本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種肺腺癌的診治靶標(biāo)，具體的所述靶標(biāo)為linc00858。

背景技術(shù)：

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一。在世界范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率明顯升高，其發(fā)病率已經(jīng)位于男性各種腫瘤的首位，而女性肺癌的發(fā)病率也明顯增高，至今，肺癌已成為全世界癌相關(guān)性死亡的主要原因。在中國(guó)，肺癌的發(fā)病率逐年快速上升，在過去的幾十年里，肺癌死亡率增加了465％，其死亡率在城市中居首位，在農(nóng)村中位于第二位。在所有的肺癌中，非小細(xì)胞肺癌占75-80％，而肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌的主要類型。盡管臨床和實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)均取得了許多新的進(jìn)展，但是肺癌的預(yù)后仍不如人意，5年生存率只有約11％。造成肺癌高死亡率的主要原因是患者確診時(shí)腫瘤細(xì)胞通常已發(fā)生了侵襲和轉(zhuǎn)移，缺乏有效的治療措施。因此，為了給肺癌患者提供有效的治療策略，提高肺癌患者的生存率，必須積極尋找有效的早期診斷標(biāo)志物。

lncrna是一類長(zhǎng)度超過200bp核苷酸的非編碼rna，有時(shí)長(zhǎng)度可以達(dá)到100kb。很多已識(shí)別的lncrna轉(zhuǎn)錄自rna聚合酶ii，并含有典型的多聚腺苷酸化信號(hào)。研究顯示lncrna以多種方式在基因調(diào)控中起到重要作用，主要有以下幾種方式:1、lncrna作用于染色質(zhì)修飾調(diào)節(jié)因子，調(diào)控染色質(zhì)的形成、印記及沉默；2、lncrna作為增強(qiáng)子rna，參與基因活化，調(diào)控基因的表達(dá)；3、lncrna以多種方式與染色質(zhì)互相結(jié)合，作為特定的生物學(xué)信號(hào)；4、lncrna誘捕調(diào)控蛋白阻止其調(diào)控功能；5、lncrna結(jié)合多種蛋白質(zhì)使其形成分散的復(fù)合體，發(fā)揮特定的生物學(xué)功能；6、lncrna作為介導(dǎo)，參與部分生物學(xué)過程。

雖然lncrna被認(rèn)為參與到細(xì)胞的生長(zhǎng)過程、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞死亡及多細(xì)胞生物的生長(zhǎng)等各項(xiàng)生物過程中，并被證實(shí)在細(xì)胞周期的調(diào)控，凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，以及腫瘤相關(guān)基因的抑制和激活過程中發(fā)揮了巨大的作用，但是在肺癌相關(guān)的lncrna研究中，目前也僅有一種malat-1被發(fā)現(xiàn)。

人類對(duì)于incrna的認(rèn)識(shí)才剛剛起步，目前針對(duì)lncrna的研究多數(shù)還停留在發(fā)現(xiàn)和尋找疾病相關(guān)性lncrna的階段，對(duì)于lncrna在生物學(xué)過程中起到具體作用的研究還非常少。而且，由于lncrna本身并不編碼蛋白質(zhì)，它在生物學(xué)過程中的調(diào)控作用往往是通過調(diào)控基因的甲基化水平、染色體修飾、參與蛋白質(zhì)招募、基因沉默等分子生物學(xué)調(diào)控過程來來間接實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能，更增添了incrna研究的難度。因此，尋找肺癌相關(guān)的其他關(guān)鍵lncrna，并了解他們的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，生物學(xué)特征，對(duì)肺腺癌的機(jī)制探究與臨床治療都具有重大的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供linc00858在肺腺癌診治中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種linc00858基因的用途，用于制備預(yù)防或治療肺腺癌的藥物組合物。

進(jìn)一步，所述藥物組合物包括linc00858的下調(diào)劑。所述下調(diào)劑選自：以linc00858或其轉(zhuǎn)錄本為靶序列、且能夠抑制linc00858基因表達(dá)或基因轉(zhuǎn)錄的干擾分子，包括：shrna(小發(fā)夾rna)、小干擾rna(sirna)、dsrna、微小rna、反義核酸，或能表達(dá)或形成所述shrna、小干擾rna、dsrna、微小rna、反義核酸的構(gòu)建物。

進(jìn)一步，所述的下調(diào)劑選自下組序列的sirna：seqidno.8、seqidno.9。

本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或治療肺腺癌的linc00858的下調(diào)劑，所述下調(diào)劑選自下組序列的sirna：seqidno.8、seqidno.9。

本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或治療肺腺癌的藥物組合物，所述藥物組合物含有：

上面所述的linc00858的下調(diào)劑；和

藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明提供了一種linc00858基因的用途，用于篩選預(yù)防或治療肺腺癌的潛在物質(zhì)。

本發(fā)明提供了一種篩選預(yù)防或治療肺腺癌的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括：

用候選物質(zhì)處理表達(dá)或含有l(wèi)inc00858基因的體系；和

檢測(cè)所述體系中l(wèi)inc00858基因的表達(dá)；

其中，若所述候選物質(zhì)可降低linc00858基因的表達(dá)或活性，(優(yōu)選顯著降低，如低20％以上，較佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，則表明該候選物質(zhì)是預(yù)防或治療肺腺癌的潛在物質(zhì)。所述體系選自：細(xì)胞體系、亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動(dòng)物體系。

所述候選物質(zhì)包括但不限于：針對(duì)linc00858基因或其上游或下游基因設(shè)計(jì)的干擾分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本發(fā)明提供了一種linc00858基因的用途，用于制備診斷肺腺癌的產(chǎn)品。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括芯片、制劑、或試劑盒。

進(jìn)一步，所述芯片包括特異性識(shí)別linc00858的探針；所述試劑盒包括特異性擴(kuò)增linc00858的引物或特異性識(shí)別linc00858的探針或芯片。

較佳的，所述的特異性擴(kuò)增linc00858基因的引物是引物對(duì)，序列如seqidno.2和seqidno.3所示。

附圖說明

圖1是利用qpcr檢測(cè)linc00858基因在肺腺癌組織中的表達(dá)情況圖；

圖2是利用qpcr檢測(cè)linc00858在肺腺癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染情況圖；

圖3是用cck-8法檢測(cè)linc00858基因?qū)Ψ蜗侔┘?xì)胞增殖的影響圖；

圖4是用流式細(xì)胞儀檢測(cè)linc00858基因?qū)Ψ蜗侔┘?xì)胞凋亡的影響圖；

圖5是利用transwell小室檢測(cè)linc00858對(duì)肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響圖；其中圖a是linc00858對(duì)肺腺癌細(xì)胞遷移的影響圖；圖b是linc00858對(duì)肺腺癌細(xì)胞侵襲的影響圖。

具體的實(shí)施方式

本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過高通量方法，采用目前覆蓋數(shù)據(jù)庫(kù)最廣的lncrna芯片，檢測(cè)肺腺癌標(biāo)本中l(wèi)ncrna在腫瘤組織和癌旁組織的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其中具有明顯表達(dá)差異的lncrna片段，探討其與肺腺癌的發(fā)生之間的關(guān)系，從而為肺腺癌的早期檢測(cè)及靶向治療尋找更好的途徑和方法。通過篩選，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了肺腺癌中l(wèi)inc00858顯著性上調(diào)。實(shí)驗(yàn)證明，通過降低linc00858的表達(dá)水平，能夠有效地抑制肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，提示檢測(cè)linc00858基因的表達(dá)水平可成為肝癌早期診斷的輔助診斷指標(biāo)之一，干擾linc00858基因表達(dá)可成為肺腺癌治療的新途徑。

linc00858基因

linc00858是位于人10號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)上，一種代表性的人linc00858基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。本發(fā)明中的linc00858包括野生型、突變型或其片段。

本發(fā)明的人linc00858核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂胮cr擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于pcr擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開的有關(guān)核苷酸序列，并用市售的cdna庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cdna庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次pcr擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的實(shí)用性并不局限于對(duì)本發(fā)明的靶標(biāo)基因的任何特定變體的基因表達(dá)進(jìn)行定量。如果當(dāng)核酸或其片段與其它核酸(或其互補(bǔ)鏈)最佳比對(duì)時(shí)(具有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔?，在至少大約60％的核苷酸堿基、通常至少大約70％、更通常至少大約80％、優(yōu)選至少大約90％、及更優(yōu)選至少大約95-98％核苷酸堿基中存在核苷酸序列相同性，則這兩個(gè)序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。

或者，當(dāng)核酸或其片段與另一核酸(或其互補(bǔ)鏈)、一條鏈或其互補(bǔ)序列在選擇性雜交條件下雜交時(shí)，則其間存在基本同源或(相同性)。當(dāng)雜交比特異性整體喪失發(fā)生更具選擇性時(shí)，存在雜交選擇性。典型地，當(dāng)在至少大約14個(gè)核苷酸的一段序列存在至少大約55％相同性、優(yōu)選至少大約65％、更優(yōu)選至少大約75％及最優(yōu)選至少大約90％相同性時(shí)，發(fā)生選擇性雜交。如本文所述，同源對(duì)比的長(zhǎng)度可以是較長(zhǎng)的序列節(jié)段，在某些實(shí)施方案中通常為至少大約20個(gè)核苷酸，更通常為至少大約24個(gè)核苷酸，典型為至少大約28個(gè)核苷酸，更典型為至少大約32個(gè)核苷酸，及優(yōu)選至少大約36或更多個(gè)核苷酸。

因此，本發(fā)明的多核苷酸與seqidno.1優(yōu)選具有至少75％、更優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％同源性。更優(yōu)選地，存在至少95％、更優(yōu)選至少98％同源性。

本發(fā)明可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法測(cè)定基因表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，測(cè)定基因表達(dá)的手段不是本發(fā)明的重要方面。可以在轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。

下調(diào)劑和藥物組合物

基于本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種linc00858的下調(diào)劑的用途，用于制備抑制肺腺癌的藥物組合物。如本文所用，所述的linc00858的下調(diào)劑包括但不限于抑制劑、拮抗劑、阻滯劑、阻斷劑、核酸抑制物等。

所述的linc00858的下調(diào)劑是指任何可下調(diào)linc00858基因的表達(dá)、或抑制linc00858基因的轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)，這些物質(zhì)作為對(duì)于下調(diào)linc00858有用的物質(zhì)，可用于預(yù)防或治療肺腺癌。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述linc00858的下調(diào)劑是一種linc00858特異性的小干擾rna分子。如本文所用，所述的“小干擾rna”是指一種短片段雙鏈rna分子，能夠以同源互補(bǔ)序列的mrna為靶目標(biāo)降解特定的mrna，這個(gè)過程就是rna干擾(rnainterference)過程。小干擾rna可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個(gè)正義鏈和一個(gè)反義鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。一個(gè)雙鏈rna復(fù)合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來制備。因此，舉例來講，互補(bǔ)的正義鏈和反義鏈?zhǔn)腔瘜W(xué)合成的，其后可通過退火雜交，產(chǎn)生合成的雙鏈rna復(fù)合物。

在篩選有效的sirna序列時(shí)，本發(fā)明人通過大量的比對(duì)分析，從而找出最佳的有效片段。本發(fā)明人設(shè)計(jì)合成了多種sirna序列，并將它們分別通過轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證，選出干擾效果最佳的sirna，它們分別具有seqidno.8、seqidno.9所示的序列，進(jìn)一步地在細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明對(duì)于細(xì)胞試驗(yàn)而言抑制效率非常高。

作為本發(fā)明的一種可選方式，所述的linc00858的下調(diào)劑也可以是一種“小發(fā)夾rna(smallhairpinrna，shrna)”，其是能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非編碼小rna分子，小發(fā)夾rna能夠通過rna干擾途徑來抑制基因的表達(dá)。如上述，shrna可以由雙鏈dna模板來表達(dá)。雙鏈dna模板被插進(jìn)一個(gè)載體，例如質(zhì)?；虿《据d體，然后在體外或體內(nèi)連接到一個(gè)啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)。shrna在真核細(xì)胞內(nèi)dicer酶的作用下，可被切割成小干擾rna分子，從而進(jìn)入rnai途徑。“shrna表達(dá)載體”是指一些本領(lǐng)域常規(guī)用于構(gòu)建shrna結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒，通常該質(zhì)粒上存在“間隔序列”以及位于“間隔序列”兩邊的多克隆位點(diǎn)或供替換序列，從而人們可以將shrna(或類似物)相應(yīng)的dna序列通過正向和反向的方式插入多克隆位點(diǎn)或替換其上的供替換序列，該dna序列轉(zhuǎn)錄后的rna可形成shrna(shorthairpin)結(jié)構(gòu)。所述的“shrna表達(dá)載體”目前已經(jīng)完全可以通過商購(gòu)的途徑購(gòu)買獲得，例如一些病毒載體。

本發(fā)明的核酸抑制物如sirna可以化學(xué)合成，也可以通過一個(gè)重組核酸結(jié)構(gòu)里的表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄成單鏈rna之后進(jìn)行制備。sirna等核酸抑制物，可通過采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細(xì)胞內(nèi)，或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到細(xì)胞內(nèi)。

藥物組合物

本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量的所述的linc00858的下調(diào)劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述的組合物可用于抑制肺腺癌。任何前述的linc00858的下調(diào)劑均可用于組合物的制備。

如本文所用，所述“有效量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。下調(diào)劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗(yàn))。所述的因素包括但不限于：所述的linc00858基因的下調(diào)劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。所述“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、ph緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細(xì)胞(宿主細(xì)胞)轉(zhuǎn)染試劑。

本發(fā)明可以采用用本領(lǐng)域熟知的多種方法來將所述的下調(diào)劑或其編碼基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動(dòng)物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、經(jīng)皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給予的。

優(yōu)選的，可采用基因治療的手段進(jìn)行。比如，可直接將linc00858的下調(diào)劑通過諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過一定的途徑將攜帶linc00858的下調(diào)劑的表達(dá)單位(比如表達(dá)載體或病毒等，或sirna或shrna)遞送到靶點(diǎn)上，并使之表達(dá)活性的linc00858下調(diào)劑，具體情況需視所述的下調(diào)劑的類型而定，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。

術(shù)語“宿主細(xì)胞”可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅s2或sf9的昆蟲細(xì)胞；cho、cos、或293細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。

用重組dna轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收dna的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用cacl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用mgcl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的dna轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。

本發(fā)明中的藥物組合物包括linc00858的下調(diào)劑、和/或與所述下調(diào)劑配伍的其他藥類以及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。

本發(fā)明的藥物組合物還可與其他治療肺腺癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時(shí)給藥，甚至在同一組合物中同時(shí)給藥。

本發(fā)明的藥物組合物還可以以單獨(dú)的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨(dú)給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時(shí)給藥，而其它劑量可以單獨(dú)給藥。在治療過程中，可以根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度、復(fù)發(fā)的頻率和治療方案的生理應(yīng)答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。

藥物篩選

本發(fā)明提供了一種篩選預(yù)防或治療肺腺癌藥物的方法，即：

在實(shí)驗(yàn)組中，向細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入待測(cè)化合物，并測(cè)定linc00858的表達(dá)水平；在對(duì)照組中，向同樣的培養(yǎng)體系中不加入待測(cè)化合物，并測(cè)定linc00858的表達(dá)水平；其中，如果實(shí)驗(yàn)組中l(wèi)inc00858的表達(dá)水平大于對(duì)照組，則說明該候選化合物為linc00858的下調(diào)劑。

在本發(fā)明中，所述的方法還包括：對(duì)上面步驟獲得的候選化合物進(jìn)一步測(cè)試其抑制肝癌的效果，若測(cè)試化合物對(duì)肺腺癌有顯著的抑制效果，則說明該化合物為預(yù)防或治療肺腺癌的潛在物質(zhì)。

芯片、試劑盒

本發(fā)明的所述的lncrna芯片包括：固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對(duì)應(yīng)于linc00858所示的部分或全部序列。

具體地，可根據(jù)本發(fā)明所述的lncrna，設(shè)計(jì)出適合的探針，固定在固相載體上，形成“寡核苷酸陣列”。所述的“寡核苷酸陣列”是指具有可尋址位置(即以區(qū)別性的，可訪問的地址為特征的位置)的陣列，每個(gè)可尋址位置均含有一個(gè)與其相連的特征性寡核苷酸。根據(jù)需要，可將寡核苷酸陣列分成多個(gè)亞陣。

術(shù)語“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，術(shù)語“探針”通常指能通過互補(bǔ)堿基配對(duì)與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)格性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補(bǔ)性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標(biāo)記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測(cè)定法。

本發(fā)明中針對(duì)linc00858基因的寡核苷酸探針可以是dna、rna、dna-rna嵌合體、pna或其它衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長(zhǎng)度都可以。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述探針的長(zhǎng)度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長(zhǎng)一般不超過30個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度以15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探針自身互補(bǔ)序列最好少于4個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效率。

本發(fā)明中所述固相載體可采用基因芯片領(lǐng)域的各種常用材料，例如包括但不限于塑料制品、微顆粒、膜載體等。所述塑料制品可通過非共價(jià)或物理吸附機(jī)制與抗體或蛋白抗原相結(jié)合，最常用的塑料制品為聚苯乙烯制成的小試管、小珠和微量反應(yīng)板；所述微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒，其直徑多為微米，由于帶有能與蛋白質(zhì)結(jié)合的功能團(tuán)，易與抗體(抗原)形成化學(xué)偶聯(lián)，結(jié)合容量大；所述膜載體包括硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜及尼龍膜等微孔濾膜。

所述的linc00858芯片的制備可采用本領(lǐng)域已知的生物芯片的常規(guī)制造方法。例如，如果固相載體采用的是修飾玻片或硅片，探針的5’端含有氨基修飾的聚dt串，可將寡核苷酸探針配制成溶液，然后采用點(diǎn)樣儀將其點(diǎn)在修飾玻片或硅片上，排列成預(yù)定的序列或陣列，然后通過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的lncrna芯片。

本發(fā)明提供了一種試劑盒，所述試劑盒可用于檢測(cè)linc00858的表達(dá)。優(yōu)選的，所述的制劑或試劑盒中還含有用于標(biāo)記rna樣品的標(biāo)記物，以及與所述標(biāo)記物相對(duì)應(yīng)的底物。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取rna、pcr、雜交、顯色等所需的各種試劑，包括但不限于：抽提液、擴(kuò)增液、雜交液、酶、對(duì)照液、顯色液、洗液等。此外，所述的試劑盒中還包括使用說明書和/或芯片圖像分析軟件。

本發(fā)明中，術(shù)語“樣本”以其最廣泛的含義使用。在一種含義中，意在包括從任何來源獲得的標(biāo)本或培養(yǎng)物，以及生物和環(huán)境樣本。生物樣本可獲自動(dòng)物(包括人)并涵蓋液體、固體、組織和氣體。生物樣本包括血液制品，諸如血漿、血清等。然而，此類樣本不應(yīng)解釋為限制適用于本發(fā)明的樣本類型。

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1篩選與肺腺癌相關(guān)的基因標(biāo)志物

1、樣品收集

各收集8例肺腺癌癌旁組織和肺腺癌組織樣本。肺腺癌腫瘤組織標(biāo)本取材部位為主要腫瘤區(qū)域，位于腫瘤腫塊中外1/3與正常組織交接處，排除腫瘤中心明顯壞死、鈣化部分以及腫瘤外圍正常肺組織；癌旁正常肺組織標(biāo)本取自腫瘤邊緣5cm以上的部位，肉眼觀察無明顯變化。上述所有標(biāo)本的取得均通過組織倫理委員會(huì)的同意。

2、rna樣品的制備(利用e.z.n.a.mirnakit進(jìn)行操作)

在研缽中導(dǎo)入液氮，取上述獲得的組織放入研缽中，在液氮中剪碎并研磨成粉末，剪碎后投入液氮中并研磨至粉末狀，隨后轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器中；組織勻漿在玻璃勻漿器中加入trizol試劑，在冰上研磨組織。將勻漿后組織勻漿液轉(zhuǎn)入無rna酶的ep管中，室溫下靜置5min。按照試劑盒中的說明書提取分離rna。具體如下：

1)rna的分離：

在ep管中加入0.2ml氯仿，蓋緊ep管蓋，手動(dòng)劇烈振蕩15s，使其充分混勻。室溫下孵化5min。然后在4℃下以14000g離心15min。離心后樣品分為三層，rna存在于上層水相中。

2)rna沉淀

將分離得的水相取450μl移至新的無rna酶的ep管中，按照1:1的比例加入450μl異丙醇，上下顛倒混勻后在室溫下孵化10min，4℃14000g離心10min。

3)rna洗脫

離心后小心移去上清，加入1ml75％乙醇(滅酶處理，現(xiàn)用現(xiàn)配并在冰上預(yù)冷)沖洗rna，隨后4℃7500g離心5min。

4)rna再溶解

小心移去洗滌之后的上清，在超凈工作臺(tái)中打開ep管管蓋，在室溫下放置rna樣本5-10min，晾干。加入無rna酶處理水20-50μl，55-60℃水浴箱中水浴10min。

5)rna樣品的質(zhì)量分析

分光光度計(jì)檢測(cè)：

nanodrop1000分光光度計(jì)檢測(cè)rna樣品，rna-seq測(cè)序的樣品要求：od260/od280為1.8-2.2。

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：

將上述提取的rna進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，agilenttechnologies2100bioanalyzer檢測(cè)rna樣品質(zhì)量，觀察28srrna和18srrna主帶明顯、無降解、rna完整性指數(shù)合格、濃度達(dá)到要求，可以用于芯片的lncrna表達(dá)譜及篩選實(shí)驗(yàn)。

3、逆轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記

用lowrnainputlinearamplificationkit將mrna逆轉(zhuǎn)錄成cdna，同時(shí)用cy3分別標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。

4、雜交

基因芯片采用康城生物-humanlncrnaarray，按芯片使用說明書的步驟進(jìn)行雜交。

5、數(shù)據(jù)分析

利用agilentgenespring軟件對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行分析，篩選表達(dá)量具有顯著性差異(標(biāo)準(zhǔn)為該lncrna在癌與癌旁的表達(dá)量相差2倍以上，而且p<0.05)的lncrna。

6、結(jié)果

結(jié)果顯示，linc00858在肺腺癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織中的表達(dá)量。

實(shí)施例2qpcr測(cè)序驗(yàn)證linc00858基因的差異表達(dá)

1、對(duì)linc00858基因差異表達(dá)進(jìn)行大樣本qpcr驗(yàn)證。按照實(shí)施例1中的樣本收集方式選擇肺腺癌癌旁組織和肺腺癌組織各50例。

2、rna提取步驟如實(shí)施例1所述。

3、逆轉(zhuǎn)錄

1)反應(yīng)體系：

rna模板1μl，隨機(jī)引物1μl，雙蒸水加至12μl，混勻，低轉(zhuǎn)速離心，65℃5min，然后放在冰上冷卻。

繼續(xù)在12μl反應(yīng)液中加入下列成分：

5×反應(yīng)緩沖液4μl，rna酶抑制劑(20u/μl)1μl，10mmdntp混合液2μl，amv反轉(zhuǎn)錄酶(200u/μl)1μl；充分混勻并進(jìn)行離心處理；

2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件

25℃5min，42℃60min，70℃5min。

3)聚合酶鏈反應(yīng)

引物設(shè)計(jì)：

根據(jù)genebank中l(wèi)inc00858基因和gapdh基因的編碼序列設(shè)計(jì)qpcr擴(kuò)增引物，由博邁德生物公司合成。具體引物序列如下：

linc00858基因：

正向引物為5’-gccgaatcctactaacaa-3’(seqidno.2)；

反向引物為5’-gtggtatctggacttctg-3’(seqidno.3)。

gapdh基因：

正向引物為5’-aatcccatcaccatcttccag-3’(seqidno.4)；

反向引物為5’-gagccccagccttctccat-3’(seqidno.5)。

配制pcr反應(yīng)體系：

2×qpcr混合液12.5μl，基因引物2.0μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5μl，ddh2o8.0μl。

pcr反應(yīng)條件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40個(gè)循環(huán)，60℃5min延伸反應(yīng)。75℃至95℃，每20s升溫1℃，繪制溶解曲線。以sybrgreen作為熒光標(biāo)記物，在lightcycler熒光定量pcr儀上進(jìn)行pcr反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進(jìn)行相對(duì)定量。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，癌與癌旁組織的配對(duì)比較采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與肺腺癌癌旁組織相比，linc00858在肺腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，同芯片檢測(cè)結(jié)果一致。

實(shí)施例3linc00858基因的沉默

1、細(xì)胞培養(yǎng)

人肺腺癌細(xì)胞株a549，以含10％胎牛血清和1％p/s的rpmi1640培養(yǎng)基在37℃、5％co2、相對(duì)濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用胰酶進(jìn)行消化并接種在6孔板中，保證細(xì)胞數(shù)為2-8×10⁵個(gè)/孔，加入細(xì)胞培養(yǎng)基。過夜，第二天觀察細(xì)胞密度，細(xì)胞密度為70％以上可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2、sirna的設(shè)計(jì)

陰性對(duì)照sirna序列(sirna-nc)：

正義鏈為5’-uucuccgaacgugucacgu-3’(seqidno.6)

反義鏈為5’-acgugacacguucggagaa-3’(seqidno.7)

sirna-1：

正義鏈為5’-auauguguguaaagacaacuc-3’(seqidno.8)

反義鏈為5’-guugucuuuacacacauauac-3’(seqidno.9)

sirna-2：

正義鏈為5’-uacacuaaaggaaugucucuc-3’(seqidno.10)

反義鏈為5’-gagacauuccuuuaguguauc-3’(seqidno.11)

3、轉(zhuǎn)染

將實(shí)驗(yàn)分為三組：對(duì)照組(a549)、陰性對(duì)照組(sirna-nc)和實(shí)驗(yàn)組(sirna1、sirna2)，其中陰性對(duì)照組sirna與linc00858基因的序列無同源性，濃度為20nm/孔，同時(shí)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

4、qpcr檢測(cè)linc00858基因的轉(zhuǎn)錄水平

4.1細(xì)胞總rna的提取

1)將6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液倒掉，用pbs沖洗兩次，各孔加入1mltrizol試劑，室溫放置5min。

2)加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩15s，4℃，12000g離心15min。

3)水相轉(zhuǎn)移到新管中，加入4.5ml異丙醇，室溫放置10min；4℃，10000g離心10min。

4)倒掉液體，用lml的75％乙醇洗ep管壁。4℃，7500g，離心5min。

5)倒掉清洗后的75％乙醇，室溫晾置5-10min。

6)加入25μl無rna酶的depc水，-70℃保存。

4.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實(shí)施例2。

4.3qpcr擴(kuò)增步驟同實(shí)施例2。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，linc00858基因?qū)嶒?yàn)組與對(duì)照組之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖2顯示，與非轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染sirna-nc組相比，實(shí)驗(yàn)組中的linc00858的表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

實(shí)施例4linc00858基因?qū)Ψ蜗侔┘?xì)胞增殖的影響

采用cck-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)linc00858基因?qū)Ψ蜗侔┘?xì)胞增殖能力影響。

1、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例3，轉(zhuǎn)染后6h換液，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜。

2、第二天將細(xì)胞取出，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，1ml/孔加入含edta的胰酶，進(jìn)行細(xì)胞消化，待消化完成后去除胰酶，加入細(xì)胞培養(yǎng)基混勻使細(xì)胞懸浮，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

3、將細(xì)胞懸液濃度稀釋為15000個(gè)/ml，之后往96孔板中進(jìn)行接種，每孔加入細(xì)胞懸液200μl，細(xì)胞控制在3000個(gè)左右，接種8個(gè)復(fù)孔。設(shè)置sirna-1實(shí)驗(yàn)組和sirna-nc對(duì)照組。共鋪4塊96孔板分別用于24h、48h、72h、96h4個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。

4、24h后，將第一塊96孔板取出，每孔中加入10μl的cck-8檢測(cè)液，將96孔板繼續(xù)放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4h左右，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450nm波長(zhǎng)處的吸光度值并記錄數(shù)據(jù)。

5、在48h、72h、96h后分別重復(fù)步驟4中的操作，最后統(tǒng)計(jì)出各時(shí)間點(diǎn)的吸光度值，作出生長(zhǎng)曲線圖。

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

7、結(jié)果

結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照相比，實(shí)驗(yàn)組在轉(zhuǎn)染sirna-1后，細(xì)胞的增殖明顯受到了抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)說明linc00858具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。

實(shí)施例5linc00858基因?qū)Ψ蜗侔┘?xì)胞凋亡的影響

使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)linc00858基因?qū)?xì)胞凋亡的影響。

1、細(xì)胞培養(yǎng)步驟同實(shí)施例3。

2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例3。

3、步驟

1)將3ml10×上樣緩沖液用27ml蒸餾水稀釋。

2)收集細(xì)胞樣本并用預(yù)冷的pbs清洗。

3)將細(xì)胞加入lml1×上樣緩沖液，300g離心10min，吸出緩沖液。

4)再次加入lml1×上樣緩沖液，將細(xì)胞懸液中細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10⁶個(gè)/ml。

5)將細(xì)胞懸液取出100μl，加入ep管中。

6)將5μl的annexinvfitc加入ep管中，混勻ep管中的液體，在室溫下避光孵育10min。

7)向ep管中加入5μlpi染液，在室溫下避光5min。

8)在ep管中加入500μl的pbs溶液，輕輕混勻，1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用的t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4、結(jié)果：

結(jié)果如圖4所示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率無顯著的變化(p<0.05)，該結(jié)果說明，linc00858對(duì)肺腺癌細(xì)胞的凋亡無明顯的影響。

實(shí)施例6細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)

1、transwell小室制備

無菌條件下matrigel冰浴融化，用pbs進(jìn)行20倍稀釋，以50μl/孔的體積鋪在transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃放置4h，待matrigel膠聚合成凝膠后取出，輕輕吸出上層析出液。每孔中加入50μl的含bsa的無血清培養(yǎng)液對(duì)基底膜進(jìn)行水化處理，37℃放置30min。

2、配置細(xì)胞懸液

細(xì)胞撤血清饑餓處理12-24h，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化處理，終止消化后進(jìn)行離心，去除上層培養(yǎng)液。用pbs對(duì)沉淀細(xì)胞進(jìn)行清洗，加入含有bsa的無血清培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行重懸。調(diào)整細(xì)胞的密度至5×l0⁵個(gè)/ml。

3、細(xì)胞接種

取細(xì)胞懸液200μl(遷移實(shí)驗(yàn)為100μl，侵襲實(shí)驗(yàn)為200μl)加入到transwell小室中。在24孔板下室加入500μl含fbs的1640培養(yǎng)基。把細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

4、染色

細(xì)胞在培養(yǎng)結(jié)束后使用dapi染色。把小室細(xì)胞先用pbs漂洗2遍，放入dapi工作液中室溫染色5-20min。用pbs漂洗2遍，放入熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖5所示，在肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾rna之后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的遷移及侵襲能力均有明顯下降，結(jié)果說明linc00858能夠促進(jìn)肺腺癌的遷移及侵襲。

上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院

<120>一種肺腺癌的診治靶標(biāo)

<160>11

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2685

<212>dna

<213>人源

<400>1

aagatggccgaataggaacagctccggtctacagctcccagcgtgagcgacgcagaagac60

gggtgatttctgcatttccatctgagttaggcttggccacaagagacaaattgcaaggca120

tggagacatttttctaacacttgaaaattctatgcaagagcaccaggcagctcagtcacc180

ttgtcacttatctactgggtcaccttgttggcatgggatgccagccaggcttgcagctgc240

tccatcctcccctgaatttgtacttcagcttctccactcatggcctgccctgaggacttc300

atggttcagcatcagatatgaagacgacagccctatagagactatttaaccagcttctaa360

ggtggttaaatatcttaccagcctatgtaaggccgaatcctactaacaaagcactggtat420

atgtaatatcccagtggtttgcttctctaattgaaccctgactactacagaagtccagat480

accacagtctgagtagttctttaatctgcttatctggtgattccatcacaaatggttcag540

ttgggcaaaaggctccagtgaagagctgtgaggcttatgtatggggactcaccaggggcc600

agcccaggctgcccacaagaccatgagccaccctgtgactgaatgaagtggagagaaggg660

aaagtagttaagaaatcaagaaaagtgtctttcagcaccatggccagaagttgtgccaca720

gaattggaacagggaaacccagagagccagtgctgtcctagtcctagtgctgaatgatcc780

cattggtgtccttagaagggctctgacttcagcccaccagcagcatgtggacttataagc840

tttctagcagagttggagatccccaggaaaaagaaatctcttaaaatgaaatgaaacttc900

aatcaaccaaggctttctagcctgatgtgagttgtctttacacacatatacctttttaac960

aaagaagaagaaaagaatggacattgatagaacttgcattctgtgttcatcaccaggata1020

gttgctttataaatatcattttgtttttagtcacaacccaatgcagcattttccttactg1080

acaaagaacctgaggcatggagaatttaagcaactccctgaaggccacccagctaatcag1140

cagtgggaaaagaatttaattctagatctttcattctaaagcccagctccttacacacgt1200

tggatgctactatttccaaaatgtcaacaacactttggactatcaacctgtctaaagagt1260

atttgaagcagtgatgcaggcctctgaaggaaaaggtgcacattttcaacaataaaagag1320

agacattcctttagtgtatctccacattccctgaaggggagctggaatgacatgacggac1380

ttggcctcagggccccaagccttccctgttgcagtcttcatgacactcctcagaagcagc1440

aactccagccatgtctggaaccattccttaccagacaggaggatatcatggcctcaactc1500

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