本發(fā)明涉及中藥有效部位提取，具體涉及一種可用于治療哮喘的款冬花提取物及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

哮喘是一種常見病、多發(fā)病是世界公認(rèn)的醫(yī)學(xué)難題，至今尚無根治方法，被世界衛(wèi)生組織列為疾病中四大頑癥之一，它是由多種細(xì)胞特別是肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥。其臨床的癥狀有咳嗽、喘息、呼吸困難、胸悶、咳痰等；典型的表現(xiàn)是發(fā)作性伴有哮鳴音的呼氣性呼吸困難；嚴(yán)重者可被迫采取坐位或呈端坐呼吸，干咳或咯大量白色泡沫痰，甚至出現(xiàn)紫紺等。目前，全球哮喘患者約3億人，中國哮喘患者約3000萬。哮喘是影響人們身心健康的重要疾病。治療不及時(shí)、不規(guī)范，哮喘可能致命。

目前治療哮喘的西藥有支氣管舒張藥和抗炎藥物，支氣管舒張藥包括β2激動(dòng)劑、茶堿類和抗膽堿藥物，常用的抗炎藥物主要是吸入性的糖皮質(zhì)激素等。這些藥物對(duì)消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等均有不可避免的副作用，不便長期使用。我國具有豐富的中草藥資源，因此研究開發(fā)一種安全有效的治療哮喘的中藥非常必要。

款冬花是菊科植物款冬(Tussilago farfara L.)的干燥花蕾。具有潤肺下氣、止咳化痰的功效。為了開發(fā)新的純天然哮喘預(yù)防和治療藥物，本發(fā)明對(duì)款冬花進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，制備得到了一種款冬花提取物對(duì)哮喘具有明顯的治療作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可用于治療哮喘的款冬花提取物及其制備方法和用途。所提取的款冬花提取物對(duì)哮喘應(yīng)具有明顯的治療作用，可用于制備預(yù)防和治療哮喘的藥物。且提取工藝簡單，成本低廉。

本發(fā)明提供的一種用于哮喘治療的款冬花提取物，通過包括如下步驟的方法制備得到：

1)提?。喝】疃ㄋ幉姆鬯?，按每千克藥材加入2-10升的低極性提取溶劑，常溫浸泡至少10min，超聲提取1-5次，每次10-100min；

2)濃縮：取上述提取液過濾，合并濾液，減壓濃縮得款冬花提取物。

其中步驟1)優(yōu)選條件：每千克款冬花藥材加入提取溶劑4升，浸泡5h，超聲提取3次，每次60min。

所述步驟1)中的低極性提取溶劑可以為石油醚或正己烷；所述的超聲可以用滲漉或浸漬替代。

經(jīng)過對(duì)款冬花提取物的化學(xué)表征和分析，其主要成分中至少含有如下四種結(jié)構(gòu)的化合物：

藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明款冬花提取物對(duì)哮喘動(dòng)物模型具有明顯的治療作用，可用于制備預(yù)防和治療哮喘的藥物。

本發(fā)明款冬花提取物是以單味干燥的款冬花為原料，用石油醚或正己烷為提取溶劑，通過浸泡、提取、濃縮等步驟制備得到。其提取工藝簡單，成本低廉。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備的款冬花提取物的¹H-NMR圖譜。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制備的款冬花提取物中所鑒定化學(xué)成分結(jié)構(gòu)式。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3制備的款冬花提取物的¹H-NMR圖譜。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3制備的款冬花提取物中所鑒定化學(xué)成分結(jié)構(gòu)式。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1制備的款冬花提取物的液相圖譜。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1制備的款冬花提取物通過液相分析所確定化合物的結(jié)構(gòu)式。

圖7為本發(fā)明款冬花提取物藥理實(shí)驗(yàn)ELISA法檢測血清中IL-17細(xì)胞因子水平(各組與模型組相比：P＜0.05*P＜0.01**)。

圖8為本發(fā)明款冬花提取物藥理實(shí)驗(yàn)ELISA法檢測血清中IFN-γ，Ig-E，IL-4，IL-17細(xì)胞因子水平(各組與模型組相比：P＜0.05*P＜0.01**)。

圖9為本發(fā)明款冬花提取物藥理實(shí)驗(yàn)BALF細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞)分類計(jì)數(shù)結(jié)果(各組與模型組相比：P＜0.05*P＜0.01**)。

圖10為本發(fā)明款冬花提取物藥理實(shí)驗(yàn)肺組織病理切片圖。

圖11為本發(fā)明款冬花提取物藥理實(shí)驗(yàn)氣管病理切片圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1款冬花提取物的制備

取干燥的款冬花蕾1kg粉碎，加4L石油醚(餾程60-90℃)常溫浸泡5h，超聲提取3次，每次60min，提取液過濾，減壓濃縮至干燥，得浸膏1.31g，即得款冬花應(yīng)用于哮喘治療的提取物。

實(shí)施例2款冬花提取物的制備

取干燥的款冬花蕾1kg粉碎，加8L石油醚(餾程60-90℃)常溫浸泡3h，超聲提取4次，每次40min，提取液過濾，減壓濃縮至干燥，得浸膏1.20g，即得款冬花應(yīng)用于哮喘治療的提取物。

實(shí)施例3款冬花提取物的制備

取干燥的款冬花蕾1kg粉碎，加5L正己烷，常溫浸泡4h，超聲提取2次，每次100min，提取液過濾，減壓濃縮至干燥，得浸膏1.26g，即得款冬花應(yīng)用于哮喘治療的提取物。

實(shí)施例4款冬花提取物的制備

取干燥的款冬花蕾1kg粉碎，加10L正己烷進(jìn)行滲漉提取，提取液過濾，減壓濃縮至干燥，得浸膏1.12g，即得款冬花應(yīng)用于哮喘治療的提取物。

實(shí)施例5款冬花提取物的制備

取干燥的款冬花蕾1kg粉碎，加10L石油醚常溫浸漬24h，取提取液過濾，減壓濃縮至干燥，得浸膏1.07g，即得款冬花應(yīng)用于哮喘治療的提取物。

實(shí)施例6款冬花提取物的核磁共振(¹H-NMR)分析

取實(shí)施例1中提取物20mg，加入氘代氯仿800μL溶解，取600μL上清液加入5mm核磁管中，進(jìn)行核磁共振¹H-NMR分析(圖1)。結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)報(bào)道和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，對(duì)提取物中含有的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)指認(rèn)，鑒定的化合物結(jié)構(gòu)如圖2所示。

實(shí)施例7款冬花提取物的核磁共振(¹H-NMR)分析

取實(shí)施例3中提取物20mg，加入氘代氯仿800μL溶解，取600μL上清液加入5mm核磁管中，進(jìn)行核磁共振¹H-NMR分析(圖3)。結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)報(bào)道和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，對(duì)提取物中含有的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)指認(rèn)，鑒定的化合物結(jié)構(gòu)如圖4所示。

實(shí)施例8款冬花提取物液相指紋圖譜研究

取實(shí)施例1中款冬花提取物25mg溶于1.5mL色譜甲醇中，微孔濾膜過濾，采用如下條件進(jìn)行高效液相檢測，結(jié)果如圖5所示。

色譜條件：Agilent 1260高效液相色譜檢測儀；艾杰爾VenusiIMP C₁₈(5μm,4.6×250mm)色譜柱。流動(dòng)相A乙腈，流動(dòng)相B 0.03％甲酸水；檢測波長：220nm；流速1ml/min；柱溫25℃，進(jìn)樣量10微升。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，該提取物中含有化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)式如圖6所示。

表1洗脫梯度表

實(shí)施例9款冬花提取物噴霧劑的制備

準(zhǔn)確稱量款冬花提取物1.00g加入研缽中，加入2％的吐溫-80置于上述研缽中，研磨混合均勻，之后邊加入0.9％生理鹽水邊研磨至混合均勻制成5mg/mL初乳，將上述初乳轉(zhuǎn)移至高速組織搗碎勻漿機(jī)中；準(zhǔn)確稱取維生素C 0.1g(抗氧化劑)加入到高速組織搗碎勻漿機(jī)中；18000rpm/min攪拌速度下乳化3分鐘后將其轉(zhuǎn)移至高壓均質(zhì)機(jī)中，于150MPa壓力下循環(huán)均化3次，得白色均一乳狀液；將制備的乳劑封裝于噴霧器中，每瓶100mL，含款冬花提取物500mg，置于涼暗處儲(chǔ)存。

實(shí)施例10款冬花提取物對(duì)小鼠哮喘模型的影響

1動(dòng)物

品系：BALB/c小鼠；性別：雄性；體重：18-22g；來源：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0008，飼養(yǎng)：SPF級(jí)動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)。

2受試藥物

地塞米松磷酸鈉注射液，天津金耀藥業(yè)有限公司(購于太原市長城藥店)，溶于0.9％生理鹽水，配置成0.5mg/mL溶液。取款冬花提取物加2％吐溫80(w/v)溶于0.9％生理鹽水，配置成5mg/mL乳劑。

3試驗(yàn)方法

3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立和給藥方法

取小鼠56只，隨機(jī)分為7組，每組8只小鼠，分別為空白組、模型組、陽性藥組、A組、B組、C組、D組。模型組每只小鼠于第0、7d分別腹腔注射10％OVA(100mg OVA和100mg A1(OH)₃)的乳化混懸液1mL致敏，第15d開始激發(fā)：將小鼠置于自制密閉玻璃盒中，給予1％OVA(200mg OVA溶解于20mL生理鹽水中)20mL超聲霧化吸人，每天1次，每次30min，連續(xù)14d。A組、B組、C組、D組同模型組處理，只在每次OVA激發(fā)前30min內(nèi)分別超聲波霧化噴霧給予款冬花提取物0.2g/Kg，0.4g/Kg，0.6g/Kg，0.8g/Kg，連續(xù)14d。陽性藥組同模型組處理，只在每次OVA激發(fā)前30min內(nèi)分別噴霧給予地塞米松藥物0.5mg/Kg，連續(xù)14d?？瞻捉M每只小鼠第0、7d皮下注射1mL生理鹽水，第15d在同樣條件下用20mL生理鹽水霧化，每天1次，每次30min，連續(xù)14d。

3.2血清中IL-17細(xì)胞因子水平

對(duì)小鼠連續(xù)給藥14天，于末次給藥1h后，進(jìn)行摘眼球取血，每只取血量為0.8-1mL，3 000r/min、10min離心，上清保存?zhèn)溆?，?0μL按ELISA試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)操作說明測試IL-17細(xì)胞因子水平。

4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

IL-17是一種很強(qiáng)的前炎癥細(xì)胞因子，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子從而抑制中性粒細(xì)胞(Neutrophil)凋亡，在氣道、氣道高反應(yīng)性中發(fā)揮了重要作用。與模型組比較，4個(gè)劑量的款冬花提取物均能夠降低IL-17細(xì)胞因子水平(P<0.05)，其中A組(0.2g/Kg)作用最明顯(圖7)。

實(shí)施例11款冬花提取物對(duì)大鼠哮喘模型的影響

1動(dòng)物

品系：SD大鼠；性別：雄性；體重：200-220g；來源：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2012-001，飼養(yǎng)：SPF級(jí)動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)。

2受試藥物

地塞米松磷酸鈉注射液，天津金耀藥業(yè)有限公司(購于太原市長城藥店)，溶于0.9％生理鹽水，配置成0.5mg/mL溶液。取款冬花提取物加2％吐溫80(w/v)溶于0.9％生理鹽水，分別配置成5mg/mL乳劑。

3試驗(yàn)方法

3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立和給藥方法

取大鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只大鼠，分別為空白組、模型組、陽性藥組、A組、B組、C組。模型組每只大鼠于第0、7d分別腹腔注射10％OVA(100mg OVA和100mg A1(OH)₃)的乳化混懸液1mL致敏，第15d開始激發(fā)：將大鼠置于自制密閉玻璃盒中，給予1％OVA(200mg OVA溶解于20mL生理鹽水中)20mL超聲霧化吸人，每天1次，每次30min，連續(xù)14d。A組、B組、C組及陽性藥組同模型組處理，只在每次OVA激發(fā)前30min內(nèi)分別超聲波噴霧給予款冬花提取物0.1g/Kg，0.2g/Kg，0.4g/Kg，及地塞米松0.5mg/Kg，連續(xù)給藥14天?？瞻捉M每只大鼠第0、7d皮下注射1mL生理鹽水，第15d在同樣條件下用20mL生理鹽水霧化，每天1次，每次30min，連續(xù)14d。

3.2血清中IFN-γ，Ig-E，IL-4，IL-17細(xì)胞因子水平

對(duì)大鼠連續(xù)給藥14天，于末次給藥1h后，進(jìn)行股動(dòng)脈取血，每只取血量為9-10mL，3 000r/min、10min離心，上清保存?zhèn)溆?，分別取50μL按ELISA試劑盒(上海生工)操作說明測試IFN-γ，Ig-E，IL-4，IL-17細(xì)胞因子水平。

3.3支氣管灌洗液(BLAF)細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

大鼠取血后，打開胸腔，暴露肺組織，氣管切開插管，結(jié)扎右主支氣管，取PBS緩沖液(pH為7.2-7.4)于氣管插管處注入，緩慢灌洗左肺3次，每次1mL并回收支氣管肺泡灌洗液(BALF)，1 800r/min離心15min，取上清分裝于EP管，-80℃保存用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)噬酸性粒細(xì)胞(Eosinophils，EOS),中性粒細(xì)胞(Neutrophil，NEU)，淋巴細(xì)胞(Lymphocytes，LYM)，單核細(xì)胞(Monocyte，MON)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

3.4肺組織及氣管病理學(xué)觀察

剪取大鼠左上肺組織，置于10％多聚甲醛溶液固定，石蠟切片后進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察肺組織和氣管中嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤情況。

4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1與模型組比較，3個(gè)劑量的款冬花提取物均能夠降低Ig-E、IL-4及IL-17，升高IFN-γ因子水平，且具有顯著性差異(P＜0.05)。Thl細(xì)胞主要分泌IFN-γ介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)哮喘起保護(hù)作用。而Th2細(xì)胞分泌的IL-4同時(shí)促進(jìn)B細(xì)胞的增殖，介導(dǎo)免疫球蛋白亞型的轉(zhuǎn)變，促進(jìn)IgE的生成，從而介導(dǎo)超敏。IL-17則是一種強(qiáng)大的前炎癥細(xì)胞因子，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子從而抑制中性粒細(xì)胞(Neutrophil)凋亡，在氣道、氣道高反應(yīng)性中發(fā)揮了重要作用(圖8)。

4.2與模型組比較款冬花提取物能夠降低BALF中EOS、NEU及MON，升高LYM的含量，且存在顯著性差異(P＜0.05)。氣道EOS炎癥是哮喘的重要發(fā)病機(jī)制；NEU炎癥反應(yīng)在重型哮喘、激素抵型哮喘的發(fā)病機(jī)制中起重要作用；LYM在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用(圖9)。

4.3肺部及氣管病理切片如圖10、11所示：正常對(duì)照組大鼠肺組織無實(shí)質(zhì)性異常炎癥改變，氣道黏膜上皮及肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔窄，氣道平滑肌薄，未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠氣道和支氣管壁周圍有大量的炎性細(xì)胞浸潤，支氣管平滑肌層肥大、增生，黏膜充血、水腫，氣道腔內(nèi)上皮脫落、受損，管腔內(nèi)充滿大量的黏性分泌物，肺泡結(jié)構(gòu)亦出現(xiàn)紊亂、融合現(xiàn)象，表明哮喘模型復(fù)制成功。陽性藥組和款冬花提取物給藥組A組，B組，C組的炎性細(xì)胞浸潤情況均有不同程度減輕，氣道粘膜上皮及肺泡結(jié)構(gòu)均有不同程度恢復(fù)，氣道官腔內(nèi)上皮均有不同程度愈合，其中C組效果最好。