本發(fā)明涉及生物材料學領域，特別是一種i型膠原蛋白，及由其制備的液態(tài)黏膜下填充劑。

背景技術：

目前，隨診內(nèi)鏡檢查的普及，癌前病變與早癌檢出率逐漸升高。內(nèi)鏡黏膜下層剝離術(esd)或內(nèi)鏡黏膜下層切除術(emr)逐漸成為一種切除消化道癌前病變與早癌的一種標準微創(chuàng)治療手段，它能夠將病變完整地整塊切除，從而大大降低了腫瘤復發(fā)的風險。

esd手術也存在較大風險，可能發(fā)生一些并發(fā)癥，主要包括消化道穿孔和出血。針對患者發(fā)生穿孔這一現(xiàn)象，為了使其更加安全和方便，目前國內(nèi)外多數(shù)學者研究證實，在手術切除之前進行黏膜下注射可以減少此類并發(fā)癥的發(fā)生。

目前研究涉及到的黏膜下注射液有生理鹽水、高滲鹽水、葡萄糖、甘油果糖、不同濃度的透明質(zhì)酸鈉及羥甲基纖維素、纖維蛋白原等。但這些黏膜下注射液在臨床應用中仍存在一些不足。例如生理鹽水注射后液體向周圍組織擴散快且維持病變黏膜隆起的時間短，大多數(shù)在切除手術還沒有完成時由生理鹽水注射形成的局部隆起形狀已經(jīng)部分消失。而高滲鹽水等其他注射液則會存在不同程度的組織損傷作用。

因鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新型的i型膠原蛋白，開發(fā)i型膠原蛋白的新功能結構。

本發(fā)明的另一目的是提供上述新i型膠原蛋白在制備黏膜下注射液方面的新用途。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種新的黏膜下注射液，以克服現(xiàn)有的黏膜下注射液在使用中存在的問題。

本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)上述目的：

本發(fā)明提供了一種i型膠原蛋白，膠原蛋白具有完整的天然的三螺旋結構，其中羥基脯氨酸含量大于11％(i型膠原蛋白中羥脯氨酸約占膠原蛋白的9～13％，參見《中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標準：組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第6部分：i型膠原蛋白》)。研究發(fā)現(xiàn)該膠原蛋白熱穩(wěn)定性好，空間支撐作用持久，對病灶隆起作用時間長度適中，不需要后期取出，而且對手術創(chuàng)口處滲血起到及時止血作用，有助于傷口的快速修復。

基于這些特性，本發(fā)明提供了上述i型膠原蛋白在制備液態(tài)黏膜下填充劑中的應用。

液態(tài)黏膜下填充劑是被注射到病變黏膜下層，在病變和固有肌層之間形成一個黏膜下液體墊層，將病變黏膜托起，當病變黏膜被切除時可以防止穿孔的發(fā)生、起到止血作用并促進被切除表面的愈合。液態(tài)黏膜下填充劑可被用于發(fā)生病變的消化器官粘膜處。

雖然目前市場上以膠原為基質(zhì)的生物材料不少，例如膠原蛋白海綿、可吸收膠原蛋白縫合線、醫(yī)用膠原膜、膠原帖敷料、膠原蛋白植入劑(雙美)、醫(yī)用膠原充填劑(膚美達)等，但對于esd或emr手術來說，既要求黏膜下液體墊能夠在手術期間持續(xù)支撐，又要求在手術完成后能被組織自行吸收而不必取出以避免給患者造成二次損傷，所以現(xiàn)有的膠原基質(zhì)生物材料都無法適用，本發(fā)明的i型膠原蛋白制備成液態(tài)黏膜下填充劑則符合這樣的要求，持續(xù)時間適當，膠原蛋白可在體內(nèi)自行降解，使用效果好。

本發(fā)明還提供了一種i型膠原蛋白粉，最適用于制備液態(tài)黏膜下填充劑，制備方法具體包括以下步驟：

(1)權利要求1所述的i型膠原蛋白加入中性緩沖液中，攪拌均勻，靜置浸泡；

(2)加入甲醛，35～39℃條件下攪拌進行交聯(lián)反應；

(3)反應產(chǎn)物使用中性緩沖液清洗，再用去離子水沖洗；

(4)冷凍干燥，粉碎至顆粒粒徑為200～300μm，得膠原蛋白粉。

作為一種優(yōu)選方案，上述i型膠原蛋白粉，制備方法具體包括以下步驟：

(1)i型膠原蛋白加入中性緩沖液中，攪拌均勻，靜置浸泡；

(2)加入甲醛，35～39℃條件下攪拌進行交聯(lián)反應；

(3)反應產(chǎn)物使用中性緩沖液清洗，再用去離子水沖洗；

(4)冷凍干燥，粉碎至顆粒粒徑為200～300μm，得膠原蛋白粉。

加入中性緩沖液并靜置浸泡可以使溶液的整個體系處于均一穩(wěn)定的ph環(huán)境中，在向其中加入偏酸或偏堿的物質(zhì)時，可以對其ph值起一定的緩沖作用，使ph值不會引起很大的變化。

因為膠原在液體中存放一定時間會發(fā)生降解，導致其三螺旋結構的破壞，使其實際應用功效減弱或者喪失。所以需要加入甲醛進行交聯(lián)，這樣可以延長其降解時間。不交聯(lián)的膠原制備得到的填充劑從原理上來講也就可以使用，但是由于不交聯(lián)的膠原在液體中降解相對交聯(lián)后的膠原要快，因此產(chǎn)品有效期會很短；同時交聯(lián)與否會對最終液態(tài)填充劑的黏度有一些影響。中性緩沖液清洗和去離子水沖洗的目的是除去未參加反應而殘留的甲醛。

由于膠原屬于一種對溫度很敏感的生物材料，超過一定的溫度就會發(fā)生變性，因此目前粉碎這種材料都是在液氮條件下進行；另外即使在液氮條件下，其韌性仍然很大。所以目前只是液氮條件下研磨還不能使其平均粒徑達到150μm以下。因此還需要后文所述的高壓均質(zhì)過程。

本發(fā)明中i型膠原蛋白的交聯(lián)溫度低于其變性溫度，同時在冷凍干燥后，在-196℃以下進行粉碎，使i型膠原蛋白中特有的天然三螺旋結構得以保留，避免三螺旋結構因溫度過高散開產(chǎn)生變性，達到更好的使用效果。

作為一種優(yōu)選方案，上述i型膠原蛋白粉，所述中性緩沖液由0.01mol/l的磷酸氫二鈉溶液和ph為5～6的mes溶液混合至ph為7后用去離子水稀釋20倍制備而成。因為磷酸氫二鈉溶液濃度過高或ph過低，會導致膠原溶解，因此采用0.01mol/l的磷酸氫二鈉溶液和ph為5-6的mes溶液混合來制備緩沖液。

作為一種優(yōu)選方案，上述i型膠原蛋白粉，步驟(2)中甲醛的質(zhì)量與步驟(1)中所用中性緩沖液體積比為0.08％～0.30％。

產(chǎn)物對于交聯(lián)度沒有嚴格的要求，但是甲醛用量合適的交聯(lián)可以提高最終液態(tài)填充劑的黏度同時延長產(chǎn)品的有效期。

作為一種優(yōu)選方案，上述i型膠原蛋白粉，步驟(2)中攪拌速度為180～300轉/分，反應時間為3～4h。在這反應條件下可以使交聯(lián)更均一，達到更好的交聯(lián)效果。

作為一種優(yōu)選方案，上述i型膠原蛋白粉，步驟(4)中冷凍干燥按照以下步驟進行：

a.預冷凍：先于-40℃下預冷凍60min，再于-20℃下預冷凍150～180min，并保持冷凍干燥機冷柜的溫度在-60～-50℃；

b.干燥：先于-10℃干燥7h，然后于0℃干燥7h，再于5℃干燥8h，于10℃干燥8h，最后于1510℃干燥8h，于20℃干燥20h；

預冷凍和干燥階段環(huán)境真空度為200～350毫托。

設置先預冷凍，再干燥，可以使需要凍干的樣品中的水份含量降到10％以下，這樣更利于下一步的冷凍研磨步驟。

作為一種優(yōu)選方案，上述i型膠原蛋白粉，步驟(4)的粉碎采用冷凍研磨粉碎，環(huán)境溫度在-196℃以下，粉碎時間為10～12min。

在極低溫度下，樣品會變脆，更容易研磨并達到所需的粒徑要求；同時該溫度下進行研磨使膠原蛋白的三螺旋結構不受到任何破壞。

本發(fā)明還提供了一種液態(tài)黏膜下填充劑，是由上述的i型膠原蛋白、或以上任一所述的i型膠原蛋白粉，懸浮于磷酸鹽緩沖液、或懸浮于生理鹽水中制備而成；懸浮液中膠原的平均粒徑為50～150μm。

因為在臨床上注射時需要通過所配套使用的黏膜切除術中的導管，所以需要達到上述的粒徑要求。

作為一種優(yōu)選方案，上述液態(tài)黏膜下填充劑，當使用i型膠原蛋白粉時，先將i型膠原蛋白粉加入到磷酸鹽溶液或生理鹽水中，在溫度0℃以下、壓力為800～1000bar條件下進行均質(zhì)至膠原粒徑降至50～150μm，得到液態(tài)黏膜下填充劑。

溫度設置在0℃以下可以保證蛋白在制備過程中不會發(fā)生變性；高壓可以降低膠原顆粒均質(zhì)的平均粒徑。

作為一種優(yōu)選方案，上述液態(tài)黏膜下填充劑，均質(zhì)重復5～10次。

重復均質(zhì)可以使膠原顆粒的平均粒徑均一并使膠原顆粒更好地均勻分散在溶液中。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明用僅含有天然三螺旋結構且羥基脯氨酸含量大于11％的i型膠原蛋白作為原材料制備液態(tài)黏膜下填充劑，可用作內(nèi)鏡黏膜下層切除術或內(nèi)鏡黏膜下層剝離術中病灶的隆起劑，維持足夠長的時間以保證手術順利實施而無需多次注射，不會對周圍組織造成損傷，有效減少出血和穿孔等并發(fā)癥；還可以作為手術過程中傷口的修復材料，術后不會發(fā)生出血，并能在30天內(nèi)降解吸收，不用擔心其對組織產(chǎn)生不良影響。

具體實施方式

為了使本技術領域的人員更好地理解本發(fā)明方案，下面具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細說明。

實施例一

取0.01mol/l的磷酸氫二鈉溶液，向其中加入ph＝6的mes溶液，至混合液ph至7，將調(diào)至中性的混合液用去離子水稀釋20倍制成中性緩沖液。

取20g純度99％以上的具有天然三螺旋結構的i型膠原蛋白(羥脯氨酸含量＞11％)，置于600ml中性緩沖液中，攪拌5～10min至均勻，靜置浸泡1.5h。

向中性緩沖液中加入1.25ml38.5％的甲醛溶液，攪拌7min使混合均勻，然后置于37℃恒溫水浴鍋中以200轉/分的速度攪拌反應交聯(lián)3h。

反應結束后將反應產(chǎn)物取出，用緩沖液洗30min，再用去離子水洗1h。

將清洗后的膠原進行冷凍干燥，先在-40℃下預冷凍1h，再在-20℃下預冷凍3h，期間保持冷凍干燥機冷柜的溫度在-60～-50℃。

冷凍干燥過程于-10℃干燥，于0℃干燥7h，再于5℃干燥8h，于10℃干燥8h，最后于15℃干燥8h，于20℃干燥20h。干燥后物料含水量在6％左右。預冷凍和干燥過程中環(huán)境真空度為200毫托。

將干燥后的物料在-196℃以下進行冷凍研磨粉碎，粉碎10min，過網(wǎng)篩，得到粒徑為200～300μm的0.08％甲醛交聯(lián)的i型膠原蛋白粉。

實施例二

取0.01mol/l的磷酸氫二鈉溶液，向其中加入ph＝6的mes溶液，至混合液ph至7，將調(diào)至中性的混合液用去離子水稀釋20倍制成中性緩沖液。

取20g純度在99％以上的具有天然三螺旋結構的i型膠原蛋白，置于600ml緩沖液中，攪拌5～10min至均勻，靜置浸泡1.5h。

向緩沖液中加入1.56ml38.5％的甲醛溶液，攪拌10min使混合均勻，然后置于37℃恒溫水浴鍋中以220轉/分的速度攪拌反應交聯(lián)3.5h。

結束后將膠原取出，用緩沖液洗40min，再用去離子水洗1.5h。

將膠原進行冷凍干燥，先在-40℃下預冷凍1h，再在-20℃下預冷凍3h，期間保持冷凍干燥機冷柜的溫度在-60～-50℃。

冷凍干燥過程于-10℃干燥，于0℃干燥7h，再于5℃干燥8h，于10℃干燥8h，最后于15℃干燥8h，于20℃干燥20h。干燥后物料含水量在6％左右。預冷凍和干燥過程中環(huán)境真空度為300毫托。

將干燥后的物料在-196℃以下進行冷凍研磨粉碎，粉碎11min，過網(wǎng)篩，得到粒徑為200～300μm的0.1％甲醛交聯(lián)的i型膠原蛋白粉。

實施例三

稱取4g實施例一或實施例二中得到的膠原粉，加入到100ml濃度為0.5mmol/l,ph＝7.5的磷酸鹽緩沖液中，攪拌均勻。

然后將混合液進行低溫高壓均質(zhì)，均質(zhì)溫度在0℃以下，均質(zhì)壓力為800bar。重復均質(zhì)化9次。得到膠原粒徑在50～150μm，膠原濃度為40mg/ml的液態(tài)黏膜下填充劑。

實施例四

稱取5g實施例一或實施例二中得到的膠原粉，加入到100ml濃度為0.5mmol/l,ph＝7.6的磷酸鹽緩沖液中，攪拌均勻。

然后將混合液進行低溫高壓均質(zhì)，均質(zhì)溫度在0℃以下，均質(zhì)壓力為900bar。重復均質(zhì)化11次。得到膠原粒徑在50～150μm，膠原濃度為50mg/ml的液態(tài)黏膜下填充劑。

實施例五

稱取6g實施例一或實施例二中得到的膠原粉，加入到100ml濃度為0.5mmol/l,ph＝7.8的磷酸鹽緩沖液中，攪拌均勻。

然后將混合液進行低溫高壓均質(zhì)，均質(zhì)溫度在0℃以下，均質(zhì)壓力為900bar。重復均質(zhì)化13次。得到膠原粒徑在50～150μm，膠原濃度為60mg/ml的液態(tài)黏膜下填充劑。

表1不同黏膜下注射產(chǎn)品填充效果對比表

參考表1，對比其他的黏膜下注射產(chǎn)品如生理鹽水、高滲鹽水、葡萄糖、甘油果糖、不同濃度的透明質(zhì)酸鈉及羥甲基纖維素、纖維蛋白原等，本發(fā)明提供的i型膠原材料制備的液態(tài)黏膜下填充劑有著更好的止血和促進愈合的作用。同時由于膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的一種結構蛋白，因此本發(fā)明提供的i型膠原材料制備的液態(tài)黏膜下填充劑也具有生物相容性、低免疫原性、生物可降解性。

以上對本發(fā)明所提供的一種高純度的具有三螺旋結構的i型膠原材料，一種由所述的i型膠原材料制備的液態(tài)黏膜下填充劑及其制備方法進行了詳細介紹。本文中應用了具體個例對本發(fā)明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的核心思想。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內(nèi)。