本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是骨修復(fù)支架制備技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架材料的制備方法。

背景技術(shù)：

因細(xì)菌感染引起的慢性骨感染是骨缺損治療中的難點(diǎn)。其中骨修復(fù)材料相關(guān)的感染隨著其應(yīng)用的增多，發(fā)病率明顯增高，防治以骨修復(fù)材料相關(guān)感染是臨床面臨急需解決的問題。很多研究表明骨修復(fù)材料的植入增加了細(xì)菌入侵宿主途徑，降低機(jī)體的防御能力，減弱了阻止細(xì)菌粘附和生物膜形成的作用。生物膜一旦形成，為游離細(xì)菌提供了新的粘附位點(diǎn)，同時(shí)細(xì)菌不斷的游離或從生物膜釋放出來，成為慢性感染源。因此，研究具有抗菌性能的骨修復(fù)材料成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

目前，國外采用在骨修復(fù)材料表面涂飾抗感染劑或抗生素的方法解決骨修復(fù)材料植入時(shí)可能發(fā)生的細(xì)菌感染，起到了一定的作用。但在實(shí)際使用中發(fā)現(xiàn)通過涂飾抗感染劑或抗生素制備得到的抗菌骨修復(fù)材料有以下缺點(diǎn):(1)涂覆型涂層在體液的浸泡下，可能從骨修復(fù)材料表面脫離從而失去抗菌作用。而且脫落層可能引起局部抗菌劑或抗生素濃度過高影響人體的健康。(2)抗菌涂層有效作用期短，長(zhǎng)期使用時(shí)無法保證抗感染性。（3）抗菌劑的生物選擇性低會(huì)對(duì)人體健康造成一定的影響。（4）現(xiàn)有的涂覆型抗菌骨修復(fù)材料，因在要在支架表面涂覆一層抗菌層，所以會(huì)導(dǎo)致支架表面的活性位點(diǎn)減少，使其骨誘導(dǎo)能力大大下降，導(dǎo)致骨缺損部位重建延誤。

基于此，臨床上急需高性能的具有誘導(dǎo)修復(fù)能力的抗菌骨修復(fù)支架，用于有效修復(fù)慢性骨感染引起的骨缺損，盡可能恢復(fù)患者功能，降低手術(shù)失敗率及感染復(fù)發(fā)率，最終減輕患者痛苦及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有的骨修復(fù)支架的生物相容性低，長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性，功能單一不具備誘導(dǎo)組織再生功能等不足，提供一種具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架材料的制備方法。本發(fā)明以二氧化硅為基材制備出具有三維孔洞結(jié)構(gòu)的骨修復(fù)支架材料，再利用表面活化劑3-氨基丙基三乙氧基硅烷對(duì)二氧化硅骨修復(fù)支架進(jìn)行表面活化，然后通過多肽縮合劑將生物活性肽EAbuK固定在二氧化硅骨修復(fù)支架表面，最后通過物理吸附的方法將抗菌肽LL-37負(fù)載在骨修復(fù)支架上。該骨修復(fù)支架具有良好的力學(xué)性能和生物相容性，抗菌性能優(yōu)異長(zhǎng)時(shí)間使用后不會(huì)產(chǎn)生耐受性，且該種骨修復(fù)支架又有良好的骨誘導(dǎo)能力和骨傳導(dǎo)能力，能誘導(dǎo)骨組織缺損部位的再生。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架為三維多孔柱狀結(jié)構(gòu)，由二氧化硅、生物活性肽EAbuK和抗菌肽LL-37組成。

進(jìn)一步的，所述的具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架按重量份數(shù)計(jì)由二氧化硅20份、生物活性肽EAbuK 0.2-0.6份和抗菌肽LL-37 0.1-0.3份組成。

優(yōu)選的，所述的二氧化硅購自美國sigma公司、生物活性肽EAbuK和抗菌肽LL-37購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的另一技術(shù)方案為：一種具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架材料的制備方法，所述的制備方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：（1）二氧化硅支架的制備及表面活化處理、（2）生物活性肽EAbuK的固定、（3）抗菌肽LL-37的負(fù)載。

進(jìn)一步的，所述二氧化硅支架的制備及活化處理具體步驟為：（1）二氧化硅骨修復(fù)支架的制備：按配方比將二氧化硅加入到質(zhì)量濃度為10%的聚乙烯醇溶液中，攪拌2-3小時(shí)后得二氧化硅聚乙烯醇溶液，然后將圓柱狀的聚氨酯多孔海綿浸入到二氧化硅聚乙烯醇溶液中，反復(fù)擠壓聚氨酯多孔海綿，使二氧化硅聚乙烯醇溶液能完全進(jìn)入到聚氨酯多孔海綿的內(nèi)部，然后將浸泡過二氧化硅聚乙烯醇溶液的聚氨酯多孔海綿置于馬弗爐中1000℃煅燒，冷卻后，用去離子水沖洗，室溫下真空干燥，即得二氧化硅骨修復(fù)支架；（2）二氧化硅骨修復(fù)支架表面活化處理：將所制得的二氧化硅支架浸泡于由濃鹽酸、濃硫酸和水按體積比1:1:6混合而成的溶液中加熱至85℃反應(yīng)6-10 分鐘，然后用去離子水沖洗；然后將二氧化硅骨修復(fù)支架浸泡于由濃鹽酸和質(zhì)量濃度為30%的過氧化氫溶液按體積比1:1混合而成的溶液中室溫下反應(yīng)2小時(shí)，然后用去離子水沖洗；然后將二氧化硅骨修復(fù)支架浸泡于由3-氨基丙基三乙氧基硅烷和甲苯按體積比1:9混合而成的溶液中加熱至110℃反應(yīng)3-4小時(shí)，然后用離子水沖洗，置于真空干燥箱中100℃真空干燥6小時(shí)。

更進(jìn)一步的，所述的生物活性肽EAbuK的固定具體步驟為：（1）按配方量將生物活性肽EAbuK溶于N-甲基吡咯烷酮（NMP）中配成濃度為2.5mg/mL的EAbuK/NMP溶液，備用；將 N，N-二異丙基乙胺、1-羥基苯并三唑、O-苯并三氨唑-四甲基脲六氟磷酸酯按摩爾比1:1:1配成DIPEA/HOBT/HBTU混合溶液，備用；（2）將經(jīng)表面活化處理的二氧化硅支架浸泡于步驟（1）中所配制的生物活性肽EAbuK/NMP溶液中，然后加入DIPEA/HOBT/HBTU混合溶液中，室溫反應(yīng)12小時(shí)。（3）反應(yīng)結(jié)束后，將支架移出反應(yīng)液，用N-甲基吡咯烷酮洗滌三次、丙酮洗滌三次，最后用去離子水洗滌2~3次，置于37℃真空干燥箱中干燥24小時(shí)；

更進(jìn)一步的，所述的抗菌肽LL-37的負(fù)載具體步驟為：（1）將抗菌肽LL-37溶于磷酸鹽緩沖液中配制成質(zhì)量濃度為0.5~1.5%的溶液，備用；（2）將表面固定有生物活性肽EAbuK浸泡于抗菌肽LL-37溶液中24小時(shí)后，置于-80℃冷凍干燥機(jī)中干冷凍干燥24小時(shí)，即得具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架材料。

本發(fā)明的有益效果為：

（1）本發(fā)明所制得的具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌均有較強(qiáng)的長(zhǎng)效抑菌作用（接觸細(xì)菌24和72小時(shí)后，抑菌率均能達(dá)95%以上）。

（2）本發(fā)明所制得的具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架是以二氧化硅為基質(zhì)，通過表面活化后再將生物活性肽EAbuK固定在支架的表面，使得骨修復(fù)支架的細(xì)胞黏附能力和骨誘導(dǎo)能力提高，使所制得的骨修復(fù)支架能誘導(dǎo)骨缺損部位的骨組織的再生。

（3）本發(fā)明所制得的具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架，通過將生物活性肽EAbuK固定在其表面上，使骨修復(fù)支架的表面具有更多的活性位點(diǎn)，再將抗菌肽LL-37負(fù)載到骨修復(fù)支架上，因?yàn)楣切迯?fù)支架表面上的生物活性肽EAbuK上的末端氨基能與抗菌肽LL-37的羥基發(fā)生作用使得支架材料在使用時(shí)能緩慢釋放，并且在抗菌肽LL-37釋放后，能使活性EAbuK的抗菌性能重新激活，能與抗菌肽LL-37產(chǎn)生協(xié)同殺菌作用，使得所制得的骨修復(fù)支架的抗菌性能相比于通過涂覆或負(fù)載抗生素所制得的抗菌骨修復(fù)材料的抗菌能力要高。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1～3與對(duì)比例的抗菌性能評(píng)價(jià)結(jié)果對(duì)比圖；

圖2為實(shí)施例1～3和對(duì)比例與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)結(jié)果對(duì)比圖；

圖3為實(shí)施例1～3與對(duì)比例的堿性磷酸酶試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比圖；

圖4為實(shí)施例1～3與對(duì)比例的骨鈣蛋白酶聯(lián)吸附試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1

一種具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架為多孔柱狀結(jié)構(gòu)，按重量份數(shù)計(jì)由二氧化硅20份、生物活性肽EAbuK 0.2份和抗菌肽LL-37 0.1份組成。

實(shí)施例2

一種具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架為多孔柱狀結(jié)構(gòu)，按重量份數(shù)計(jì)由二氧化硅20份、生物活性肽EAbuK 0.4份和抗菌肽LL-37 0.2份組成。

實(shí)施例3

一種具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架為多孔柱狀結(jié)構(gòu)，按重量份數(shù)計(jì)由二氧化硅20份、生物活性肽EAbuK 0.6份和抗菌肽LL-37 0.3份組成。

實(shí)施例4

實(shí)施例1～實(shí)施例3任一例，其制備方法的具體步驟如下：

1. 二氧化硅骨修復(fù)支架的制備其表面活化處理：

（1）二氧化硅骨修復(fù)支架的制備：按配方比將二氧化硅加入到質(zhì)量濃度為10%的聚乙烯醇溶液中，攪拌2-3小時(shí)后得二氧化硅聚乙烯醇溶液，然后將圓柱狀的聚氨酯多孔海綿浸入到二氧化硅聚乙烯醇溶液中，反復(fù)擠壓聚氨酯多孔海綿，使二氧化硅聚乙烯醇溶液能完全進(jìn)入到聚氨酯多孔海綿的內(nèi)部，然后將浸泡過二氧化硅聚乙烯醇溶液的聚氨酯多孔海綿置于馬弗爐中1000℃煅燒，冷卻后，用去離子水沖洗，室溫下真空干燥，即得二氧化硅骨修復(fù)支架；

（2）二氧化硅骨修復(fù)支架表面活化處理：將所制得的二氧化硅支架浸泡于由濃鹽酸、濃硫酸和水按體積比1:1:6混合而成的溶液中加熱至85℃反應(yīng)10 分鐘，然后用去離子水沖洗；然后將二氧化硅骨修復(fù)支架浸泡于由濃鹽酸和質(zhì)量濃度為30%的過氧化氫溶液按體積比1:1混合而成的溶液中室溫下反應(yīng)2小時(shí)，然后用去離子水沖洗；然后將二氧化硅骨修復(fù)支架浸泡于由3-氨基丙基三乙氧基硅烷和甲苯按體積比1:9混合而成的溶液中加熱至110℃反應(yīng)4小時(shí)，然后用離子水沖洗，置于真空干燥箱中100℃真空干燥6小時(shí)。

2. 生物活性肽EAbuK的固定：

（1）按配方量將生物活性肽EAbuK溶于N-甲基吡咯烷酮（NMP）中配成濃度為2.5mg/mL的EAbuK/NMP溶液，備用；將 N，N-二異丙基乙胺、1-羥基苯并三唑、O-苯并三氨唑-四甲基脲六氟磷酸酯按摩爾比1:1:1配成DIPEA/HOBT/HBTU混合溶液，備用；

（2）將經(jīng)表面活化處理的二氧化硅支架浸泡于步驟（1）中所配制的生物活性肽EAbuK/NMP溶液中，然后加入DIPEA/HOBT/HBTU混合溶液中，室溫反應(yīng)12小時(shí)。

（3）反應(yīng)結(jié)束后，將支架移出反應(yīng)液，用N-甲基吡咯烷酮洗滌三次、丙酮洗滌三次，最后用去離子水洗滌3次，置于37℃真空干燥箱中干燥24小時(shí)；

3.抗菌肽LL-37的負(fù)載：

（1）將抗菌肽LL-37溶于磷酸鹽緩沖液中配制成質(zhì)量濃度為0.5~1.5%的溶液，備用；

（2）將表面固定有生物活性肽EAbuK浸泡于抗菌肽LL-37溶液中24小時(shí)后，置于-80℃冷凍干燥機(jī)中干冷凍干燥24小時(shí)。

實(shí)施例5

對(duì)比例：為市售的由羥基磷灰石制成的骨修復(fù)材料；

實(shí)驗(yàn)組1~3：為實(shí)施例1～3所得的具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架，采用實(shí)施例4的方法制備而成。

將上述實(shí)施例1～3所制備的具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架與對(duì)比例進(jìn)行抗菌能力評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，對(duì)比實(shí)施例1~3和對(duì)比例對(duì)大腸桿菌和金黃葡萄球菌接觸24和36小時(shí)后的抑菌效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1示。

從抗菌性能評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果可知實(shí)施例1~3對(duì)大腸桿菌和金黃葡萄球菌均有較強(qiáng)的殺滅作用，而且實(shí)施例1~3的抑菌能力不因接觸時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。

實(shí)施例6

對(duì)比例：為市售的由羥基磷灰石制成的骨修復(fù)材料；

實(shí)驗(yàn)組1~3：為實(shí)施例1～3所得的具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架，采用實(shí)施例4的方法制備而成。

將上述實(shí)施例1～3所制備的具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架與對(duì)比例進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)（按國標(biāo)GB/T 16886.5-2003進(jìn)行實(shí)驗(yàn)），對(duì)比實(shí)施例1~3和對(duì)比例對(duì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2示。

細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)施例1~3在與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后其對(duì)應(yīng)的細(xì)胞相對(duì)增殖率均在90%以上，細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)為0級(jí)，證明其具有良好的細(xì)胞形容性，而對(duì)比例與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后其對(duì)應(yīng)細(xì)胞相對(duì)增殖率均在80%左右，細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)為2級(jí)，具有輕微的細(xì)胞毒性。此外，共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)實(shí)施例1~3的相對(duì)相比增殖率均有明顯提高，實(shí)施例1~3在48小時(shí)后其細(xì)胞相對(duì)增殖率均較陰性組要高（均高于100%），證明采用本發(fā)明所公開的制備方法所制得的骨修復(fù)支架具有促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)，有利于骨缺損部位骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)其分泌生長(zhǎng)因子，促進(jìn)新骨組織的生長(zhǎng)。

實(shí)施例7

對(duì)比例：為市售的由羥基磷灰石制成的骨修復(fù)材料；

實(shí)驗(yàn)組1~3：實(shí)驗(yàn)組1~3：為實(shí)施例1～3所得的具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架，采用實(shí)施例4的方法制備而成。

將上述實(shí)施例1～3所制備的具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架與對(duì)比例分別與MG-63（人成骨肉瘤細(xì)胞）進(jìn)行共培養(yǎng)7天后對(duì)其堿性磷酸酶和骨鈣蛋白值進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)組和對(duì)比例的骨誘導(dǎo)能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3和4所示：

堿性磷酸酶（alkaline phosphate ALP）和骨鈣蛋白（osteocaltin OCN）均是分化成骨細(xì)胞的標(biāo)志物，能促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化。從上圖可知，與對(duì)比例相比，實(shí)施例1~3的ALP值和骨鈣蛋白含量均明顯較對(duì)比例要高。由此可見，本發(fā)所制備的具有誘導(dǎo)修復(fù)作用的抗菌骨修復(fù)支架具有較高的骨誘導(dǎo)能力，可以促進(jìn)骨組織的誘導(dǎo)再生。

顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定；對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉；凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。