本發(fā)明屬于醫(yī)學材料技術領域，具體涉及一種用于牙根再生的生物支架材料、制備方法，及其在牙根再生或骨再生方面、在藥物緩慢釋放和控制釋放方面的應用。

背景技術：

由于牙周炎、齲病、創(chuàng)傷等原因導致的牙缺失是目前口腔臨床最常見的臨床表現(xiàn)之一。牙缺失不僅嚴重破壞口腔咀嚼功能，同時還影響發(fā)音、面部形態(tài)等，進而嚴重影響患者的身心健康。如何對缺失牙進行最佳修復治療一直是口腔醫(yī)學領域所探討的重要問題。

目前口腔臨床常用的修復缺失牙的方法包括活動義齒、固定義齒和種植義齒修復。其中活動義齒常引起異物感，摘戴頻繁，易存留食物，難保持口腔清潔。固定義齒修復需要磨除基牙部分牙體組織，不僅對基牙造成永久性損傷，同時也帶來牙髓感染風險。對于牙列末端牙缺失的患者，一般不適合進行固定義齒修復。種植義齒是在牙槽骨中植入鈦金屬種植體，并以此為人工牙根進行義齒修復。這雖然是目前臨床最理想的修復方式，但種植義齒要求牙槽骨有足夠的剩余骨量，骨量不足的患者無法種植或需要植骨后再種植。更重要的是，種植體與牙槽骨間的結合方式為骨結合，缺乏天然牙的牙周膜結構。這不僅導致應力集中，同時也使種植體缺乏天然牙根所具備的分散和感知咀嚼壓力、促進牙槽骨改建等生理功能。因此，研究一種新的義齒修復方法，既能恢復牙的咀嚼功能，又能模擬天然牙根的組織結構，重建牙與牙周的關系，恢復牙的各種生理作用，進而實現(xiàn)功能性修復，是目前口腔醫(yī)學研究的熱點問題。

鑒于牙根是牙行使生理功能的關鍵部位，近年來，通過組織工程構建仿生牙根，并進一步在仿生牙根上進行缺牙修復，從而重建牙的生理功能成為缺失牙功能性修復的新策略。在組織工程構建仿生牙根過程中，支架材料的結構與性能決定了再生牙根的組織結構與生物學特性。目前，最常用的支架材料包括處理的牙本質基質(TDM)、人工合成的羥基磷灰石和磷酸三鈣復合物等。研究發(fā)現(xiàn)這些支架材料可以誘導形成牙根樣結構，并可以此牙根為基礎實現(xiàn)后期的義齒修復。然而這些支架材料仍存在不同的缺陷，如：異體來源的TDM免疫原性及是否導致疾病傳染有待驗證；TDM雖然保留了天然牙本質中部分活性蛋白成分，但這些蛋白數(shù)量少，且誘導干細胞定向分化的功能較弱；由羥基磷灰石和磷酸三鈣等無機物形成的牙根再生支架材料缺乏負載活性成分的功能，無法維持干細胞活性，且不具備促進細胞黏附和分化功能的微觀結構。這些缺陷一方面導致上述支架材料在應用于牙根再生時成功率低，另一方面，即使支架材料成活，所形成的硬組織數(shù)量也往往有限，且大部分為骨樣組織，而非真正的牙本質與牙骨質。在天然牙根中，牙本質由有序的牙本質小管和細胞外礦化間質構成，小管內容納成牙本質細胞突起。牙本質是構成牙根的主要硬組織，它決定了牙根的機械性能。因此，目前尚沒有一種理想的支架材料能夠實現(xiàn)具有仿生意義的牙根再生。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于牙根再生的生物支架材料、制備方法，及其在牙根再生或骨再生方面、在藥物緩慢釋放和控制釋放方面的應用。該支架材料源于天然牙本質，經微選擇性酸蝕和控溫煅燒處理后，去除了有機物，保留了天然牙本質中的磷灰石無機成分，并在材料表面形成了功能化的微米級管狀結構，不僅能增強細胞在材料表面粘附，同時也能促進細胞突起長入材料內部，進而在牙根再生過程中促進有序牙本質小管的形成，可負載藥物活性物質，且無免疫原性。

本發(fā)明所述的一種可用于牙根再生的生物支架材料的制備方法，其步驟如下：

(1)取供體牙，截取牙根中上部分，去除牙髓組織；

(2)將步驟(1)中得到的牙根自牙髓腔側向外磨除部分牙本質，并按照牙根外形均勻磨除部分牙根外表面組織，得到由牙本質構成的厚度為0.5～2毫米、長度為5～20毫米的支架材料；

(3)將步驟(2)得到的支架材料置于水中，超聲處理20～40分鐘，取出后干燥；

(4)將步驟(3)中得到的支架材料置于質量分數(shù)為10％～30％的甲酸水溶液中，迅速將整個體系置于5Kpa負壓下抽吸1～3分鐘；

(5)取出步驟(4)處理后的支架材料，迅速將其表面的液體吹去，室溫放置10～30分鐘；

(6)將步驟(5)得到的支架材料置于水中，超聲處理10～20分鐘，取出后干燥；

(7)重復步驟(4)～(6)0～4次；

(8)將步驟(7)得到的支架材料于600～800℃下煅燒2～4小時，然后降至室溫；

(9)將步驟(8)得到的支架材料置于水中，超聲處理3～5秒，取出后干燥，從而得到可用于牙根再生的生物支架材料。

上述方法中，步驟(1)的供體可以是人、牛、豬、猴、狗、羊。步驟(8)中煅燒時的升溫速度為3～10℃/分鐘，降溫時自然冷卻至室溫。

上述用于牙根再生的生物支架材料可直接用于牙根再生和骨再生；也可以作為載體，在牙根再生與骨再生過程中用于負載細胞和藥物，并可用于藥物緩慢釋放和控制釋放(如實施例1中附圖3、圖5所示)。支架材料負載的藥物可以是脫氧核糖核酸、核糖核酸、肽、蛋白質中的一種或一種以上。其中脫氧核糖核酸和核糖核酸可以是具有誘導組織再生作用的脫氧核糖核酸和核糖核酸片段，也可以是脫氧核糖核酸和核糖核酸與各自載體形成的復合物，如：質粒、脫氧核糖核酸脂質體復合物、核糖核酸生物材料復合物等。脫氧核糖核酸進入細胞后，在細胞內表達脫氧核糖核酸編碼的蛋白質。核糖核酸進入細胞后參與細胞增殖、凋亡、代謝和組織形成等各種調節(jié)途徑。肽可以是具有誘導組織再生作用的寡肽或多肽。蛋白質可以是具有誘導組織再生作用的簡單蛋白質或結合蛋白質，例如球蛋白、糖蛋白。藥物可以在體內環(huán)境中隨著組織液的流動和材料的降解而被緩慢釋放，從而延長藥物的作用時間。所述的藥物還可以是具有誘導組織再生作用的無機物、有機物或各自相應的鹽。無機物及其相應的鹽可以是無機化合物或絡合物，如氫氧化鈣(Ca(OH)₂)、磷酸銨((NH₄)₃PO₄)。有機物及其相應的鹽例如辛伐他汀(C₂₅H₃₈O₅)，阿倫膦酸鈉(C₄H₁₂NNaO₇P₂)。

上述藥物可以通過側鏈、吸附力、共價鍵或離子鍵結合到支架材料表面。例如，將支架材料直接浸入藥物的水溶液，通過物理吸附和電荷作用使藥物結合于支架材料表面，藥物進入材料中后借助材料內部的管狀結構實現(xiàn)緩釋效果。又例如，首先將支架材料浸入多聚乙烯亞胺溶液中，通過電荷吸附作用使帶正電的多聚乙烯亞胺連接到支架材料表面，形成側鏈后再通過電荷吸附作用在支架材料表面連接帶負電的脫氧核糖核酸、核糖核酸等藥物，從而增加支架材料的載藥量。再例如，首先將支架材料浸入聚谷氨酸溶液中，通過電荷吸附作用在支架材料表面連接帶負電的多聚谷氨酸，形成側鏈后再通過電荷吸附作用在支架材料表面連接帶正電的蛋白質等藥物活性物質。

本發(fā)明首次提出了一種用于牙根再生的天然純無機生物支架材料。這種支架材料是天然牙本質經微選擇性酸蝕和煅燒處理后，形成的功能化生物支架材料。制備支架材料所用的天然牙本質可以來自于廢棄的人、牛、豬、猴、羊、狗等哺乳動物的牙齒，具有充足的來源。與現(xiàn)有的牙根再生材料相比，該材料的特點在于：(1)具有功能化的天然微米級管狀結構。通過微選擇性酸蝕和煅燒處理，本發(fā)明所述的支架材料內牙本質小管直徑平均被擴大2～3倍，最大可達9.1微米。這種擴大的牙本質小管使支架材料表面具有功能化的圖案結構，不僅能增強細胞在材料表面粘附，同時也能促進細胞長入牙本質小管內部，形成類似于成牙本質細胞突的結構(如實施例1中附圖4所示)，進而在牙根再生過程中促進有序牙本質小管的形成。(2)具有載藥和緩釋功能。功能化擴大的牙本質小管其容積和小管內表面積明顯增加。這使牙本質小管內可吸附大量藥物，并借助其管狀結構延緩藥物釋放。(3)生物相容性良好且成分天然。本發(fā)明描述的支架材料來源于天然牙本質，經煅燒后去除了具有免疫原性的有機物，而保留的無機物則為牙本質中的磷灰石，其化學成分與晶型結構均屬天然生物來源。這使支架材料具有良好的生物相容性和生物功能。

本發(fā)明所涉及的技術具有以下特點：(1)首創(chuàng)微選擇性酸蝕技術處理牙本質支架材料。即利用負壓抽吸的方法，將酸吸入微米級牙本質小管內，然后去除牙本質表面的酸。存留在牙本質小管內的酸與牙本質小管壁充分反應，而牙本質表面所受的影響大大減小，進而實現(xiàn)了牙本質小管從微觀上被選擇性縱向擴大的目的。(2)煅燒結合超聲去除牙本質及牙本質小管內的有機物。牙本質是以膠原支架為基礎完成礦化的。礦化的牙本質中膠原蛋白和非膠原蛋白與磷灰石嵌合，因而利用酶消化或堿處理等辦法無法完全去除牙本質中的有機成分。本發(fā)明所描述的支架材料制備方法中利用煅燒結合超聲去除牙本質中的有機物，一方面煅燒能保證材料中天然磷灰石的結構與成分不變，另一方面超聲可去除煅燒后有機物產生的灰燼，進而達到完全清除有機物的目的。(3)控溫煅燒防止材料變形。本發(fā)明描述的方法中將煅燒溫度在升溫時每分鐘升高3～10℃，降溫時自然冷卻至室溫，這種控溫煅燒在防止支架材料因溫度變化過快而導致形變或表面出現(xiàn)裂紋過程中發(fā)揮了關鍵作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1構建的牛乳牙來源的牙本質支架材料圖片；顯示支架材料形狀規(guī)則，在制備過程中因酸蝕和煅燒而尺寸變小；圖A為支架材料表面，顯示材料長度為1.0cm；圖B為支架材料橫斷面，顯示材料最大外徑為4.3mm，最小外徑為3.3mm，厚度平均為0.5mm。

圖2為本發(fā)明實施例1構建的牛乳牙來源的牙本質支架材料掃描電鏡圖；如圖顯示，牙本質小管直徑被擴大，材料表面形成多孔結構，牙本質小管最大直徑達9.1微米。

圖3為本發(fā)明實施例1構建的牛乳牙來源的牙本質支架材料表面細胞生長情況；將細胞懸液滴加到材料表面并培養(yǎng)48小時后，進行掃描電鏡觀察，如圖顯示，細胞在材料表面伸展良好，形成多個細胞突起，可見突起長入材料內部。

圖4為本發(fā)明實施例1構建的牛乳牙來源牙本質支架材料的牙本質小管內細胞生長情況；將細胞懸液滴加到材料表面并培養(yǎng)48小時后，進行掃描電鏡觀察，如圖顯示，擴大的牙本質小管內形成細胞突起。

圖5為本發(fā)明實施例1構建的牛乳牙來源的牙本質支架材料對牛血清白蛋白的釋放曲線；將10μL、1mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到干燥后的牙本質支架材料上，待材料完全吸附牛血清蛋白溶液后，于37℃下進行緩釋實驗。如圖顯示，支架材料對牛血清白蛋白具有緩釋作用，6天后蛋白完全釋放。

圖6為本發(fā)明實施例2構建的豬乳牙來源的牙本質支架材料圖片；顯示支架材料形狀規(guī)則，在制備過程中因酸蝕和煅燒而尺寸變小；圖A為支架材料表面，顯示材料長度為1.1cm；圖B為支架材料橫斷面，顯示材料最大外徑為4.8mm，最小外徑為3.6mm，厚度平均為0.6mm。

圖7為本發(fā)明實施例2構建的豬乳牙來源的牙本質支架材料掃描電鏡圖；如圖顯示，牙本質小管直徑被擴大，材料表面形成多孔結構，牙本質小管最大直徑達6.9微米。

圖8為本發(fā)明實施例2構建的豬乳牙來源的牙本質支架材料表面細胞生長情況；如圖顯示，細胞黏附于多孔結構表面，伸展良好，形成多個細長突起。

圖9為本發(fā)明實施例3構建的人恒牙來源的牙本質支架材料掃描電鏡圖；如圖顯示，牙本質小管直徑被擴大，材料表面形成多孔結構，牙本質小管最大直徑達7.3微米。

圖10為本發(fā)明實施例4構建的豬牙來源的牙本質支架材料掃描電鏡圖；如圖顯示，牙本質小管直徑被擴大，材料表面形成多孔結構，牙本質小管最大直徑達6.8μm。

具體實施方式

下面結合試驗例及具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細描述。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。

實施例1：牛牙來源的牙本質支架材料的制備。

(1)取牛乳切牙，截取牙根上1/3部分，去除牙髓組織；

(2)沿牙根牙髓腔內側向外磨除牙髓和部分前期牙本質，并按照牙根外形磨除牙骨質和部分牙本質，得到由牙本質構成的厚度為1mm、長度為1.1cm的支架材料；

(3)將支架材料置于水中，在超聲振蕩器中處理30分鐘，60℃下干燥。

(4)將干燥后的支架材料置于質量分數(shù)20％的甲酸水溶液中，迅速將整個體系置于5Kpa負壓下抽吸3分鐘。

(5)取出步驟(4)處理后的支架材料，迅速將其表面的酸吹去，室溫放置10分鐘。

(6)將支架材料置于水中，于超聲振蕩器中處理20分鐘，60℃下干燥。

(7)重復步驟(4)～(6)3次。

(8)將得到的支架材料于800℃下煅燒3小時，每分鐘升溫3℃。煅燒后自然降至室溫。

(9)將煅燒后的支架材料置于水中，在超聲振蕩器中處理3秒鐘，60℃下干燥，得到用于牙根再生的牙本質支架材料。

實施例2：豬牙來源的牙本質支架材料的制備。

(1)取豬下頜側切牙，截取牙根上1/3部分，去除牙髓組織；

(2)沿牙根牙髓腔內側向外磨除牙髓和部分前期牙本質，并按照牙根外形磨除牙骨質和部分牙本質，得到由牙本質構成的厚度為1.5mm、長度為1.2cm的支架材料；

(3)將支架材料置于水中，在超聲振蕩器中處理30分鐘，80℃下干燥。

(4)將干燥后的支架材料置于質量分數(shù)20％的甲酸水溶液中，迅速將整個體系置于5Kpa負壓下抽吸1分鐘。

(5)取出步驟(4)處理后的支架材料，迅速將其表面的酸吹去，室溫放置15分鐘。

(6)將支架材料置于水中，于超聲振蕩器中處理20分鐘，80℃下干燥。

(7)重復步驟(4)～(6)3次。

(8)將得到的支架材料于800℃下煅燒3小時，每分鐘升溫10℃。煅燒后自然降至室溫。

(9)將煅燒后的支架材料置于水中，在超聲振蕩器中處理3秒鐘，80℃下干燥，得到用于牙根再生的牙本質支架材料。

實施例3：人牙來源的牙本質支架材料的制備。

(1)取人下頜第一前磨牙，截取牙根上1/2部分，去除牙髓組織；

(2)沿牙根牙髓腔內側向外磨除牙髓和部分前期牙本質，并按照牙根外形磨除牙骨質和部分牙本質，得到由牙本質構成的厚度為0.5mm、長度為5mm的支架材料；

(3)將支架材料置于水中，在超聲振蕩器中處理20分鐘，50℃下干燥。

(4)將干燥后的支架材料置于質量分數(shù)10％的甲酸水溶液中，迅速將整個體系置于5Kpa負壓下抽吸2分鐘。

(5)取出步驟(4)處理后的支架材料，迅速將其表面的酸吹去，室溫放置30分鐘。

(6)將支架材料置于水中，于超聲振蕩器中處理10分鐘，50℃下干燥。

(7)將得到的支架材料于600℃下煅燒2小時，每分鐘升溫5℃。煅燒后自然降至室溫。

(8)將煅燒后的支架材料置于水中，在超聲振蕩器中處理3秒鐘，50℃下干燥，得到用于牙根再生的牙本質支架材料。

實施例4：豬牙來源的牙本質支架材料的制備。

(1)取豬下頜側切牙，截取牙根上1/3部分，去除牙髓組織；

(2)沿牙根牙髓腔內側向外磨除牙髓和部分前期牙本質，并按照牙根外形磨除牙骨質和部分牙本質，得到由牙本質構成的厚度為2mm、長度2cm的支架材料；

(3)將支架材料置于水中，在超聲振蕩器中處理40分鐘，60℃下干燥。

(4)將干燥后的支架材料置于質量分數(shù)30％的甲酸水溶液中，迅速將整個體系置于5Kpa負壓下抽吸2分鐘。

(5)取出步驟(4)處理后的支架材料，迅速將其表面的酸吹去，室溫放置10分鐘。

(6)將支架材料置于水中，于超聲振蕩器中處理20分鐘，60℃下干燥。

(7)重復步驟(4)～(6)4次。

(8)將得到的支架材料于800℃下煅燒4小時，每分鐘升溫3℃。煅燒后自然降至室溫。

(9)將煅燒后的支架材料置于水中，在超聲振蕩器中處理5秒鐘，60℃下干燥，得到用于牙根再生的牙本質支架材料。