去纖維蛋白多核苷酸用于預防和/或治療移植物抗宿主病(GVHD)的制作方法

文檔序號：11604892閱讀：348來源：國知局

本申請是申請日為2010年11月12日、發(fā)明名稱為“去纖維蛋白多核苷酸用于預防和/或治療移植物抗宿主病(gvhd)”的中國專利申請201080069987.2的分案申請。

本發(fā)明涉及去纖維蛋白多核苷酸在人中，優(yōu)選在造血干細胞移植(hsct)，更優(yōu)選在同種異體造血干細胞移植中在預防和/或治療移植物抗宿主病(gvhd)中的用途。本發(fā)明的移植物抗宿主病(gvhd)可以是急性agvhd和/或慢性cgvhd，優(yōu)選急性agvhd。

技術水平

移植物抗宿主病(gvhd)是同種異體造血干細胞移植(hsct)后最常見的并發(fā)癥。盡管有強力的免疫抑制預防，甚至當供體是完全匹配的(hla相同的)兄弟姐妹時，也可以發(fā)生gvhd。這是受體的抗原呈遞細胞和供體的成熟細胞之間相互作用的結果。

傳統(tǒng)上認為gvhd是上皮細胞疾病。急性gvhd主要涉及的三種器官是皮膚、胃腸道和肝。它們?nèi)抗灿袨樗拗鞯摹碍h(huán)境”呈現(xiàn)屏障的共同特征。慢性gvhd相似地攻擊屏障組織。在眼、口、腸或生殖器粘膜區(qū)室的慢性干燥綜合癥，以及閉塞性細支氣管炎中涉及粘膜的上皮屏障。此外，經(jīng)常認為gvhd是單一疾病，其分為兩個時期：hsct后早期發(fā)生的gvhd的急性期和其中在移植過程稍后出現(xiàn)gvhd的慢性期。

最后，在傳統(tǒng)觀點上，gvhd是細胞因子引發(fā)的。移植和感染前使用的調(diào)節(jié)預處理方案誘導的損傷引起多種細胞因子的釋放，所述細胞因子負責炎癥過程，增強gvhd反應。

去纖維蛋白多核苷酸是一種單鏈寡核苷酸的多分散混合物，對有活性的內(nèi)皮細胞有保護效應。臨床前研究顯示，去纖維蛋白多核苷酸保護這些細胞免于化學治療誘導的細胞死亡和激活，并且下調(diào)內(nèi)皮細胞觸發(fā)樣類肝素酶的基因表達、蛋白質(zhì)水平和活性。去纖維蛋白多核苷酸降低前凝血劑活性并增強受刺激的內(nèi)皮細胞的溶解纖維蛋白的性質(zhì)，而不加劇全身出血。對在hsct之后患有嚴重肝靜脈梗阻癥(vod)的患者中的去纖維蛋白多核苷酸的臨床研究已經(jīng)報道了在36％至50％的患者中完全消退，并且在35％至42％的患者中幸存100天以上。去纖維蛋白多核苷酸的預防作用還未預期地進行研究，但看起來是有希望的。我們評估了去纖維蛋白多核苷酸在高風險兒科hsct群體中針對標準實踐(沒有vod預防)預防vod的功效和安全性。

定義：

術語去纖維蛋白多核苷酸表明多脫氧核糖核苷酸，其通過從動物和/或植物組織中提取獲得，但也可以通過合成產(chǎn)生；多脫氧核糖核苷酸通常以堿金屬鹽的形式，一般是鈉鹽的形式使用，并且一般具有13到30kda的分子量(cas登記號:83712-60-1)。優(yōu)選地，去纖維蛋白多核苷酸根據(jù)us4985552和us5223609獲得和/或呈現(xiàn)在相同的us4985552和us5223609中描述的物理/化學特征，此處引入所述us4985552和us5223609作為參考。更具體地，去纖維蛋白多核苷酸是具有隨機序列通式的多脫氧核糖核苷酸的混合物：

p1-5,(dap)12-24,(dgp)10-20,(dpp)13-26,(dcp)10-20

其中

p＝磷基團，

dap＝脫氧腺苷單體，

dgp＝脫氧鳥苷單體，

dtp＝脫氧胸苷單體，

dcp＝脫氧胞苷(deoxycytidynic)單體。

和/或顯示以下化學/物理特征：

電泳＝均一的陽極遷移率，和/或消光系數(shù)，260±1nmnm處的e1cm^1％＝220±10，和/或e230/e260＝0.45±0.04，和/或摩爾消光系數(shù)(指磷的)ε(p)＝7.750±500，和/或旋光力[α]d^20°＝53°±6；和/或可逆的增色性，在天然dna中以％表示和/或h＝15±5。

術語人將任何受試者鑒定為成人受試者和兒科群體，其中術語兒科群體意指從出生到十八(18)歲的群體部分。

術語agvhd表明急性移植物抗宿主病；

術語cgvhd表明慢性移植物抗宿主病；并且

術語同種異體(指造血干細胞移植(hsct))表明從健康受試者到(患者)受體的移植。

發(fā)明描述

本發(fā)明涉及去纖維蛋白多核苷酸，其用于在人中，優(yōu)選在造血干細胞移植(hsct)中預防和/或治療移植物抗宿主病(gvhd)。本發(fā)明的移植物抗宿主病(gvhd)可以是急性agvhd和/或慢性cgvhd，優(yōu)選急性agvhd。

根據(jù)本發(fā)明，可以將去纖維蛋白多核苷酸在造血干細胞移植(hsct)之前和/或之后對人施用。

我們近期已經(jīng)進行了國際隨機受控的開放性試驗，其中我們比較了在處于發(fā)生vod的高風險的兒科hsct患者中去纖維蛋白多核苷酸(gentiums.p.a.)的預防與無預防。主要端點是由盲審的獨立評審委員會判定的hsct后的day+30vod的發(fā)病率。次要端點包括移植物抗宿主病(gvhd)、vod相關的器官衰竭和死亡率。

總計356位患者滿足選擇標準并征得同意被隨機分配至靜脈內(nèi)注射去纖維蛋白多核苷酸組(n＝180)或?qū)φ战M(n＝176)。據(jù)報道，在去纖維蛋白多核苷酸組中22位患者(12％)患有vod，在對照組中35位患者(20％)患有vod(競爭風險，p＝0.05；卡普蘭-邁耶(kaplan-meier)，p＝0.05)。同種異體受體中急性gvhd的發(fā)病率和嚴重性明顯降低(分別是p＝0.005和p＝0.003)。vod相關的器官衰竭在去纖維蛋白多核苷酸組中較低，其中腎衰竭的發(fā)病率明顯降低(1％相比于6％,p＝0.02)。在患有vod的患者中觀察到明顯更高的day+100死亡率(25％相比于6％；p<0.001)。盡管vod診斷后的死亡率在去纖維蛋白多核苷酸組中較低(4相比于10位患者，p＝0.1)，但兩組中總體死亡率相似。組之間不利事件的發(fā)生率沒有差別(87％相比于88％)。

去纖維蛋白多核苷酸使vod發(fā)病率降低了40％，以及急性gvhd的發(fā)病率和嚴重性，并且具有良好的安全譜。(clinicaltrials.gov號,nct00272948.)

方法

研究設計

該研究是第三期，多中心隨機試驗，受gentiums.p.a支持。研究方案和患者知情同意書由參與中心的研究倫理委員會批準，并在研究開始前從患者和/或他們的法定代理人獲得了書面知情同意書。

中心數(shù)據(jù)管理員利用訪問隨機化序列的計算機算法產(chǎn)生了分配療法。隨機化是1：1，由中心和骨硬化癥的診斷分層。三位血液病學專家和一位統(tǒng)計學家組成的獨立數(shù)據(jù)和安全監(jiān)測委員會(dsmb以預定間隔評估安全性和死亡率數(shù)據(jù)。三位血液病學專家組成的盲審的獨立評審委員會(irc)檢查了所有可疑的和確證的vod病例并確定了對其的診斷。獨立的統(tǒng)計學家進行了數(shù)據(jù)分析。

合適的患者年齡小于18歲，用骨髓根除調(diào)節(jié)以用于同種異體或自體的hsct，并且所述患者具有患vod的至少一個風險因素：預先存在的肝病、第二次骨髓根除的hsct、二次復發(fā)以外的白血病的同種異體hsct、用白消安和美法倉進行調(diào)節(jié)、利用go的前期治療，和遺傳mas、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良或骨硬化癥的診斷。

治療

對于隨機化至開放標簽去纖維蛋白多核苷酸組的患者，每天以每千克體重25mg四次分開的靜脈內(nèi)輸注每日施用研究藥物。在移植前調(diào)節(jié)方案的同一天開始去纖維蛋白多核苷酸預防，并持續(xù)至day+30，或者如果在day+30前出院，持續(xù)最少14天。對照組的患者不接受針對vod的預防。

不允許利用全身t-pa、治療劑量肝素或其它抗血栓藥的治療。允許熊去氧膽酸。

患vod的任一組內(nèi)的患者接受每天每千克25mg的去纖維蛋白多核苷酸治療，直至所有癥狀完全消退或死亡。

結果測量

主要端點是day+30時的vod發(fā)病率。研究者根據(jù)修訂的seattle標準評估vod，所述修訂的seattle標準定義為存在兩個或多個標準：膽紅素>每分升2mg(每升>34μmol)、肝腫大、腹水和/或不明原因的體重增加高于基線>5％(從原始seattle標準²中>2％體重增加修改而來)。

在基線(調(diào)節(jié)前)和移植后至少每周一次測量實驗室參數(shù)，包括膽紅素。當在臨床上懷疑患有vod時，所有患者在基線和移植后進行腹部超聲波掃描，以確認肝腫大和腹水的存在。將盲法超聲報告和臨床數(shù)據(jù)送至irc用于判斷可疑的和診斷的vod病例。在主要功效分析中使用irc評估。

次要和探索性功效參數(shù)包括：

(a)day+100和day+180時gvhd(國際骨髓移植登記處索引)的發(fā)病率和嚴重性。

(b)day+100時的mof和死亡率；盡管該研究沒有強制評估m(xù)of或死亡率，但卻使用了用于評估vod嚴重性的綜合評分系統(tǒng)一起分析了這些端點。該系統(tǒng)為患有vod的患者的各器官衰竭指定了一分：呼吸衰竭(需氧量和/或呼吸機依賴性)、腎衰竭(基線肌酸酐水平的倍增和/或透析依賴性)，和腦??；為死亡(不管死亡的原因)指定了五分。沒有患vod的患者指定為零。也單獨分析了各綜合評分元件。

(c)day+180時的移植相關微血管病(tam)³¹的發(fā)病率。

記錄不利事件直至day+180并使用meddra術語進行編碼。

統(tǒng)計分析

如在方案和統(tǒng)計分析計劃中詳細說明的進行分析?；谥饕它c(day+30時的vod發(fā)病率)評估樣本大小。vod率在對照組中估計為30％，在去纖維蛋白多核苷酸組中為15％。假定單側的顯著性水平為0.025，功效為80％，中途退出率為10％，那么每組需要135位患者。因為在設計研究時并不清楚兒童中vod的發(fā)病率，所以在denne算法后，方案整合了計劃性的適應性中間分析，當每組120位患者達到day+30的主要端點時，獨立dsmb可以對其進行檢查。dsmb建議增大樣本大小至共計360位隨機患者。

在意向治療(itt)群體上進行所有的數(shù)據(jù)分析，所述群體包括具有知情同意書的被隨機分配到研究中的所有患者。使用tai等人中討論的kalbfleisch和prentice的累積競爭風險方法對去纖維蛋白多核苷酸組進行主要功效分析的比較，其中認為不因vod引起的死亡、因不利事件而中止研究和因移植失敗引起的接受第二次移植是競爭風險。也使用時序檢驗以vod率的卡普蘭-邁耶(kaplan-meier)評估進行支持性分析，其中在day+30，最后一次已知的追蹤觀察或在競爭風險時的任何一個較早時間檢查未經(jīng)歷vod的患者。也計劃了二次符合方案(pp)分析，其不包括過早退出itt的患者和嚴重違反協(xié)議的itt患者。

分別使用用于均衡的z檢驗(z-testforproportions)和兩樣本wilcoxon秩和檢驗分析了gvhd發(fā)病率和嚴重性的次要療效分析。未患gvhd的患者的嚴重性值指定為0。

使用精確的wilcoxon’s檢驗，以雙側5％的顯著性水平進行了vod綜合評分的分析。

使用卡方檢驗分析各綜合評分元件。使用時序檢驗比較各研究組在day+100時時間與死亡的卡普蘭-邁耶(kaplan-meier)分布，其中在day+100或最后一次已知的追蹤觀察中的任何一個較早時間檢查存活的患者。

去纖維蛋白多核苷酸組的安全群體定義為至少一份劑量的研究藥物的所有受體，對照組的安全群體定義為所有指定患者。使用用于嚴重和不嚴重不利事件(aes)的頻率表、實驗室試驗和長達day+180的存活評估安全性參數(shù)，其中存活定義為hsct和由任何原因引起的死亡之間天數(shù)時間。

結果：

患者特征

在2006年1月至2009年1月之間，在歐洲11個國家28個中心將360位患者隨機分配到研究中。在去纖維蛋白多核苷酸組中，隨機分配了181位患者，一位出現(xiàn)錯誤(未同意)，導致itt群體中180位患者。在對照組中，隨機分配了179位患者，三位出現(xiàn)錯誤(未同意)，導致itt群體中有176位患者。

研究群體的平均年齡是6.6歲。在研究組中患者根據(jù)年齡和性別均勻分配(表1)。組之間的原發(fā)病、供體類型、移植類型和vod的風險因素的發(fā)生率相似。隨機化至去纖維蛋白多核苷酸組的患者接受32.4(中位數(shù)，35.0)天的平均持續(xù)時間的研究藥物。當去纖維蛋白多核苷酸用于治療vod時，去纖維蛋白多核苷酸組的治療平均持續(xù)時間是28.7(中位數(shù)，23.0)天，而對照組的治療平均持續(xù)時間是21.7(中位數(shù)，18.5)天。組之間使用伴隨熊去氧膽酸的患者數(shù)量相似。

vod發(fā)病率：

與對照組相比，去纖維蛋白多核苷酸組中vod的發(fā)病率降低了40％。itt群體的分析顯示去纖維蛋白多核苷酸組相比于對照組在day+30時vod的發(fā)病率明顯更低(根據(jù)修訂的seattle標準，累積發(fā)病率分別為12％相比于20％；競爭風險，p＝0.05；卡普蘭-邁耶(kaplan-meier)，p＝0.05；表2)。pp群體的分析也顯示了統(tǒng)計學上顯著的結果(競爭風險，p＝0.02；卡普蘭-邁耶(kaplan-meier)，p＝0.02)。

為了探索不同標準下結果的一致性，應用baltimore標準進行了額外亞組的分析，其中vod的診斷需要每分升膽紅素>2mg(每升>34μmol)與其它三個標準肝腫大、腹水或體重增加>5％中的兩個。我們利用baltimore標準鑒定了較少的vod病例(在去纖維蛋白多核苷酸組中7％，在對照組中13％；p＝0.09；表2)。盡管不顯著，但這些數(shù)據(jù)與利用修訂的seattle標準觀察到的vod中40％的降低一致。

去纖維蛋白多核苷酸對gvhd的影響

接受去纖維蛋白多核苷酸預防的患者到day+100時經(jīng)歷明顯更低的agvhd發(fā)病率和嚴重性。在來自itt群體的同種異體hsct受體中，去纖維蛋白多核苷酸組中agvhd的發(fā)病率和嚴重性(等級1至4)明顯低于對照組(分別為p＝0.005和p＝0.003)，即使當不包括等級1的agvhd時(表3)，也是如此。到day+180時在研究組之間慢性gvhd(cgvhd)的發(fā)病率沒有差別。

盡管去纖維蛋白多核苷酸對agvhd具有保護效應，但去纖維蛋白多核苷酸不干擾所希望的移植物抗白血病效應。急性成淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病、其它白血病和骨髓增生異常綜合征的組合day+100復發(fā)率在去纖維蛋白多核苷酸組中為6％，相比于在對照組中為8％，并且組合day+180復發(fā)率分別為7％和10％。

vod相關的mof和死亡：

為了評估去纖維蛋白多核苷酸對vod嚴重性的影響，使用預先說明的綜合評分系統(tǒng)來定量day+100時的vod相關的mof和死亡?？傮w上，去纖維蛋白多核苷酸組具有較少的vod相關的器官衰竭和死亡，導致itt群體中評分在統(tǒng)計學上顯著降低(wilcoxon檢驗，p＝0.03)(表4)。尤其是，去纖維蛋白多核苷酸組相比于對照組顯示了統(tǒng)計學上顯著更低的腎衰竭發(fā)病率(1％vs.6％；p＝0.02)。day+100時嚴重的vod相關mof在滿足baltimore標準的患者中明顯更高(60％vs.32％；卡方檢驗，p＝0.04)。

day+100時去纖維蛋白多核苷酸組中的vod相關的死亡率比對照組中低(分別為2％和6％)，但這些結果在統(tǒng)計學上不顯著(表4)。

當在day+100和day+180評估時，兩組中的總體死亡率相似。在day+100時患有vod的患者中死亡率比沒有患vod的那些患者中的死亡率明顯更高(分別為25％vs.6％；p<0.0001)。

總體上，大多數(shù)致死aes屬于“腫瘤，惡性的和未指定”類別(在去纖維蛋白多核苷酸組和對照組中分別為7％和8％)，和“感染和侵襲”類別(分別為3％和6％)。

tam

day+180時tam的發(fā)病率沒有差別(在去纖維蛋白多核苷酸和對照組中分別為3％和4％)。

安全性

安全群體包括去纖維蛋白多核苷酸組的177位患者和對照組的所有176位患者。aes(表5)和嚴重不利事件(saes)以及導致研究中止的事件的發(fā)生率在組之間相似。報道了在分配到去纖維蛋白多核苷酸組中的108位患者中共有207例saes，103位對照患者中有231例。盡管研究者認為與去纖維蛋白多核苷酸可能、很可能或確定相關的最常見ae是出血，但出血的發(fā)生率在組之間卻相似。

討論：

盡管hsct為許多疾病提供了唯一有效的治療，但該方法仍然受方案相關毒性，包括gvd和肝vod的限制。確實，我們的結果顯示相比于未患vod的患者，患有vod的患者中死亡率高接近4倍，并驗證了前期的觀察結果。

在該研究中，預防性去纖維蛋白多核苷酸降低了agvhd的發(fā)病率和嚴重性。調(diào)節(jié)方案對皮膚、胃腸道和肝的內(nèi)皮細胞的損傷促使agvhd的發(fā)作。去纖維蛋白多核苷酸對內(nèi)皮細胞的抗炎性和保護效應以及類肝素酶基因表達的下調(diào)可以解釋這些結果，其看起來與推測的去纖維蛋白多核苷酸作用機制高度一致。

總體上，去纖維蛋白多核苷酸是非常耐受的。在兩個研究組中出血以相似的頻率發(fā)生，強烈地提示相比于去纖維蛋白多核苷酸的施用，這些事件更可能與sct和vod相關。

因此本發(fā)明的目標是在人中，優(yōu)選在造血干細胞移植(hsct)，更優(yōu)選在同種異體造血干細胞移植中在預防和/或治療移植物抗宿主病(gvhd)中使用去纖維蛋白多核苷酸。本發(fā)明的移植物抗宿主病(gvhd)可以是急性agvhd和/或慢性cgvhd，優(yōu)選急性agvhd。

根據(jù)本發(fā)明的去纖維蛋白多核苷酸可以在造血干細胞移植(hsct)之前和/或之后，優(yōu)選在同種異體造血干細胞移植之前和/或之后施用。

以每天10至60mg/kg，優(yōu)選每天20至40mg/kg范圍的劑量，更優(yōu)選以每天約25mg/kg的劑量施用根據(jù)本發(fā)明的去纖維蛋白多核苷酸；kg指患者的體重。根據(jù)本發(fā)明，以每天單次劑量或重復劑量，優(yōu)選每天4次劑量施用去纖維蛋白多核苷酸。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選經(jīng)靜脈內(nèi)地施用去纖維蛋白多核苷酸，更優(yōu)選以水溶液形式配制所述去纖維蛋白多核苷酸。

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表1.研究參與者的基本人口統(tǒng)計數(shù)據(jù)

atg表示抗胸腺細胞球蛋白、hsct造血干細胞移植、mas巨噬細胞活化綜合征。

*骨硬化癥是分層因子。

*去纖維蛋白多核苷酸組中的5位患者(3％)和對照組中的4位患者(2％)沒有移植數(shù)據(jù)(不進行骨髓根除移植或在移植前終止調(diào)節(jié))。

其他免疫抑制劑：麥考酚酸嗎乙酯、他克莫司、西羅莫司、抗淋巴細胞球蛋白、潑尼松/類固醇/m-pdn和利妥昔單抗。

§其他調(diào)節(jié)劑：噻替派、阿侖單抗、放射免疫抗體、卡鉑、利妥昔單抗、atg、氯法拉濱、安道生、地塞米松、安吖啶、aracytabine、muromonabc和bcnu。

表2.造血干細胞移植(hsct)后day+30時靜脈閉塞性病(vod)的發(fā)病率

*意向治療(itt)群體，n＝180去纖維蛋白多核苷酸組和n＝176對照組。

轉化中的置信區(qū)間(ci)。