本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蟲(chóng)草素在制備預(yù)防和/或治療放射損傷以及制備腫瘤放療增敏的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

放射損傷指由電離放射所致的急性、遲發(fā)性或慢性的機(jī)體組織損害。大劑量放射可在數(shù)天內(nèi)產(chǎn)生可見(jiàn)的身體效應(yīng)，放射所導(dǎo)致的DNA損傷可使被照射者多種組織器官產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害，甚至還可使后代發(fā)生遺傳學(xué)缺陷。放射損傷的臨床演變過(guò)程和嚴(yán)重程度取決于放射源的類型、輻照劑量和劑量率、暴露部位和范圍等。

輻照損傷分為全身輻照損傷和局部輻照損傷。輻照損傷不僅表現(xiàn)在對(duì)皮膚的傷害，對(duì)其他器官和組織同樣會(huì)造成損害。全身輻照損傷主要表現(xiàn)在造血系統(tǒng)的損傷；局部輻照損傷主要表現(xiàn)在皮膚和腸道的傷害。在意外輻照事故中，由于高強(qiáng)度的放射源照射，局部輻照損傷占絕大部分。局部輻照損傷病情演變得比較慢，通常數(shù)天甚至數(shù)周以后才能表現(xiàn)其臨床癥狀，這些損傷雖然不足以致命，但是其延遲效應(yīng)可導(dǎo)致更嚴(yán)重的損傷。

大劑量放射損傷損傷尚缺乏理想的救治手段，目前針對(duì)全身放射損傷，已有一些抗放藥物的研究，但是對(duì)于局部組織器官損害，特別是針對(duì)大量受照人員的治療至今仍沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的治療方案。根據(jù)其癥狀，主要采取保守治療和手術(shù)治療。其中，保守治療的方法主要是減輕疼痛、減少炎癥、預(yù)防進(jìn)一步循環(huán)系統(tǒng)的感染、改善循環(huán)、加速愈合、傷口清潔和減少纖維化，但保守治療時(shí)效較慢。如果保守治療無(wú)效，則需要應(yīng)用外科治療和重建塑形外科學(xué)。雖然外科治療具有一定的治療效果，但技術(shù)要求高，操作復(fù)雜，而且由于輻照的延遲效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的繼發(fā)性損傷，局部病變可發(fā)展為持續(xù)性進(jìn)展性損害，初期采用外科治療很難確定其損傷的邊界。

蟲(chóng)草素(cordycepin)即3’-脫氧腺苷(3’-deoxyadenosine),是一種核苷類似物(nucleoside analogue)。蟲(chóng)草素化學(xué)名為3’-脫氧腺苷，其化學(xué)式為C₁₀H₁₃N₅O₃，是一種堿性針狀或片狀晶體，熔點(diǎn)228℃～231℃。蟲(chóng)草素親水性較強(qiáng)，在非極性溶劑中溶解度較低。蟲(chóng)草素是蟲(chóng)草中特有的活性成分，具有抗腫瘤、抗白血病、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂和抗支氣管哮喘等多種藥理作用。近年來(lái)，其潛在開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值已引起世界的高度重視。然而，蟲(chóng)草素對(duì)防治放射損傷的作用并不清楚，蟲(chóng)草素對(duì)放射損傷的影響未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供蟲(chóng)草素在制備預(yù)防和/或治療放射損傷的藥物中的應(yīng)用。該應(yīng)用提供了蟲(chóng)草素的新用途，也為放射損傷的預(yù)防和治療提供了新的藥物。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

蟲(chóng)草素在制備預(yù)防和/或治療放射損傷的藥物中的應(yīng)用。

所述放射損傷是指輻照引起的DNA和組織細(xì)胞損傷。

所述放射損傷是指輻照引起的DNA損傷或細(xì)胞抗氧化能力和集落形成能力降低。

所述放射損傷是指過(guò)氧化氫損傷細(xì)胞活力。

所述放射損傷是指輻照引起的造血系統(tǒng)損傷和造血系統(tǒng)的損傷。

所述放射損傷是指放創(chuàng)復(fù)合傷創(chuàng)面的形成以及瘢痕的形成。

所述放射損傷是指放射引起的皮膚潰瘍和水腫。

所述放射損傷是指真皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的損傷。

所述放射損傷是指局部腹部照射腸道損傷。

蟲(chóng)草素在制備腫瘤放療增敏藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的蟲(chóng)草素，具有以下結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明的有益效果在于：將蟲(chóng)草素用于預(yù)防和治療放射損傷，藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，蟲(chóng)草素能夠增強(qiáng)皮膚成纖維細(xì)胞抗氧化能力和集落形成能力，并減輕輻照引起的DNA損傷，以及減輕過(guò)氧化氫損傷細(xì)胞活力；以及能夠減輕輻照引起的造血系統(tǒng)損傷和促進(jìn)造血系統(tǒng)恢復(fù)，并促進(jìn)放創(chuàng)復(fù)合傷創(chuàng)面愈合，減輕瘢痕形成；能減輕大劑量照射引起的皮膚潰瘍和水腫，并增加真皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞再生修復(fù)；能促進(jìn)局部腹部照射腸道修復(fù)，減輕腸道損害；增強(qiáng)正常細(xì)胞保護(hù)功能同時(shí)對(duì)腫瘤放療增敏。由于蟲(chóng)草素為純天然物質(zhì)，因此有用藥較安全，毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，而且使用方便，為防治放射損傷和腫瘤放療增敏提供了新的藥物。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的蟲(chóng)草素能夠明顯增強(qiáng)皮膚成纖維細(xì)胞抗氧化能力和集落形成能力；其中，1a為蟲(chóng)草素預(yù)培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞，抗氧化蛋白(SOD1、SOD2、GPX-1)表達(dá)升高，1b為蟲(chóng)草素預(yù)培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞在不輻照或受輻照后的集落形成能力明顯強(qiáng)于未預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2的蟲(chóng)草素能夠明顯降低輻照引起的DNA損傷；其中，2a為與對(duì)照組細(xì)胞相比，蟲(chóng)草素培養(yǎng)能夠明顯減少輻照引起的細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX的形成，2b為使用蟲(chóng)草素預(yù)培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞，γ-H2AX蛋白明顯低于對(duì)照組；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3的蟲(chóng)草素能夠明顯降低過(guò)氧化氫損傷細(xì)胞活力；其為與對(duì)照組細(xì)胞相比，蟲(chóng)草素培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞能夠明顯減少H₂O₂培養(yǎng)引起的細(xì)胞活力降低；圖4為本發(fā)明實(shí)施例4的蟲(chóng)草素能夠降低輻照引起的造血系統(tǒng)損傷和促進(jìn)造血系統(tǒng)恢復(fù)；其為治療組與對(duì)照組于第3天白細(xì)胞數(shù)量急劇降低，但治療組降低程度無(wú)對(duì)照組明顯，同時(shí)治療組組白細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)更快，治療組到第20天白細(xì)胞水平基本恢復(fù)至正常；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例5的蟲(chóng)草素能促進(jìn)放創(chuàng)復(fù)合傷創(chuàng)面愈合，減輕瘢痕形成；其中，5a為與對(duì)照組相比，給藥組的創(chuàng)面愈合速度更快，5b、5c為與對(duì)照組相比，給藥組愈合后形成的瘢痕也更薄，表明蟲(chóng)草素能提高創(chuàng)傷愈合的速度和質(zhì)量；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例6的蟲(chóng)草素可顯著降低放射引起的皮膚潰瘍和水腫，并增加真皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞再生修復(fù)；其中，6a為與對(duì)照組相比，給藥組可顯著降低放射引起的皮膚潰瘍和水腫，6b為與對(duì)照組相比，給藥組可顯著增加真皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞再生修復(fù)，6c為給藥組真皮層纖維組織致密、間隙小，對(duì)照組表現(xiàn)為表現(xiàn)為纖維組織稀疏、散亂、無(wú)規(guī)則，6d為對(duì)照組肌纖維密度出現(xiàn)顯著降低，表現(xiàn)為骨骼肌結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞間隙明顯增大；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例7的蟲(chóng)草素促進(jìn)局部腹部照射腸道修復(fù)，減輕腸道損害，其中，7a為與對(duì)照組相比，給藥組的小腸損傷程度輕，小腸絨毛完整，7b為預(yù)防組、治療組K i67陽(yáng)性率明顯多于對(duì)照組；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例8的蟲(chóng)草素對(duì)人支氣管上皮樣細(xì)胞(HBE)活力影響小，同時(shí)能顯著降低腫瘤A549和H460細(xì)胞活力，蟲(chóng)草素能夠增加人支氣管上皮樣細(xì)胞(HBE)集落形成能力同時(shí)降低腫瘤A549細(xì)胞集落形成能力。8a為蟲(chóng)草素對(duì)人支氣管上皮樣細(xì)胞(HBE)活力影響小，同時(shí)能顯著降低腫瘤A549和HBE細(xì)胞活力，8b為蟲(chóng)草素預(yù)培養(yǎng)過(guò)的人支氣管上皮樣細(xì)胞(HBE)在不輻照或受輻照后的集落形成能力明顯強(qiáng)于未預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞，8c為與未預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞相比，蟲(chóng)草素預(yù)培養(yǎng)過(guò)的腫瘤A549細(xì)胞在不輻照或受輻照后的集落形成能力明顯少于未預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例中所采用的試劑與儀器：

細(xì)胞培養(yǎng)使用美國(guó)Thermo Fisher公司CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號(hào)HERAcell 150i)。

細(xì)胞活力使用日本Dojindo公司CCK-8試劑，并用美國(guó)Thermo Fisher公司全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Multiskan GO，型號(hào)1510)在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。

免疫組化實(shí)驗(yàn)使用日本Olympus公司熒光顯微鏡(型號(hào)BX51)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

所有一抗均購(gòu)買(mǎi)于Cell Signaling公司，二抗購(gòu)買(mǎi)于碧云天公司。

其余試劑采用市售的生物級(jí)產(chǎn)品。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1

抗氧化蛋白的檢測(cè)

把蟲(chóng)草素溶解于低糖培養(yǎng)基，使蟲(chóng)草素在低糖培養(yǎng)基的濃度為200μM。用含200μM蟲(chóng)草素的低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間分別為0、2、4、6、8、12、24、48、72、96h。細(xì)胞用含蟲(chóng)草素的低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)后，收集細(xì)胞并加入蛋白裂解液裂解細(xì)胞，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，將變性后的蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗封閉過(guò)夜后加二抗顯影。檢測(cè)的抗氧化蛋白有SOD1、SOD2、GPX-1。結(jié)果顯示，使用蟲(chóng)草素預(yù)培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞，抗氧化蛋白(SOD1、SOD2、GPX-1)水平升高(圖1a)。

集落形成試驗(yàn)

把蟲(chóng)草素溶解于低糖培養(yǎng)基，使蟲(chóng)草素在低糖培養(yǎng)基的濃度分別為0、100、200、300μM。分別用含0、100、200、300μM蟲(chóng)草素的低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞、人支氣管上皮樣細(xì)胞(HBE)和腫瘤A549細(xì)胞72h后，換成無(wú)蟲(chóng)草素的低糖培養(yǎng)基。每種細(xì)胞一組接受5Gy照射劑量γ射線照射，另一組不輻照，細(xì)胞重新接種于6孔培養(yǎng)板(1×103/孔)培養(yǎng)(無(wú)蟲(chóng)草素的低糖培養(yǎng)基)14天，直到集落清晰可見(jiàn)。4％多聚甲醛固定后使用0.5％結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)超過(guò)50個(gè)細(xì)胞的單個(gè)集落數(shù)。結(jié)果顯示，使用蟲(chóng)草素預(yù)培養(yǎng)過(guò)的人真皮成纖維細(xì)胞(圖1b)和人支氣管上皮樣細(xì)胞(圖8b)在不輻照或受輻照后的集落形成能力明顯強(qiáng)于未預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞，與未預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞相比，蟲(chóng)草素預(yù)培養(yǎng)過(guò)的腫瘤A549細(xì)胞在不輻照或受輻照后的集落形成能力明顯少于未預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞(圖8c)。

實(shí)施例2

γ-H2AX形成試驗(yàn)

把蟲(chóng)草素溶解于低糖培養(yǎng)基，使蟲(chóng)草素在低糖培養(yǎng)基的濃度為200μM。用含200μM蟲(chóng)草素的低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞72h，72h后把細(xì)胞接種于蓋玻片上，培養(yǎng)(無(wú)蟲(chóng)草素的低糖培養(yǎng)基)過(guò)夜后進(jìn)行5Gyγ射線照射。分別于照射后不同時(shí)間(0.5、2、6、12、24h)用4％多聚甲醛固定細(xì)胞，1％triton溶液培養(yǎng)后山羊血清封閉30分鐘，γ-H2AX抗體4℃孵育過(guò)夜，山羊抗鼠熒光二抗37℃避光孵育2小時(shí)，DAPI復(fù)染細(xì)胞核后用熒光顯微鏡采集圖像觀察γ-H2AX形成情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，蟲(chóng)草素培養(yǎng)能夠明顯減少輻照引起的細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX的形成(圖2a)。

γ-H2AX蛋白檢測(cè)

把蟲(chóng)草素溶解于低糖培養(yǎng)基，使蟲(chóng)草素在低糖培養(yǎng)基的濃度為200μM。用含200μM蟲(chóng)草素的低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞72h后，換成無(wú)蟲(chóng)草素的低糖培養(yǎng)基。換成無(wú)蟲(chóng)草素的低糖培養(yǎng)基后，接受5Gy照射劑量γ射線照射。于輻照后不同時(shí)間(0、1、2、4、8、12h)，加入適量蛋白裂解液裂解細(xì)胞。BCA法檢測(cè)蛋白濃度，制備蛋白膠(SDS-PAGE膠)，將變性后的蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗封閉過(guò)夜后加二抗顯影。結(jié)果顯示，使用蟲(chóng)草素預(yù)培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞，γ-H2AX蛋白明顯低于對(duì)照組(圖2b)。

實(shí)施例3

細(xì)胞活力試驗(yàn)

將人真皮成纖維細(xì)胞接種于96孔板(1×10⁴/孔)中培養(yǎng)(無(wú)蟲(chóng)草素的低糖培養(yǎng)基)過(guò)夜。然后向細(xì)胞中分別加入0、100、200、300μM濃度的蟲(chóng)草素于37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)72h。用900μM H₂O₂培養(yǎng)12小時(shí)后，采用CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)活力。結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，蟲(chóng)草素培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞能夠明顯減少H₂O₂培養(yǎng)引起的細(xì)胞活力降低(圖3)。

將人支氣管上皮樣細(xì)胞(HBE)、腫瘤A549和H460細(xì)胞接種于96孔板

(1×104/孔)中培養(yǎng)(無(wú)蟲(chóng)草素的低糖培養(yǎng)基)過(guò)夜。然后向細(xì)胞中分別加入0、50、100、200、300μM濃度的蟲(chóng)草素于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)72h。72h后，采用CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)活力。結(jié)果顯示，蟲(chóng)草素對(duì)人支氣管上皮樣細(xì)胞(HBE)活力影響小，同時(shí)能顯著降低腫瘤A549和H460細(xì)胞活力(圖8a)。

實(shí)施例4

血常規(guī)檢測(cè)

對(duì)6-8周齡C57小鼠隨機(jī)分為2組，對(duì)照組和治療組，每組10只小鼠。治療組輻照后連續(xù)7天給藥，每天給藥量為60mg/kg(腹腔給藥)。γ射線照射后(4Gy)第3、7、10、14、20天尾靜脈采血，并進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)。結(jié)果顯示，治療組與對(duì)照組于第3天白細(xì)胞數(shù)量急劇降低，但治療組降低程度無(wú)對(duì)照組明顯，同時(shí)治療組組白細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)更快，治療組到第20天白細(xì)胞水平基本恢復(fù)至正常(圖4)。

實(shí)施例5

放創(chuàng)復(fù)合傷動(dòng)物試驗(yàn)

對(duì)6-8周齡C57小鼠隨機(jī)分為3組，對(duì)照組、預(yù)防組、治療組，每組12只小鼠。預(yù)防組輻照前一周給藥，連續(xù)給藥7天，治療組輻照后連續(xù)7天給藥，每天給藥量為60mg/kg。γ射線照射后(4Gy)在大鼠背部造1cm²大小創(chuàng)面，形成照射復(fù)合傷動(dòng)物模型。觀察不同給藥組動(dòng)物創(chuàng)面愈合情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，給藥組的創(chuàng)面愈合速度(圖5a)更快，愈合后形成的瘢痕也更薄(圖5b、5c)，表明蟲(chóng)草素能提高創(chuàng)傷愈合的速度和質(zhì)量。

實(shí)施例6

局部軟組織大劑量照射動(dòng)物試驗(yàn)

對(duì)6-8周齡SD大鼠機(jī)分為2組，對(duì)照組和給藥組，給藥組于輻照前后一周連續(xù)給藥，每天給藥量為60mg/kg，。右后腿進(jìn)行局部γ射線照射(40Gy)，這種高劑量的照射會(huì)加重皮膚紅斑、脫屑和潰瘍。輻照后第15天拍照取材。結(jié)果顯示，給藥組可顯著降低放射引起的皮膚潰瘍和水腫(圖6a)，并增加真皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞再生修復(fù)(圖6b),給藥組真皮層纖維組織致密、間隙小，對(duì)照組表現(xiàn)為表現(xiàn)為纖維組織稀疏、散亂、無(wú)規(guī)則(圖6c)，對(duì)照組肌纖維密度出現(xiàn)顯著降低,表現(xiàn)為骨骼肌結(jié)構(gòu)松散,細(xì)胞間隙明顯增大(圖6d)。

實(shí)施例7

局部腹部照射動(dòng)物試驗(yàn)

對(duì)6-8周齡C57小鼠隨機(jī)分為3組，對(duì)照組、預(yù)防組、治療組，每組6只小鼠。預(yù)防組輻照前一周給藥，連續(xù)給藥7天，治療組輻照后連續(xù)3天給藥，每天給藥量為60mg/kg。小鼠進(jìn)行局部腹部γ射線照射(12Gy)輻照后第4天取材。觀察不同給藥組(治療和預(yù)防組)小腸損傷和修復(fù)情況。HE結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，給藥組的小腸損傷程度輕，小腸絨毛完整(圖7a)。同時(shí)免疫組化檢測(cè)細(xì)胞增殖指標(biāo)(Ki 67)，預(yù)防組、治療組K i67陽(yáng)性率明顯多于對(duì)照組(圖7b)。