本發(fā)明涉及中藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種大黃酸超分子水凝膠制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大黃酸是源于中藥大黃的一種游離型蒽醌類物質(zhì)，分子式是CH₁₅H₈O₆。大黃酸是一種來(lái)源于天然的抗氧化劑和抗炎物質(zhì)，毒副作用較小，而且具有很好的抗氧化和抗炎作用，因此在抗腫瘤，抗炎，瀉下，神經(jīng)保護(hù)，調(diào)脂等方面具有較高活性。

小膠質(zhì)細(xì)胞作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞，是參與大腦免疫炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞。在阿爾茨海默病、帕金森病、腦外傷、腦水腫等小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性疾病中，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后，靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，遷移至損傷的腦細(xì)胞區(qū)?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞可分泌誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）和白介素12（IL-12）等多種細(xì)胞炎癥因子，這些炎癥因子參與炎癥反應(yīng)的免疫應(yīng)答。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化從而減輕炎癥因子的表達(dá)對(duì)治療阿爾茨海默病、帕金森病、腦外傷、腦水腫等小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)揮著重要的神經(jīng)保護(hù)作用。

大黃酸對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有良好的抗炎藥理作用，但是，大黃酸的剛性結(jié)構(gòu)使其溶解性差，導(dǎo)致了生物利用度降低。另一方面，由于傳統(tǒng)的中藥劑型在人體有一定的藥物半衰期，并且在病變部位作用的時(shí)間較短，難以起到應(yīng)有的療效。因此需要一種新的劑型來(lái)提高大黃酸的緩釋效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等特性的大黃酸超分子水凝膠，可解決大黃酸溶解性差、半衰期短的問(wèn)題，并保留了大黃酸的生物活性。本發(fā)明還提供了上述大黃酸超分子水凝膠的制備方法，制備工藝簡(jiǎn)單。本發(fā)明還提供了上述大黃酸超分子水凝膠在制備治療阿爾茨海默病、帕金森病、腦外傷、腦水腫等小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性腦病的藥物中應(yīng)用，治療效果明顯。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種大黃酸超分子水凝膠，包括大黃酸和NaHCO₃溶液，所述大黃酸溶解于NaHCO₃溶液中。

上述的大黃酸超分子水凝膠，優(yōu)選的，所述大黃酸的濃度大于4 mg/mL，所述NaHCO₃溶液的濃度為0.2～0.5 mol/L。

上述的大黃酸超分子水凝膠，優(yōu)選的，所述大黃酸的濃度為5～8 mg/mL。

作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種大黃酸超分子水凝膠的制備方法，將大黃酸溶于NaHCO₃溶液中，超聲分散得到大黃酸超分子水凝膠。

上述的制備方法，優(yōu)選的，所述大黃酸的濃度大于4 mg/mL，所述NaHCO₃溶液的濃度為0.2～0.5 mol/L。

上述的制備方法，優(yōu)選的，所述大黃酸的濃度為5～8 mg/mL。

上述的制備方法，優(yōu)選的，所述超聲分散的功率為70～120 W；超聲分散的時(shí)間為30～60 min，所述超聲分散的溫度不超過(guò)37 ℃。

作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種上述的大黃酸超分子水凝膠或上述制備方法制備得到的大黃酸超分子水凝膠在制備治療小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)相關(guān)疾病的藥物或在制備用于治療小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性腦病藥物中的應(yīng)用。

作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種上述的大黃酸超分子水凝膠或上述制備方法制備得到的大黃酸超分子水凝膠在制備用于減輕或治療小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用。

作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種上述的大黃酸超分子水凝膠或上述制備方法制備得到的大黃酸超分子水凝膠在制備用于治療阿爾茨海默病、帕金森病、腦外傷、腦水腫藥物或在制備用于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞藥物的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

（1）本發(fā)明提供了一種大黃酸超分子水凝膠，大黃酸超分子水凝膠的形貌是納米纖維，其有自緩釋的，不僅解決了大黃酸溶解性差的問(wèn)題，而且保留了大黃酸的生物活性，又延長(zhǎng)了大黃酸在病變位置的作用時(shí)間，增強(qiáng)了藥物的治療效果。本發(fā)明制備的大黃酸超分子水凝膠，首次提出了以中藥單體大黃酸作為凝膠因子，在NaHCO₃溶液中利用π-π鍵、氫鍵、離子鍵、疏水作用等非共價(jià)鍵作用通過(guò)自組裝成具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大黃酸超分子水凝膠，

（2）本發(fā)明提供了一種大黃酸超分子水凝膠的制備方法，在水凝膠形成過(guò)程中，超聲作用促使體系迅速形成微小晶核，然后生長(zhǎng)成纖維狀骨架結(jié)構(gòu)，纖維之間相互搭接形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而基于表面張力作用與水結(jié)合形成凝膠，制備過(guò)程簡(jiǎn)單，成本低，可商業(yè)化，適于大規(guī)模生產(chǎn)有望運(yùn)用在組織工程、藥物緩釋、傷口愈合、抑制炎癥和神經(jīng)保護(hù)等生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中大黃酸溶液和大黃酸超分子水凝膠的掃描電子顯微鏡（SEM）圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中大黃酸溶液和大黃酸超分子水凝膠的數(shù)碼照片圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中大黃酸超分子水凝膠和大黃酸粉末的傅里葉紅外譜圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中大黃酸超分子水凝膠的紫外譜圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中大黃酸超分子水凝膠和大黃酸對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞生成誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）水平的影響。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例4中大黃酸超分子水凝膠和大黃酸對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞生成腫瘤壞死因子α（TNF-α）炎癥因子水平的影響。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例4中大黃酸超分子水凝膠和大黃酸LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞生成白介素6（IL-6）炎癥因子水平的影響。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例4中大黃酸超分子水凝膠和大黃酸LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞生成白介素12（IL-12）炎癥因子水平的影響。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

以下實(shí)施例中所采用的材料和儀器均為市售。

實(shí)施例1

本發(fā)明的一種大黃酸超分子水凝膠，包括大黃酸和NaHCO₃溶液，大黃酸溶解于NaHCO₃溶液中，采用以下制備方法制備得到：

（1）稱取1.68 g NaHCO₃于燒杯中，加入超純水?dāng)嚢枞芙猓缓筠D(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，加水定容，配置濃度0.2 mol/L的NaHCO₃溶液。

（2）分別稱取1 mg、2 mg和6 mg大黃酸于相應(yīng)的螺口瓶中，向每個(gè)螺口瓶中邊震蕩邊加入1 mL濃度為0.2 mol/L的NaHCO₃溶液，然后以100 W的超聲功率進(jìn)行超聲分散30 min，溫度不超過(guò)37℃，分別制備出1 mg/mL、2 mg/mL的大黃酸溶液和6 mg/mL大黃酸超分子水凝膠。

分別將1 mg/mL、2 mg/mL的大黃酸溶液和6 mg/mL大黃酸超分子水凝膠進(jìn)行電鏡掃描。

電鏡掃描的實(shí)驗(yàn)步驟：

1、硅片的清洗：先用水虎魚（濃硫酸（v）∶雙氧水（v）=7∶3）超聲清洗15 min，然后用乙醇超聲清洗15 min，最后用蒸餾水超聲清洗15 min（2次），用氮?dú)獍压杵蹈伞?/p>

2、將1 mg/mL、2 mg/mL的大黃酸溶液和6 mg/mL大黃酸超分子水凝膠，分別取10 μL于吹干凈的硅片上，在冷凍12 h，放入冷凍干燥機(jī)中干燥12 h，然后進(jìn)行電鏡掃描。由于生物樣品導(dǎo)電性差，掃描之前要噴金處理。

圖1為本實(shí)施例1 mg/mL、2 mg/mL的大黃酸溶液和6 mg/mL的大黃酸超分子水凝膠電鏡掃描結(jié)果。a、b、c分別為1 mg/mL、2 mg/mL、6 mg/mL的大黃酸超分子水凝膠，如圖所示，當(dāng)大黃酸濃度為1 mg/mL（溶液狀態(tài)），所得到的SEM形貌是針狀的納米棒結(jié)構(gòu)。隨著濃度增加到2 mg/mL 時(shí)，納米棒逐漸變粗，繼續(xù)增加濃度到6 mg/mL時(shí)，最終獲得的是具有三維網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu)大黃酸超分子水凝膠。隨著濃度的增大，大黃酸分子從針狀納米棒通過(guò)非共價(jià)作用自組裝形成納米纖維。

實(shí)施例2

本發(fā)明的一種大黃酸超分子水凝膠，包括大黃酸和NaHCO₃溶液，大黃酸溶解于NaHCO₃溶液中，采用以下制備方法制備得到：

（1）稱取1.68 g NaHCO₃于燒杯中，加入超純水?dāng)嚢枞芙?，然后轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，加水定容，配置濃度0.2 mol/L的NaHCO₃溶液。

（2）分別稱取4 mg 和5 mg大黃酸于螺口瓶中，向螺口瓶中邊振動(dòng)邊加入1 mL步驟（1）的NaHCO₃溶液，然后以70W的超聲功率進(jìn)行超聲分散30 min，溫度不超過(guò)37℃，制備出4 mg/mL的大黃酸溶液和5 mg/mL大黃酸超分子水凝膠。

用數(shù)碼相機(jī)記錄大黃酸溶液和大黃酸超分子水凝膠的外觀。圖3中，（a）為大黃酸溶液數(shù)碼照片圖，（b）為大黃酸超分子水凝膠的數(shù)碼照片圖。在大黃酸粉末中加入0.2 mol/L的NaHCO₃溶液獲得乳狀液，濃度達(dá)到5 mg/mL時(shí)，超聲30 min后，大黃酸分子單體通過(guò)π-π鍵、氫鍵、離子鍵、疏水作用等非共價(jià)鍵作用通過(guò)自組裝形成大黃酸超分子水凝膠，當(dāng)濃度為4 mg/mL時(shí)，超聲后不能形成大黃酸超分子水凝膠，得到的是大黃酸溶液，如圖2（a）所示，所以5 mg/mL是大黃酸超分子水凝膠的臨界凝膠濃度。

傅里葉紅外測(cè)試實(shí)驗(yàn)步驟：把6 mg/mL的大黃酸超分子水凝膠冷凍干燥得到干凝膠，然后分別稱取等質(zhì)量的凍干水凝膠與一定質(zhì)量的溴化鉀壓片，得到片狀的樣品，進(jìn)行紅外測(cè)試，大黃酸粉末固體作為對(duì)照。

圖3為大黃酸超分子水凝膠和大黃酸粉末的傅里葉紅外譜圖。圖3中曲線a是大黃酸粉末；曲線b是大黃酸超分子水凝膠。曲線a 中3448 cm^-1屬于的O-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，1962 cm^-1和1630 cm^-1分別屬于C=O的非對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，出現(xiàn)在1692 cm^-1和1452 cm^-1的吸收峰屬于芳環(huán)骨架的伸縮振動(dòng)峰，位于1268 cm^-1處的峰屬于C-O的伸縮振動(dòng)峰，出現(xiàn)在808 cm^-1處的峰屬于O-H的彎曲振動(dòng)吸收峰；曲線b 為大黃酸在堿性NaHCO₃中自組裝形成大黃酸超分子水凝膠的圖譜。在3446 cm^-1處是O-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，出現(xiàn)在1635 cm^-1處的峰屬于C=O稱伸縮振動(dòng)吸收峰，這表明大黃酸超分子水凝膠的形成是通過(guò)氫鍵相互作用的，在1692 cm^-1處的峰消失了，在1378 cm^-1處出現(xiàn)了相對(duì)較寬的峰，說(shuō)明了在自組裝形成大黃酸超分子水凝膠的過(guò)程中發(fā)生了π-π堆積，氫鍵相互作用。

實(shí)施例3

一種本發(fā)明的大黃酸超分子水凝膠，包括大黃酸和NaHCO₃溶液，大黃酸溶解于NaHCO₃溶液中，采用以下方法制備得到：

（1）稱取1.68 g NaHCO₃于燒杯中，加入超純水?dāng)嚢枞芙?，然后轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，加水定容，配置濃度0.2 mol/L的NaHCO₃溶液。

（2）分別稱取5 mg、6 mg、7 mg和8 mg大黃酸于相應(yīng)的螺口瓶中，向螺口瓶中邊振動(dòng)邊加入1 mL實(shí)施例1的NaHCO₃溶液，以100 W的超聲功率進(jìn)行超聲分散30 min，溫度不能超過(guò)37℃，分別制備出5 mg/mL、6mg/mL、7 mg/mL和8 mg/mL的大黃酸超分子水凝膠。

分別將本實(shí)施例中5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL和8 mg/mL的大黃酸超分子水凝膠進(jìn)行紫外測(cè)試。

測(cè)試結(jié)果如圖4所示，不同濃度下的大黃酸超分子水凝膠紫外光譜顯示，隨著濃度的增大，其紫外吸收峰出現(xiàn)紅移，可能是大黃酸分子發(fā)生π-π堆積。π-π堆積越顯著，紅移現(xiàn)象越明顯。

實(shí)施例4

一種本發(fā)明的大黃酸超分子水凝膠在治療小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性疾病中的應(yīng)用，具體方法包括以下步驟：

1. 藥物的配制：

含藥培基1的配制：取濃度為6 mg/mL的大黃酸超分子水凝膠母液，加入培養(yǎng)基中稀釋得到含藥培基1，含藥培基1中大黃酸超分子水凝膠濃度4.5 μg/mL。

含藥培基2的配制：取濃度為6 mg/mL的大黃酸單體母液，加入到培養(yǎng)基中，配制含藥培基2，含藥培基2中大黃酸單體濃度4.5 μg/mL。

2. 大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞（BV2細(xì)胞系）炎癥性模型的制備：

大黃酸組：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞，用胰酶消化液消化，制成細(xì)胞懸液；鋪板，保證每孔70%的覆蓋率。過(guò)夜，細(xì)胞貼壁；去除BV2細(xì)胞的培基，加入含藥培基2，并標(biāo)號(hào)；待于含藥培基2處理30 min后，每孔加入1 μg/mL的脂多糖（LPS），處理48 h后收集細(xì)胞和上清液，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

大黃酸超分子水凝膠組：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞，用胰酶消化液消化，制成細(xì)胞懸液；鋪板，保證每孔70%的覆蓋率。過(guò)夜，細(xì)胞貼壁；去除BV2細(xì)胞的培基，加入含藥培基1，并標(biāo)號(hào)；待含藥培基1處理30 min后，每孔加入1 μg/mL的LPS，處理48 h后收集細(xì)胞和上清液，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

LPS組：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞，用胰酶消化液消化，制成細(xì)胞懸液；鋪板，保證每孔70%的覆蓋率。過(guò)夜，細(xì)胞貼壁；去除BV2細(xì)胞的培基，加入新鮮不含藥物的培基，并標(biāo)號(hào)，30 min后，加入1 μg/mL的LPS，處理48 h后收集細(xì)胞和上清液，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

空白組：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞，用胰酶消化液消化，制成細(xì)胞懸液；鋪板，保證每孔70 %的覆蓋率。過(guò)夜，細(xì)胞貼壁；去除BV2細(xì)胞的培基，加入新鮮不含藥物的培基，并標(biāo)號(hào)。

3. ELISA法測(cè)定小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素6（IL-6）和白介素12（IL-12）的表達(dá)：

（1）實(shí)驗(yàn)儀器：臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)湘儀 （H1650R）；全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)匯松 （PW-812）；多功能酶標(biāo)分析儀匯松 （MB-530）；恒溫培養(yǎng)箱光明（DHP-500）；自動(dòng)平衡離心機(jī)湘儀（L530）；干凈試管和離心管；容量瓶；系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭。

（2）樣本采集；分別收集每孔板中的細(xì)胞上清，于10000 rpm離心10 min，仔細(xì)吸取上清，-20℃冰箱保存留作實(shí)驗(yàn)的樣本，實(shí)驗(yàn)之前從冰箱取出，自然解凍。

（3）實(shí)驗(yàn)試劑的配制：

本實(shí)施例中，試劑盒為武漢華美生物科技有限公司生產(chǎn)的ELISA法試劑盒，其中各試劑盒的批號(hào)如下：一氧化氮合酶試劑盒為L(zhǎng)ot:A16039818，腫瘤壞死因子的試劑盒為L(zhǎng)ot：Z06939817，白介素6的試劑盒為L(zhǎng)ot:Z01039820，白介素12的試劑盒為L(zhǎng)ot:Z01039822。

標(biāo)準(zhǔn)品：從試劑盒中取出一支標(biāo)準(zhǔn)品，于10000 rpm離心30 s。用1 mL 樣本稀釋液（本實(shí)施例為10 mmol/L的PBS（磷酸氫二鈉～磷酸二氫鉀），PH值為7.3，0.05 % 的吐溫-20(體積比)，0.5%的牛血清蛋白（BSA）溶解，并用槍頭對(duì)準(zhǔn)凍存管底部反復(fù)吸打5次以助溶解，充分混勻得到標(biāo)準(zhǔn)品S₇，放置備用；取7個(gè)1.5 mL離心管，編號(hào)為S₆～S₀。將離心管依次排列，各加入250 μL樣本稀釋液。吸取250 μL標(biāo)準(zhǔn)品S₇到第一個(gè)離心管中（S₆），輕輕吹打混勻。從S₆中吸取250 μL到第二個(gè)EP管（S₅），輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋。S₀為樣本稀釋液。

洗滌工作液：將濃洗滌液（本實(shí)施例為0.02 mol/L PBS (PH=7.4)加上0.05%吐溫-20）按1∶25倍用去離子水進(jìn)行稀釋，具體為：用量筒量取240 mL去離子水，倒入燒杯或其他潔凈容器中，再量取10 mL濃洗滌液，均勻加入，攪拌混勻，在臨用前配妥。濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

生物素標(biāo)記抗體工作液： 將生物素標(biāo)記抗體液（本實(shí)施例為10 mg/mL生物素 N- 羥基琥珀酰亞胺酯溶液）按1∶100倍用生物素標(biāo)記抗體稀釋液進(jìn)行稀釋，具體為：10 μL生物素標(biāo)記抗體液加990 μL生物素標(biāo)記抗體稀釋液，輕輕混勻，在臨用前10 min內(nèi)配妥。

辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素（本實(shí)施例采用的為武漢華美生物科技有限公司生產(chǎn)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素）按1∶100倍用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液進(jìn)行稀釋，具體為：10 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素加990 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液，輕輕混勻，在臨用前10 min。

（4）操作步驟：

4.1、將各種試劑移至室溫（18～25℃）平衡至少30 min，按前述方法配置試劑，備用。

4.2、加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣本孔，每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本100 μL，輕輕晃動(dòng)混勻，覆上板貼，置37 ℃溫育2 h。

4.3、棄去液體，甩干，不用洗滌。

4.4、每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，覆上新的板貼，置37℃溫育1 h。

4.5、棄去孔內(nèi)液體，甩干，采用配制的洗滌工作液洗板3次。每次洗板，將洗滌工作液浸泡2 min，200 μL每孔，甩干。

4.6、每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μL，覆上新的板貼，置37℃ 溫育1 h。

4.7、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200 μL每孔，甩干。

4.8、依序每孔加底物溶液90 μL，37℃ 避光顯色15 min。

4.9、依序每孔加終止液（本實(shí)施例為2 mol/L H₂SO₄溶液）50 μL，終止反應(yīng)。

4.10、在反應(yīng)終止后5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值），計(jì)算各個(gè)炎癥因子的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)圖5、圖6、圖7和圖8。

圖5為大黃酸超分子水凝膠和大黃酸對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）水平的影響，從圖5可以看出：與空白組比(^#p＜0.01)，LPS組iNOS水平顯著增加，說(shuō)明LPS 刺激BV2細(xì)胞產(chǎn)生iNOS水平明顯增加；與LPS組比較，大黃酸組iNOS表達(dá)水平明顯降低（^△p＜0.05），大黃酸超分子水凝膠組iNOS表達(dá)水平也顯著下降（*p＜0.01），這說(shuō)明大黃酸和大黃酸超分子水凝膠均能抑制iNOS的表達(dá)水平；與大黃酸組比，大黃酸超分子水凝膠組iNOS表達(dá)水平明顯下降（^□p＜0.01），這說(shuō)明大黃酸超分子水凝膠抑制iNOS的表達(dá)明顯優(yōu)于大黃酸。

圖6為大黃酸超分子水凝膠和大黃酸對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平的影響，從圖6可以看出：與空白組比( ^#p＜0.01 )，LPS組TNF-α水平顯著增加，說(shuō)明LPS 刺激BV2細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α水平明顯增加；與LPS組比較，大黃酸組TNF-α表達(dá)水平明顯降低（^△p＜0.05），大黃酸超分子水凝膠組TNF-α表達(dá)水平也顯著下降（^*p＜0.01），這說(shuō)明大黃酸和大黃酸超分子水凝膠均能抑制TNF-α的表達(dá)水平；與大黃酸組比，大黃酸超分子水凝膠組TNF-α表達(dá)水平明顯下降（^□p＜0.01），這說(shuō)明大黃酸超分子水凝膠抑制TNF-α的表達(dá)明顯優(yōu)于大黃酸。

圖7為大黃酸超分子水凝膠和大黃酸對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞白介素6（IL-6）水平的影響，從圖7可以看出：與空白組比(^#p＜0.01)，LPS組IL-6水平顯著增加，說(shuō)明LPS 刺激BV2細(xì)胞產(chǎn)生IL-6水平明顯增加；與LPS組比較，大黃酸組IL-6表達(dá)水平明顯降低（^△p＜0.05），大黃酸超分子水凝膠組IL-6表達(dá)水平也顯著下降（^*p＜0.01），這說(shuō)明大黃酸和大黃酸超分子水凝膠均能抑制IL-6的表達(dá)水平；與大黃酸組比，大黃酸超分子水凝膠組IL-6表達(dá)水平明顯下降（^□p＜0.01），這說(shuō)明大黃酸超分子水凝膠抑制IL-6的表達(dá)明顯優(yōu)于大黃酸。

圖8為大黃酸超分子水凝膠和大黃酸對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞白介素12（IL-12）水平的影響，從圖8可以看出：與空白組比(^#p＜0.01)，LPS組IL-12水平顯著增加，說(shuō)明LPS刺激BV2細(xì)胞產(chǎn)生IL-12水平明顯增加；與LPS組比較，大黃酸組IL-12表達(dá)水平明顯降低（^△p＜0.05），大黃酸超分子水凝膠組IL-12表達(dá)水平也顯著下降（^*p＜0.01），這說(shuō)明大黃酸和大黃酸超分子水凝膠均能抑制IL-12的表達(dá)水平；與大黃酸組比，大黃酸超分子水凝膠組IL-12表達(dá)水平明顯下降（^□p＜0.01），這說(shuō)明大黃酸超分子水凝膠抑制IL-12的表達(dá)明顯優(yōu)于大黃酸。

綜上所述，本發(fā)明的大黃酸超分子水凝膠能減少顯著降低一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子、白介素6、白介素12等細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，這表明，從而大黃酸超分子水凝膠可以用于治療或減輕阿爾茨海默病、帕金森病、腦外傷、腦水腫等小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在制備治療小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)相關(guān)疾病藥物、小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥性疾病藥物、阿爾茨海默病、帕金森病、腦外傷、腦水腫藥物、小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性腦病藥物、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞藥物中發(fā)揮著重要的作用。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)和技術(shù)方案的情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動(dòng)和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。