本發(fā)明涉及生物納米醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種以ph敏感膠束為模板的納米金殼的制備方法。

背景技術(shù)：

單一治療的方法難以有效治療惡性腫瘤。例如，化療存在副作用大、靶向性差、容易產(chǎn)生耐藥性等問題，熱療存在治療持久性差等問題，組合化療和熱療充分結(jié)合他們的優(yōu)勢是一種潛在有效的途經(jīng)。因此，開發(fā)多功能的組合化療和熱療的納米藥物載體變得尤為重要。這種載體要具備以下特征：1.能有效的包載藥物，并且能靶向癌癥組織后能有效釋放；2.能作為熱療的對比劑具有有效的光熱轉(zhuǎn)換效果。納米金殼具有上述特點，是一種理想的材料。傳統(tǒng)的納米金殼很多以介孔硅或者plga等非響應(yīng)性材料作為模版，但是以介孔硅或者plga等非響應(yīng)性材料作為模版的納米金殼存在儲存泄露，在非靶點位置釋放或者靶點位置釋放過慢等缺點。兩親性聚合物膠束可以在體內(nèi)的特定環(huán)境下分解從而釋放藥物，可以實現(xiàn)藥物在靶點釋放的目的，但是，現(xiàn)有技術(shù)中公開的以兩親性聚合物膠束為模版的納米金殼的粒徑都比較大，造成在中性條件下容易泄露藥物，并且不能很好的實現(xiàn)治療藥物的可控釋放。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種以ph敏感膠束為模板的納米金殼的制備方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：

一種以ph敏感膠束為模板的納米金殼的制備方法，包括如下步驟：(1)pdpa+ddat合成；(2)pdpa的合成；(3)ba-pbla的合成；(4)pbla-pdpa的合成；(5)pasp(dab)-pdpa的合成；(6)膠束的制備：將聚合物pasp(dab)-pdpa和阿霉素按2:1～1:2的質(zhì)量比溶于甲醇中，在超聲作用下緩慢滴到中性水中，超聲混勻后，在大量的水中透析，最后用水性過濾器過濾，得到包載阿霉素的膠束溶液；(7)納米金種子的制備：向氯金酸和檸檬酸溶液中加入硼氫化鈉溶液，混勻后用220nm的水性過濾器過濾，即得納米金種子；(8)納米金殼的制備：將納米金種子加入到膠束溶液中，攪拌混勻，將ph值為7.0～8.0的氯金酸溶液加入上述溶液中，混勻加入羥胺溶液，混勻后再加入peg5k-sh，攪拌混勻，最后用大量的水透析，濃縮即得。

優(yōu)選地，所述膠束的制備具體為：將聚合物pasp(dab)-pdpa和阿霉素按2:1～1:2的質(zhì)量比溶于2～5ml甲醇中，在超聲作用下緩慢滴到10～20ml中性的水中，超聲2～4min，然后在大量的水中透析6～10h，最后用450nm的水性過濾器過濾，得到包載阿霉素的膠束溶液。

優(yōu)選地，所述納米金種子的制備具體為：將100～250μl的20mm的氯金酸和檸檬酸溶液稀釋到20～30ml，在攪拌的情況下加入30～60μl的1m的硼氫化鈉溶液，攪拌混勻，然后用220nm的水性過濾器過濾。

優(yōu)選地，所述納米金殼的制備具體為：取100～500μl的納米金種子加入步驟(6)制備的膠束溶液中，攪拌4～10h，取0.5～1ml氯金酸溶液，用1m的氫氧化鈉溶液調(diào)ph值到7.0～8.0，然后加入上述溶液中，攪拌10min，然后加入0.5～1ml的5％的羥胺溶液，攪拌10min，然后加入10～40mg的peg5k-sh，攪拌24h，最后用大量的水透析4～8h，濃縮即得。

優(yōu)選地，所述pdpa+ddat合成為：將2.19g的dba單體，0.31gddat，0.01gaibn和30ml二氧六環(huán)，通氮氣鼓泡30min，密封，70℃油浴鍋中反應(yīng)12h，在二氧六環(huán)中透析3天，水中透析2天，凍干，即得。

優(yōu)選地，所述pdpa合成為將1g的pdpa+ddat，0.31gaibn和30ml二氧六環(huán)，通氮氣鼓泡30min，80℃油浴鍋中反應(yīng)12h，在二氧六環(huán)中透析3天，水中透析2天，凍干，即得。

優(yōu)選地，所述ba-pbla合成為將19.5μl正丁胺，1gbla-nca和30ml氯仿，在35℃反應(yīng)72h，乙醚沉淀，離心收集沉淀，抽干，即得。

優(yōu)選地，所述pbla-pdpa合成為將0.15g的pdpa，0.12g的pbla，0.15g的edc.hcl，0.09g的nhs和30ml的氯仿，反應(yīng)48h，乙醚沉淀，離心收集沉淀，抽干即得。

優(yōu)選地，所述pasp(dab)-pdpa的合成為將0.2g的pbla-pdpa，0.12g的dba和20ml的dmso，35℃反應(yīng)24h，甲醇透析，濃縮抽干，即得。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明制備的納米金殼的粒徑分布在40nm左右，并且比較均一，相對于現(xiàn)有的納米金殼粒徑較小，可防止治療藥物在中性條件下泄露，并且能更好的實現(xiàn)治療藥物的可控釋放。

另外，本發(fā)明的納米金殼以兩親性ph響應(yīng)性聚合物膠束為模板，同時將阿霉素包載在膠束的核內(nèi)，然后通過靜電作用將金種子吸附到膠束的親水層上，最后形成一層非致密金殼，通過控制條件使納米金殼的最大吸收波長移到近紅外區(qū)。在近紅外區(qū)組織的背景干擾最少。

附圖說明

圖1為pdpa及中間產(chǎn)物核磁圖。

圖2為pasp(dab)-pdpa及中間產(chǎn)物核磁圖。

圖3為膠束納米粒子的粒徑分布圖。

圖4為納米金種子的粒徑分布圖。

圖5為納米金殼的粒徑分布圖。

圖6膠束納米粒子的tem。

圖7納米金種子的tem。

圖8為納米金殼的tem。

圖9為納米金殼的紫外－可見光－近紅外吸收光譜圖。

圖10為光熱轉(zhuǎn)換圖。

具體實施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

實施例1

一種以ph敏感膠束為模板的納米金殼的制備方法，包括如下步驟：

(1)pdpa+ddat的合成：向50ml的反應(yīng)瓶中加入2.19g的dba單體，0.31gddat，0.01gaibn和30ml二氧六環(huán)，通氮氣鼓泡30min，密封，放入到70℃的油浴鍋中反應(yīng)12h，在二氧六環(huán)中透析3天，水中透析2天，凍干，得到淡黃色粉末2.05g。產(chǎn)物經(jīng)核磁檢測后，結(jié)果如圖1，由圖1可以得知，主要的核磁峰都有一個很好的歸屬，表明pdpa+ddat已經(jīng)成功制備。

(2)pdpa的合成：向50mg反應(yīng)瓶中加入1g的pdpa+ddat，0.31gaibn和30ml二氧六環(huán)，通氮氣鼓泡30min，放入到80℃的油浴鍋中反應(yīng)12h，在二氧六環(huán)中透析3天，水中透析2天，凍干，得到淡白色粉末0.71g。

(3)ba-pbla的合成：向50ml的反應(yīng)瓶中加入19.5μl正丁胺，1gbla-nca和30ml氯仿，在35℃反應(yīng)72h，用大量乙醚沉淀，離心收集沉淀，抽干，得白色固體0.72g。

(4)pbla-pdpa的合成：向50ml的反應(yīng)瓶中加入0.15g的pdpa，0.12g的pbla，0.15g的edc.hcl，0.09g的nhs和30ml的氯仿，反應(yīng)48h，然后用大量的乙醚沉淀2次，離心收集沉淀，抽干得淡黃色固體0.23g。

(5)pasp(dba)-pdpa：向50ml的反應(yīng)瓶中加入0.2g的pbla-pdpa，0.12g的dba和20ml的dmso，35℃反應(yīng)24h。在大量甲醇中透析，濃縮抽干，得淡黃色固體0.12g。產(chǎn)物經(jīng)核磁檢測后，結(jié)果如圖2，由圖2可以得知，主要的核磁峰都有一個很好的歸屬，表明pasp(dab)-pdpa已經(jīng)成功制備。

(6)膠束的制備：將10mg聚合物pasp(dab)-pdpa和1.5mg的阿霉素溶于2ml甲醇中，在超聲作用下緩慢滴到10ml，超聲4min，然后在大量的水中透析6h，最后用450nm的水性過濾器過濾，得到包載阿霉素的膠束溶液。

(7)納米金種子的制備：向小燒杯中加入250μl的20mm的氯金酸和檸檬酸溶液，稀釋到20ml，在攪拌的情況下加入30μl的1m的硼氫化鈉溶液，攪拌10min，然后用220nm的水性過濾器過濾。

(8)納米金殼的制備：取100μl的納米金種子加入步驟(6)制備的膠束溶液中，攪拌4h，取1ml氯金酸溶液，用1m的氫氧化鈉溶液調(diào)ph值到8.0，然后加入上述溶液中，攪拌10min，然后加入1ml的5％的羥胺溶液，攪拌10min，然后加入40mg的peg5k-sh，攪24h，最后用大量的水透析8h，濃縮。

載體結(jié)構(gòu)的證明：用動態(tài)光散射儀對膠束、納米金種子、納米金殼進(jìn)行水化粒徑測量，結(jié)果見圖3～5。從圖3中的粒徑分布圖，可以看出，膠束的粒徑大致分布在20nm左右，并且比較均一，從圖4中的粒徑分布圖，可以看出，納米金種子的粒徑大致分布在3nm左右，并且比較均一。從圖5中的粒徑分布圖，可以看出，納米金殼的粒徑大致分布在40nm左右，并且比較均一。以透射電子顯微鏡(tem)表征聚合物膠束的形貌，以phihpscm120電子顯微鏡表征，激發(fā)電壓為60kv。樣品的制備方法如下：將10μl(濃度為1mg/ml)的樣品溶液滴于銅網(wǎng)上，靜置1min后，以濾紙吸干。風(fēng)干，以醋酸鈾(質(zhì)量濃度為2％)對膠束樣品進(jìn)行染色，靜置1min后，用濾紙吸干(納米金種子和納米金殼不需要染色)。將銅網(wǎng)置于干燥器繼續(xù)室溫干燥。用紫外－可見光－近紅外光譜儀測試納米金殼的光譜吸收。

光熱效應(yīng)的評價：取1ml的pbs或者納米金殼放入5ml的小水杯中，用2w的激光照射5min，測不同時間的溫度。

實施例2

一種以ph敏感膠束為模板的納米金殼的制備方法，包括如下步驟：

步驟(1)至(7)同實施例1；

(8)納米金殼的制備：取100μl的納米金種子加入步驟(6)制備的膠束溶液中，攪拌4h，取0.6ml氯金酸溶液，用1m的氫氧化鈉溶液調(diào)ph值到7.0～8.0，然后加入上述溶液中，攪拌10min，然后加入0.6ml的5％的羥胺溶液，攪拌10min，然后加入40mg的peg5k-sh，攪24h，最后用大量的水透析8h，濃縮。

實施例3

一種以ph敏感膠束為模板的納米金殼的制備方法，包括如下步驟：

步驟(1)至(7)同實施例1；

(8)納米金殼的制備：取500μl的納米金種子加入步驟(6)制備的膠束溶液中，攪拌4h，取1ml氯金酸溶液，用1m的氫氧化鈉溶液調(diào)ph值到7.0～8.0，然后加入上述溶液中，攪拌10min，然后加入1ml的5％的羥胺溶液，攪拌10min，然后加入40mg的peg5k-sh，攪24h，最后用大量的水透析8h，濃縮。

實施例4

一種以ph敏感膠束為模板的納米金殼的制備方法，包括如下步驟：

步驟(1)至(7)同實施例1；

(8)取200μl的納米金種子加入步驟(6)制備的膠束溶液中，攪拌4h，取0.8ml氯金酸溶液，用1m的氫氧化鈉溶液調(diào)ph值到7.0～8.0，然后加入上述溶液中，攪拌10min，然后加入0.6ml的5％的羥胺溶液，攪拌10min，然后加入40mg的peg5k-sh，攪24h，最后用大量的水透析8h，濃縮。