滴加細(xì)胞懸液于準(zhǔn)備好的豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜的糙面上，直至膠原膜達(dá)到濕飽和狀態(tài)；
（16）、待膠原膜吸附細(xì)胞15min后，即可。
所述的步驟（1）中，所述的pbs緩沖液中含有慶大霉素，所述的pbs緩沖液中的慶大霉素的濃度為45ug/ml。
所述的步驟（4）中，所述的0.02%（m/v）ⅱ型膠原酶采用含10%（v/v）fbs的高糖dmem培養(yǎng)基進(jìn)行配制；
所述的步驟（15）中，所述的無菌干燥豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜在無菌塑料平皿中的放置方式為無菌干燥豬源ⅰ/ⅲ型膠原膜的糙面朝上、光面朝下放置。
本發(fā)明所述的豬源膠原膜-自體軟骨細(xì)胞復(fù)合支架的使用方法為：將本發(fā)明制備得到的豬源膠原膜-自體軟骨細(xì)胞復(fù)合支架的糙面朝向關(guān)節(jié)軟骨缺損處，光面朝向關(guān)節(jié)腔，固定于軟骨缺損處，即可修復(fù)軟骨損傷。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求的保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。