本發(fā)明涉及一種用于治療腦缺血的藥物組合物、制劑及其應(yīng)用，屬于藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腦血管疾病是導(dǎo)致我國中老年人死亡的第一號(hào)殺手，也是世界性衛(wèi)生戰(zhàn)略研究重點(diǎn)之一。在腦血管疾病中，急性缺血性疾病的發(fā)病率居于首位，具有致殘率高、死亡率高和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，全球腦卒中病死逾150萬例/年，并隨著老年人口的增加呈逐年增長的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類生命健康和生活質(zhì)量。
急性腦缺血后引起一系列的病理生理損傷，包括局部血管病變、缺血區(qū)神經(jīng)元病變。導(dǎo)致機(jī)體危害的是神經(jīng)元功能的變化，主要表現(xiàn)為神經(jīng)元蛋白質(zhì)合成停止、去極化、鈣離子內(nèi)流增加、興奮性氨基酸大量釋放等，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，氧自由基生成增多，線粒體功能改變，誘發(fā)神經(jīng)元凋亡等。
目前，在治療腦缺血藥物研究方面，主要基于兩種策略，一是以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞功能為目的進(jìn)行的神經(jīng)保護(hù)劑的開發(fā)，旨在通過藥物阻斷神經(jīng)細(xì)胞死亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)以保護(hù)和恢復(fù)缺血區(qū)神經(jīng)功能；二是以改善供血為目的進(jìn)行的針對(duì)血管功能的研究，希望通過溶栓、擴(kuò)張血管或血管重構(gòu)以恢復(fù)腦缺血區(qū)血液供應(yīng)。其中改善供血的藥物為目前臨床較為常用的；例如t-PA，其具有極佳的溶栓作用，較短時(shí)間內(nèi)即可恢復(fù)腦缺血患者的血供，但是t-PA應(yīng)用具有嚴(yán)格時(shí)間窗限制，這是因?yàn)槿毖獏^(qū)域如果時(shí)間過長，一旦恢復(fù)血供會(huì)導(dǎo)致缺血再灌注損傷，從而加速患者死亡。
而神經(jīng)保護(hù)劑是基于對(duì)細(xì)胞病理生化級(jí)聯(lián)的干預(yù)，可以通過降低細(xì)胞內(nèi)鈣超載、拮抗興奮性氨基酸毒性、清除氧自由基以及抑制炎癥反應(yīng)等途徑減輕缺血性腦損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。
NMDA受體拮抗劑就是神經(jīng)保護(hù)劑的一種。在腦缺血過程中，受影響的神經(jīng)元釋放的大量谷氨酸可過度刺激N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體，其反過來引起神經(jīng)元死亡或凋亡。NMDA受體拮抗劑可阻斷NMDA受體導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡或凋亡，抑制神經(jīng)興奮性毒性。但是NMDA受體拮抗劑在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)不佳，原因在于在給腦缺血或腦卒中患者施用NMDA受體拮抗劑時(shí)如果劑量較高容易導(dǎo)致高血壓、記憶障礙甚至反過來導(dǎo)致神經(jīng)毒性加速患者死亡；而劑量較低往往又起不到神經(jīng)保護(hù)的作用；正是上述缺陷限制了NMDA受體拮抗劑作為腦缺血治療藥物方面的應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個(gè)目的是一種用于治療腦缺血的藥物組合物，其由NMDA受體拮抗劑和綠原酸組成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述NMDA受體拮抗劑選自哌替啶、美沙酮、右丙氧芬、曲馬多、酚派丙酮、右美沙芬、苯環(huán)己哌啶、鹽酸金剛烷胺、乙酸異丁酯、右啡烷、加環(huán)利定、伊博格堿、美金剛、咯環(huán)利定、替諾立定、噻環(huán)乙胺、依利羅、瑞馬西胺、阿替加奈、鉤藤堿、犬尿喹啉酸、拉科酰胺、MK801、艾芬地爾、CP-101606、GLYX-13、AP5、AP7和WMS2539中的一種或多種。
在進(jìn)一步地實(shí)施方案中，所述NMDA受體拮抗劑為CP-101606。CP-101606也稱Traxoprodil，中文名稱曲那羅地，是一種NR2B亞基選擇性NMDA受體拮抗劑；目前在國外用于治療腦缺血疾病已進(jìn)行到二期臨床，施藥患者較對(duì)照組腦梗死面積明顯降低，但是由于NMDA受體拮抗劑常見的副反應(yīng)存在，其死亡率與對(duì)照組無明顯區(qū)別，從而限制了CP-101606的進(jìn)一步應(yīng)用，所述CP-101606的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述NMDA受體拮抗劑和綠原酸的重量比為1：1-5；優(yōu)選為1：3。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物中還包括冰片，所述NMDA受體拮抗劑、綠原酸和冰片的重量比：1：3：0.1。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種包含所述藥物組合物的藥物制劑，其由所述藥物組合物和藥學(xué)上可接受的輔料組成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物制劑為口服制劑或注射劑。
在進(jìn)一步地實(shí)施方案中，所述藥學(xué)上可接受的輔料選自淀粉、β-環(huán)糊精、卡波姆、微晶纖維素、羥丙基甲基纖維素、低取代羥丙基纖維素、羧甲基纖維素鈣、聚乙二醇(PEG)、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、乙基纖維素、甘露醇、十二烷基硫酸鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、乳糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、硬脂酸鎂、滑石粉、微粉硅膠、阿斯巴甜、甜橙香精、碳酸氫鈉、碳酸鈉、腸溶包衣粉中的一種或幾種。上述制劑的所用輔料及制備方法均可采用其常規(guī)的輔料和制備方法制得。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供所述藥物組合物在制備治療腦缺血疾病藥物中的應(yīng)用。
上述所述的醫(yī)藥用途中，根據(jù)動(dòng)物病情以及用藥部位可以將藥物組合物制備成合適的藥物制劑以方便用藥，對(duì)于本發(fā)明藥物組合物的給藥時(shí)間和給藥次數(shù)需要根據(jù)病情的具體診斷結(jié)果而定，這在本領(lǐng)域技術(shù)人員掌握的技術(shù)范圍之內(nèi)。例如，將對(duì)小鼠的治療方案應(yīng)用于人身上，所有藥物對(duì)人的有效劑量可以通過該藥物對(duì)小鼠的有效劑量進(jìn)行換算，這對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)NMDA受體拮抗劑和綠原酸在治療腦缺血疾病方面產(chǎn)生了明顯的協(xié)同作用，尤其在特定重量比的條件下協(xié)同作用最佳，從而在應(yīng)用中可以明顯降低NMDA受體拮抗劑的給藥劑量，減少其帶來的相關(guān)副反應(yīng)，并且出人意料的是綠原酸還可以減輕由于NMDA受體拮抗劑所帶來的相關(guān)副反應(yīng)。
本發(fā)明的藥物之間的協(xié)同作用是指各組分組合后的生物學(xué)效應(yīng)，與基于單獨(dú)使用單個(gè)組分時(shí)期望產(chǎn)生給定的生物學(xué)效應(yīng)所要求的含量相比，上述組合物能夠通過使用更少量的組分而取得該生物學(xué)效應(yīng)，也就是說組合物的活性明顯高于單個(gè)組分的疊加效應(yīng)，即藥物之間產(chǎn)生了協(xié)同作用。
具體實(shí)施方式
還可進(jìn)一步通過實(shí)施例來理解本發(fā)明，其中所述實(shí)施例說明了一些制備或使用方法。然而，要理解的是，這些實(shí)施例不限制本發(fā)明?，F(xiàn)在已知的或進(jìn)一步開發(fā)的本發(fā)明的變化被認(rèn)為落入本文中描述的和以下要求保護(hù)的本發(fā)明范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1藥物組合物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的缺氧缺糖模型的保護(hù)作用
大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)：孕16d SD大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，碘酒、75％乙醇消毒腹部皮膚，依次剪開皮膚、肌肉、皮下筋膜，無菌操作下取出胚胎放入預(yù)冷的D-Hanks’平衡鹽液中。在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層，除去腦膜，剪碎組織成約1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱內(nèi)消化20min，中間搖晃一次。隨后用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的培養(yǎng)液(DMEM+10％FBS)的離心管內(nèi)終止消化液作用5min。離心去上清，加培養(yǎng)液將神經(jīng)細(xì)胞重懸后，計(jì)數(shù)，然后按5×104個(gè)/孔添加到96孔板中，置于孵箱內(nèi)培養(yǎng)2天后用于后續(xù)試驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組，持續(xù)通以95％O2和5％CO2的混合氣；第二組為缺糖缺氧(OGD)模型組：神經(jīng)細(xì)胞移去正常培養(yǎng)液，換入不含葡萄糖的HBSS溶液(140mM NaCl,3.5mM KCl,12mM MgSO4，5mM NaHCO3,1.7mM CaCl2,0.4mM KH2PO4，10mM Hepes)，放入專用的缺氧罐，通以95％N2和5％CO2的混合氣，缺糖缺氧6h；治療組，細(xì)胞用包含不同藥物組合物的DMEM液預(yù)處理3h后，細(xì)胞再經(jīng)上述OGD模型6h。
1、采用MTT方法測(cè)定各組細(xì)胞存活率，協(xié)同指數(shù)采用金正均q值法進(jìn)行判定，q值由以下的公式求得：q＝PA+B/(PA+PB-PA×PB)。式中PA、PB和PA+B分別為A藥組、B藥組和兩藥聯(lián)用組治療率。q＜1說明兩藥合用后產(chǎn)生拮抗作用；q＞1，說明兩藥合用后產(chǎn)生協(xié)同作用，q＝1說明兩藥合用后產(chǎn)生相加作用。
具體結(jié)果如下：
經(jīng)Oneway-ANOVA檢驗(yàn)，##表示與正常組相比P<0.01；*和**表示與模型組相比，P<0.05和P<0.01。
2、采用LDH生化試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中LDH含量，具體結(jié)果如下：
本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)在PC12細(xì)胞(大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤神經(jīng)細(xì)胞株)和大鼠原代海馬神經(jīng)細(xì)胞的OGD模型中，CP-101606和綠原酸均表現(xiàn)出了明顯的協(xié)同作用，并且以重量比1：3協(xié)同作用最佳。
實(shí)施例2藥物組合物對(duì)大鼠MCAO模型的保護(hù)作用
模型制備
SD大鼠，禁食過夜，自由飲水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用異氟烷氣體麻醉并維持。仰臥位固定，沿頸正中線切開皮膚，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，小心分離頸總動(dòng)脈分叉至顱底部的血管周圍的神經(jīng)及筋膜，分離頸外動(dòng)脈分支枕動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈、舌動(dòng)脈和上顎上頜動(dòng)脈，結(jié)扎，剪斷。從頸外動(dòng)脈游離端插入3#絲線(直徑0.260mm)，從頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端將尼龍線導(dǎo)入到頸內(nèi)動(dòng)脈，插至Willis環(huán)大腦中動(dòng)脈處，以有效阻斷大腦中動(dòng)脈，插入的尼龍線長度距頸總動(dòng)脈分叉處18～20mm。然后將頸外動(dòng)脈游離端連同腔內(nèi)尼龍線一并結(jié)扎，以防出血。逐層縫合皮下筋膜和皮膚，肌肉注射青霉素防止感染。假手術(shù)組動(dòng)物僅分離出頸內(nèi)動(dòng)脈。大鼠蘇醒10min后進(jìn)行神經(jīng)缺陷評(píng)分，有明顯神經(jīng)功能缺陷者(>8分)為造型成功。
分組及給藥：具體分為假手術(shù)組、模型組及給藥組。造模1小時(shí)后，采用尾靜脈輸注給藥的方式給藥，給藥體積以最大給藥體積計(jì)算，即均定容成1.5ml/100g(大鼠體重)，輸注時(shí)間40min。假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水，造模24h后處死大鼠進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。
1、死亡率和TTC梗死面積檢測(cè)：處死各組大鼠前，統(tǒng)計(jì)各組死亡率，并用骨鉗將鼠腦取出，沿冠狀面切成2mm厚的切片，間隔取上述一半腦片放入2％TTC染液中，避光37℃溫孵10min進(jìn)行染色，采用數(shù)碼成像系統(tǒng)將數(shù)字影象存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)中，并用圖象分析軟件測(cè)量梗死區(qū)和全腦面積，計(jì)算腦梗死范圍(梗死區(qū)面積占全腦面積百分比),具體結(jié)果如下：
2、采用ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)各組大鼠血清中LDH、VEGF和TNF-a含量，具體結(jié)果如下：
實(shí)施例3片劑
將1g CP-101606、3g綠原酸、0.1g冰片、32g預(yù)膠化淀粉和40g微晶纖維素研細(xì)混勻，以70％乙醇制粒過篩，添加2g硬脂酸鎂混勻，壓片即得。
實(shí)施例4注射劑
稱取0.1gCP-101606、0.3g綠原酸、0.5g聚乙二醇300和0.9gNaCl，加注射用水1L，加熱溶解，調(diào)pH值至7.3左右，滅菌灌裝即得。
本發(fā)明內(nèi)容僅僅舉例說明了要求保護(hù)的一些具體實(shí)施方案，其中一個(gè)或更多個(gè)技術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個(gè)或多個(gè)技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案也在本申請(qǐng)保護(hù)范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開內(nèi)容中具體記載一樣。