本發(fā)明涉及藥物制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為一種預防或治療老年癡呆的中藥組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：老年癡呆是一種慢性疾病，常見的有阿爾茨海默病和血管性癡呆，病程往往持續(xù)多年，患者生活多不能自理，給家庭和社會造成巨大負擔。目前，我國有1.3億老年人，其中大約500萬-600萬的65歲以上的老年人患有癡呆癥，到21世紀中葉，我國的老年人大約要增長到4億，到那時老年癡呆癥患者大約就會有1600萬-2000萬。老年癡呆問題也是隨著人口老年化發(fā)展的一個必然趨勢?，F(xiàn)有西藥對老年癡呆癥的治療主要是從預防卒中、改善認知功能及控制行為和精神癥狀下手。臨床多用膽堿酯酶抑制劑、腦循環(huán)改善劑、多肽類促智藥、自由基清除劑和抗氧化劑等等，其效果仍需進一步研究。中醫(yī)認為該病病因主要以內(nèi)因為主，多由年邁體虛、七情內(nèi)傷、久病耗損等原因?qū)е職庋蛔恪⒛I精虧損、腦髓失養(yǎng)，或氣滯痰阻、血淤于腦而成。癡呆的病位主要在腦，與心肝脾腎功能失調(diào)關(guān)系密切。治療上要活氣補血、益氣養(yǎng)血，佐以醒腦開竅，該病即可逐漸好轉(zhuǎn)。因此有必要發(fā)明一種療效確切、安全方便、副作用低下、價格低廉的中藥組合物來治療老年性癡呆。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明正是針對以上技術(shù)問題，提供一種療效確切、安全方便、價格低廉的純中藥治療氣虛血弱，痰阻清竅，淤血阻絡(luò)而致的記憶力嚴重減退，行動不便，步履不穩(wěn)，情感淡漠，精神萎靡或易怒，甚至不識家人，不知回家道路等癥狀的藥物組合物及其制備方法。該中藥組合物治療老年癡呆具有良好的效果，可顯著改善學習、記憶、認知等能力。本發(fā)明的另外一個目的是為以上所述預防或治療老年癡呆的中藥組合物提供一種工藝先進、操作簡便、有效成分含量高的制備方法。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：一種預防或治療老年癡呆的中藥組合物，其包括如下重量份的原料藥：人參2-30份、川芎2-30份、三七1-15份、水蛭1-15份、冰片0.1-1份、麝香0.01-0.03份。作為優(yōu)選，該治療老年癡呆的中藥組合物包括以下重量份的原料藥：人參5-25份、川芎5-25份、三七2.5-12.5份、水蛭2.5-12.5份、冰片0.25-2.5份、麝香0.025-0.075份。更進一步優(yōu)選，該治療老年癡呆的中藥組合物包括以下重量份的原料藥：人參20份、川芎20份、三七10份、水蛭10份、冰片0.5份、麝香0.02份。該治療老年癡呆的中藥組合物可由原料藥的藥粉、或原料藥的水或乙醇提取物為活性成分，加上藥學上常用的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。以上所述預防或治療老年癡呆的中藥組合物制劑的制備方法為：1)按比例稱取以上六味藥；2)將水蛭粉碎成粗粉，加8-12倍量水煎煮，煎煮1-3次，每次0.5-1.5小時，合并水煎液，濾過，濃縮至相對密度為1.0-1.3，加乙醇至質(zhì)量濃度為50％-80％，靜置24-48小時，濾過，取藥渣備用；3)將人參、川芎、三七三味藥加6-10倍量50wt％-80wt％乙醇回流提取1-3次，每次0.5-1.5小時，合并提取液，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度為1.0-1.3，將上述藥渣與濃縮液混溶，噴霧干燥(噴霧干燥時，進口溫度180℃，出口溫度80℃)，制成干膏粉；4)將冰片和人工麝香共研(麝香與冰片采用加液研磨法粉碎，研磨時，輕研冰片，重研麝香)，加入干膏粉和適量輔料，混勻，按照常規(guī)工藝，制成臨床或藥學上可接受的劑型，包括不限于片劑、散劑、丸劑、顆粒劑、緩釋制劑、速釋制劑、控釋制劑或口服液體制劑。所述制劑中，原料藥的藥粉、或原料藥的水或乙醇提取物與輔料的重量之比為1：0.1-0.5。作為優(yōu)選，以上所述預防或治療老年癡呆的中藥組合物制劑的制備方法為：1)按比例稱取各原料藥；2)將稱取的水蛭粉碎成粗粉，加10倍量水煎煮，煎煮2次，每次1小時，合并水煎液，濾過，濃縮至相對密度為1.10～1.15(60℃)，加乙醇至質(zhì)量濃度為60％，10℃以下靜置36小時，濾過，取沉淀備用；3)將人參、川芎、三七三味藥加6倍量60％乙醇回流提取3次，每次1.5小時，合并提取液，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度為1.20～1.25(60℃)，將上述藥渣與濃縮液混溶，噴霧干燥，制成干膏粉；4)將冰片和人工麝香共研，加入干膏粉和適量輔料，混勻，按照常規(guī)工藝，制成臨床或藥學上可接受的劑型，包括不限于片劑、散劑、丸劑、顆粒劑、緩釋制劑、速釋制劑、控釋制劑或口服液體制劑?！吨袊幍洹分赋觯捍址壑改苋客ㄟ^二號篩，但混有能通過四號篩不超過40％的粉末。本發(fā)明的積極效果體現(xiàn)在：(一)、本發(fā)明中藥組合物具有很好的活氣行血、醒腦開竅的作用，本發(fā)明組合物制劑治療老年癡呆具有良好的效果，臨床表現(xiàn)顯著的改善患者學習、記憶、認知等能力。(二)、本發(fā)明對影響該中藥組合物中人參、川芎、三七提取效果的乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數(shù)進行了考察，并結(jié)合工業(yè)化大生產(chǎn)需求，優(yōu)選了人參、川芎、三七的最佳提取工藝，該工藝合理、穩(wěn)定、可行、有效成分轉(zhuǎn)移率高。(三)、本發(fā)明以抗凝血酶活性和水蛭干膏收率的綜合評分作為評價該中藥組合物中水蛭提取工藝的指標，優(yōu)選了水蛭提取工藝的最佳條件，該提取工藝確保水蛭有效組分提取完全，具有效率高、時間短、能耗低等優(yōu)點。(四)、本發(fā)明提供該中藥組合物制備方法，該制備方法操作簡單，穩(wěn)定性好，微生物容易控制，服用、貯藏方便，運輸成本低，制劑工藝能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)和機械包裝，可利用先進設(shè)備和技術(shù)，產(chǎn)品質(zhì)量高。附圖說明：圖1為實施例1中所述阿魏酸標準曲線圖圖2為實施例1中所述人參皂苷Rg1的標準曲線圖圖3為實施例1中所述人參皂苷Rb1的標準曲線圖圖4為實施例1中所述人參皂苷Re的標準曲線圖圖5為實施例1中所述三七皂苷R1的標準曲線圖圖6為實施例5中各實驗組大鼠在定向航行試驗中第5天典型的原始游泳軌跡表示圖，注：圖中小圓代表大鼠游泳的起點位置，大圓代表逃逸平臺的位置。具體實施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細描述，但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實施例。實施例1：一、本發(fā)明組合物中人參、三七、川芎提取工藝的優(yōu)選1、實驗材料人參藥材、三七藥材、川芎藥材，阿魏酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號：110773-201313)，人參皂苷Rg1(中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號：110703-201529)、人參皂苷Re(中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號：110754-201525)、人參皂苷Rb1(中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號：110704-201424)、三七皂苷R1(中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號：110745-201318)；高效液相色譜儀(Aglient1200)HPLC色譜柱(GlobalChromatographySP-120-5-C18-BI0(4.6×250mm))，水為重蒸水，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。2、實驗方法正交試驗設(shè)計優(yōu)選提取工藝本發(fā)明組合物中人參、川芎、三七的主要有效成分均為脂溶性成分，通過預試驗考察及文獻查閱，確定本發(fā)明中藥組合物中人參、三七、川芎三味藥材采用乙醇回流提取。影響乙醇回流提取的因素主要有乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數(shù)。針對以上四個因素，每個因素各取三個水平，以L9(34)表進行正交試驗，正交試驗因素水平表見表1。按本發(fā)明中藥組合物中人參、三七、川芎的重量比，精密稱取各藥材，按正交試驗因素水平表進行試驗，以總皂苷含量、阿魏酸含量和干膏收率作為評價指標。優(yōu)選本發(fā)明組合物中人參、三七、川芎乙醇回流的提取工藝條件。表1正交試驗因素水平表阿魏酸含量測定方法2.2.1色譜條件色譜柱：GlobalChromatographySP-120-5-C18-BI0(4.6×250mm)，5μm；流動相：乙腈-1％醋酸溶液(30﹕70)；流速：1ml/min；進樣量：10ul；柱溫：30℃；檢測波長：321nm；理論塔板數(shù)按阿魏酸峰計算應不低于4000。2.2.2對照品溶液的制備取阿魏酸對照品(批號：110773-201313)適量，精密稱定，置10ml量瓶中，加70％甲醇制成每1ml含33.4ug的溶液，即得。2.2.3供試品溶液的制備精密量取正交試驗9份樣品液10ml，置于坩堝中水浴揮干，殘渣加70％甲醇適量溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，用70％甲醇稀釋至刻度，微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。2.2.4陰性溶液的制備按本發(fā)明組合物各藥材重量比稱取人參和三七藥材飲片適量，加8倍量的70％乙醇，提取1次，每次1小時，照供試品溶液制備方法制備，即得。2.2.5標準曲線的制備精密稱定阿魏酸對照品2.51mg，置10ml量瓶中，加70％甲醇稀釋至刻度，備用；分別吸取0.1、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8ml的對照品溶液(濃度為0.251mg/ml)，置10ml量瓶中，加70％甲醇稀釋至刻度得2.51、7.53、15.06、30.12、60.24、120.48ug/ml的對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定峰面積，以進樣量(ug)為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝52.383X-10.201，r＝0.9999(n＝6)。結(jié)果表明，阿魏酸進樣量在0.0251～1.2048μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好線性關(guān)系。標準曲線見圖1。2.2.6阿魏酸專屬性的考察精密吸取對照品溶液和陰性溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，由結(jié)果分析，陰性溶液無干擾。2.2.6樣品的測定精密吸取對照品溶液10μl，供試品溶液5μl，分別注入高效液相色譜儀，測定，記錄峰面積。2.3總皂苷含量的測定2.3.1色譜條件色譜柱：GlobalChromatographySP-120-5-C18-BI0(4.6×250mm)，5μm；流動相：以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按下表的規(guī)定進行梯度洗脫；流速：1ml/min；柱溫：25℃；檢測波長：203nm；理論塔板數(shù)按三七皂苷R1峰計算應不低于4000。表2流動相洗脫條件2.3.2對照品溶液的制備取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Re及三七皂苷R1對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含人參皂苷Rg10.9359mg、人參皂苷Rb10.4277mg、人參皂苷Re0.1386mg、三七皂苷R1的0.1285mg混合溶液，即得。2.3.3供試品溶液的制備精密量取正交試驗9份樣品液10ml，置于坩堝中水浴揮干，殘渣加甲醇適量溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。2.3.4陰性溶液的制備按處方量比例稱取川芎藥材飲片(10g)，加8倍量的70％乙醇，提取1次，每次1小時，照供試品溶液制備方法制備，即得。2.3.5標準曲線的制備分別取人參皂苷Rg1對照品25.09mg、人參皂苷Rb1對照品20.02mg、人參皂苷Re對照品10.20mg、三七皂苷R1對照品10.41mg，精密稱定，置5ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，備用；分別精密吸取三七皂苷R1對照品溶液和人參皂苷Re對照品溶液各0.05、0.15、0.25、0.5、1ml，人參皂苷Rg1對照品溶液0.1、0.4、0.8、1.2、1.6ml，人參皂苷Rb1對照品溶液0.1、0.25、0.5、0.75、1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制備成不同濃度下的混合對照品溶液。分別精密吸取上述不同濃度的混合對照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定峰面積，以進樣量(ug)為橫坐標峰，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程。人參皂苷Rg1：Y＝254.6797X+16.6542，r＝0.9996(n＝5)；人參皂苷Rb1：：Y＝223.9737X+3.7854，r＝0.9996(n＝5)；人參皂苷Re：Y＝162.9548X-4.9477，r＝0.9997(n＝5)；三七皂苷R1：Y＝186.0201X-56.4761，r＝0.9991(n＝5)。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、三七皂苷R1的進樣量分別在0.9374～14.9978、0.7680～7.6796、0.1891～3.7822、0.1957～3.9142μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好線性關(guān)系。標準曲線分別見圖2、3、4、5。2.3.6總皂苷專屬性的考察精密吸取混合對照品溶液和陰性溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，由結(jié)果分析，陰性溶液無干擾。2.3.7樣品的測定精密吸取混合對照品溶液10μl，供試品溶液10μl，分別注入高效液相色譜儀，測定，記錄峰面積。2.4浸膏收率的測定方法：精密量取定容后供試品提取液各25ml，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿，低溫蒸干，于105℃干燥3小時，取出，迅速移入干燥器內(nèi)冷卻0.5小時，取出并迅速精密稱重，計算浸膏收率。3結(jié)果與分析以總皂苷含量為0.4、阿魏酸含量為0.4和浸膏收率為0.2的權(quán)重系數(shù)進行加權(quán)評分，試驗結(jié)果、試驗方差分析見表3、4。表3L9(34)醇提工藝正交試驗結(jié)果表注：總皂苷含量評分＝總皂苷含量/最大總皂苷含量×100×0.4；阿魏酸含量評分＝阿魏酸含量/最大阿魏酸含量×100×0.4；干膏收率評分＝干膏收率/最大干膏收率×100×0.2；綜合評分＝綠原酸含量評分+干膏收率評分。表4方差分析表方差來源離差平方和自由度方差F值顯著性A4067.2322033.6284.25*B1168.752584.37524.21*C48.28224.141D2211.6121405.8145.81*注：F0.05(2,2)＝19.0，F(xiàn)0.01(2,2)＝99.0，*表明有顯著性影響。結(jié)果表明：根據(jù)綜合評分結(jié)果，由直觀分析可得影響提取效果的因素大小為：提取次數(shù)(A)＞提取時間(D)＞乙醇濃度(B)＞乙醇用量(C)；對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析結(jié)果表明，提取次數(shù)、提取時間、乙醇濃度對總皂苷含量、阿魏酸含量及浸膏收率有顯著性影響，乙醇用量對總皂苷含量、阿魏酸含量及浸膏收率無顯著性影響。綜合直觀分析和方差分析結(jié)果，結(jié)合工業(yè)化大生產(chǎn)節(jié)約能效，降低生產(chǎn)成本考慮，確定最佳提取工藝為A3B1C1D3，即加6倍量60％乙醇，提取3次，每次1.5小時。4驗證試驗按本發(fā)明組合物重量比稱取人參、三七、川芎藥材，共25g，照優(yōu)選的醇提工藝進行驗證，結(jié)果見表5。表5醇提工藝驗證結(jié)果表編號總皂苷含量(mg)阿魏酸含量(mg)浸膏收率(％)1856.1220.48125.582852.3320.07025.363871.7519.80925.81平均值860.0720.12025.59從上述驗證試驗可見，所篩選的工藝，穩(wěn)定可行。二、本發(fā)明組合物中水蛭提取工藝的優(yōu)選1、實驗材料水蛭藥材、凝血酶對照品(天津生物化學制品廠，批號：140625-201310，510單位/瓶)、纖維蛋白原(衛(wèi)生部上海生物制品研究所出品)，其余試劑均為分析純。2、實驗方法2.1正交試驗設(shè)計優(yōu)選提取工藝水蛭為本發(fā)明組合物中的動物藥，具有破血痛經(jīng)，逐淤消癥的功效，水蛭主要的藥效成分為水蛭素、吻蛭素、肝素和組織胺等多種水溶性成分，不易溶于極性小的溶劑。本試驗結(jié)合預試驗和文獻查閱。試驗采用水煎煮提取法，以抗凝血酶活性和干膏收率的綜合評分作為評價指標，通過L9(34)正交實驗設(shè)計，考察水提取工藝的煎煮次數(shù)，加水量、煎煮時間及浸泡時間，正交試驗因素水平表見表5，優(yōu)選水蛭水提工藝條件。表5水蛭水提工藝正交試驗因素水平表2.2抗凝活性效價的測定2.2.1測定方法取水蛭提取液適量，離心，精密量取上清液100μl置玻璃試管中，加入含0.5％牛纖維蛋白原(以凝固物記)的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(臨用配制)200μl，攪勻，置水浴中(37℃+0.5℃)溫浸5分鐘，滴加入每1ml中含10單位的凝血酶溶液(臨用配置，每分鐘5μl，輕輕攪勻)，直至針尖可以挑出絮狀凝固物，記錄消耗凝血酶溶液的體積，按下式計算：U＝C1V1/C2V2式中U—每1g含凝血酶活性單位，U/g；C1—凝血酶溶液的濃度，U/ml；C2—供試品溶液的濃度，g/ml；V1—消耗凝血酶溶液的體積，μl；V2—供試品溶液的加入量，μl；中和一個單位的凝血酶的量，為一個抗凝血酶活性單位。2.2.2凝血酶溶液配制取凝血酶對照品(批號：140625-201310，510單位/瓶)適量，加生理鹽水制成每1ml含10.2單位的溶液，即得。2.2.3(牛)纖維蛋白原的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液配制取0.2mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液25ml與0.1mol/L鹽酸溶液40ml，加水至100ml，調(diào)節(jié)pH值至7.4；取(牛)纖維蛋白原對照品(批號：)適量，精密稱定，加已配制好的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液制成0.5％(牛)纖維蛋白原(以凝固物計)的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液。2.3浸膏收率的測定精密量取正交試驗中供試品提取液各25ml，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿，低溫蒸干，于105℃干燥3小時，取出，迅速移入干燥器內(nèi)冷卻0.5小時，取出并迅速精密稱重，計算浸膏收率。2.3.1供試品溶液的制備稱取水蛭藥材粗粉5g，平行9份，在80℃條件下，按正交試驗因素水平表進行提取，濾過，定容至200ml，即得。2.3.2樣品的測定取各份煎煮液，取上清液作為供試品溶液。照“2.2”項下方法測定其抗凝活性U。3試驗結(jié)果與分析以抗凝活性為80，干膏收率為20的權(quán)重系數(shù)進行加權(quán)評分，試驗結(jié)果、方差分析見表6、7。表6水蛭水提工藝正交試驗結(jié)果表注：抗凝活性評分＝抗凝活性/最大最大抗凝活性×80；浸膏收率評分＝浸膏收率/最大浸膏收率×20；綜合評分＝抗凝活性評分+浸膏收率評分表7水蛭水提工藝正交試驗方差分析表方差來離差平方和自由度方差F值顯著性A6912.6923456.3419.84<0.05B715.732357.862.05C1751.652875.825.03D348.402174.201注：臨界值F0.05(2,2)＝19結(jié)果表明：影響提取效果的因素大小為：A＞C＞B，A因素有顯著性差異，B和C因素沒有顯著性差異，綜合直觀分析和方差分析結(jié)果，結(jié)合工業(yè)化大生產(chǎn)節(jié)約能效，降低生產(chǎn)成本考慮，確定最佳提取工藝為A2B2C2，即加10倍量水煎煮2次，每次1小時。4驗證試驗稱取水蛭藥材5g，平行3份，按篩選的水提工藝條件提取，進行工藝驗證，結(jié)果見表8。表8水提工藝正交試驗驗證結(jié)果表編號抗凝活性U(U/g)干膏收率(％)1130.5623.452122.4023.893130.5623.28平均值127.8423.54結(jié)論：由表4可知，平均抗凝活性為127.84，水浸出物收率為23.54％。說明該工藝條件穩(wěn)定可行。實驗例2：本發(fā)明組合物片劑的制備人參2-30份、川芎2-30份、三七1-15份、水蛭1-15份、冰片0.1-1份、麝香0.01-0.03份按比例稱取以上六味藥，然后將水蛭粉碎成粗粉，加8-12倍質(zhì)量水煎煮，煎煮1-3次，每次0.5-1.5小時，合并水煎液，濾過，濃縮至相對密度為1.0-1.3，加乙醇至濃度為50-80％，靜置24-48小時，濾過，取藥渣備用；人參、川芎、三七三味加6-10倍量50％-80％乙醇回流提取1-3次，每次0.5-1.5小時，合并提取液，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度為1.0-1.3適量，將上述藥渣與濃縮液混溶，噴霧干燥，制成干膏粉；冰片和人工麝香共研，加入干膏粉和適量輔料，混勻，制成顆粒，壓制1000片，包薄膜衣，即得。實驗例3：本發(fā)明組合物顆粒劑的制備人參2-30份、川芎2-30份、三七1-15份、水蛭1-15份、冰片0.1-1份、麝香0.01-0.03份按比例稱取以上六味藥，然后將水蛭粉碎成粗粉，加8-12倍質(zhì)量水煎煮，煎煮1-3次，每次0.5-1.5小時，合并水煎液，濾過，濃縮至相對密度為1.0-1.3，加乙醇至濃度為50-80％，靜置24-48小時，濾過，取藥渣備用；人參、川芎、三七三味加6-10倍量50％-80％乙醇回流提取1-3次，每次0.5-1.5小時，合并提取液，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度為1.0-1.3適量，將上述藥渣與濃縮液混溶，噴霧干燥，制成干膏粉；冰片和人工麝香共研，加入干膏粉和適量輔料，混勻，制成顆粒，干燥，即得。實驗例4：本發(fā)明組合物滴丸劑的制備人參2-30份、川芎2-30份、三七1-15份、水蛭1-15份、冰片0.1-1份、麝香0.01-0.03份按比例稱取以上六味藥，然后將水蛭粉碎成粗粉，加8-12倍質(zhì)量水煎煮，煎煮1-3次，每次0.5-1.5小時，合并水煎液，濾過，濃縮至相對密度為1.0-1.3，加乙醇至濃度為50-80％，靜置24-48小時，濾過，取藥渣備用；人參、川芎、三七三味加6-10倍量50％-80％乙醇回流提取1-3次，每次0.5-1.5小時，合并提取液，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度為1.0-1.3適量，將上述藥渣與濃縮液混溶，噴霧干燥，制成干膏粉；冰片和人工麝香共研，加入干膏粉和適量輔料，混勻，滴制成滴丸，包薄膜衣，即得。實驗例5：Morris水迷宮行為學測試本發(fā)明組合物制劑對老年癡呆模型大鼠學習記憶能力的影響1、實驗材料1.1實驗儀器BN-Morris水迷宮(徐州博納信息技術(shù)有限公司)，動物行為學視頻分析系統(tǒng)(V2.0)，CHA-S恒溫振蕩器(國華企業(yè))；1810A摩爾原子型超純水器(上海摩勒科學儀器有限公司)，ME204E型電子天平(德國MettlerToledo)1.2實驗動物SPF級SD大鼠，雌雄各半，體重200～220g，由成都達碩生物科技有限公司提供，動物合格證號SCXK(川)2013-24；實驗場地為成都中醫(yī)藥大學藥理實驗室(國家中醫(yī)藥管理局三級實驗室，編號TCM2032043)。1.3藥物與試劑本發(fā)明組合物制劑(按實施例4方法制備)；缺失人參的中藥組合物制劑(按實施例4方法制備不含人參的中藥組合物制劑)；缺失川芎的中藥組合物制劑(按實施例4方法制備不含川芎的中藥組合物制劑)；安理申(衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司，批號1501019)；Aβ25－35(美國sigma公司，批號A4559)2、實驗方法2.1Aβ老化將Aβ25－35溶于生理鹽水中(濃度為2μg/μL)，于37℃恒溫箱孵育72h老化備用。2.2老年癡呆大鼠模型制備將SD大鼠用10％水合氯醛麻醉(3mL/kg,ip)后，固定在腦立體定位儀上，用碘伏和酒精常規(guī)消毒頭皮后，用無菌手術(shù)刀在大鼠頭皮正中線處切開長約1.5cm縱行切口,暴露前囟,鈍性分離皮下組織及骨膜，然后根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，先在大鼠前囟后3mm，右側(cè)2mm處用無菌牙科鉆鉆開顱骨，用5μL微量進樣器自顱骨開孔處進入大鼠右側(cè)海馬背部，進針深度3.4mm，緩慢勻速注射5μL凝聚態(tài)Aβ25－35，注射速度為1μL/min，注射完畢，留針2min，緩慢撤針；同法在左側(cè)海馬背部注射5μL凝聚態(tài)Aβ25－35，造成癡呆大鼠模型。另取同批次SD大鼠，同法操作，兩側(cè)海馬背部各注射5μL生理鹽水作為假手術(shù)組，術(shù)后飼養(yǎng)一周。2.3分組及給藥將存活的70只模型動物按體重隨機均分為模型對照組、陽性對照組和本發(fā)明組合物低、中、高劑量組及缺失人參組、缺失川芎組，每組10只；另取同批次10只假手術(shù)大鼠作為空白對照組。造模后，縫合創(chuàng)口，消毒，造模一周后，除空白對照組和模型對照組大鼠通過灌胃給予等體積的生理鹽水外，陽性對照組按1.4mg/kg計灌胃給予安理申；本發(fā)明組合物低劑量組按0.9g/kg計灌胃給予本發(fā)明組合物；本發(fā)明組合物中劑量組按1.8g/kg計灌胃給予本發(fā)明組合物；本發(fā)明組合物高劑量組按3.6g/kg計灌胃給予本發(fā)明組合物；缺失人參組按1.8g/kg計灌胃給予缺失人參的中藥組合物；缺失川芎組按1.8g/kg計灌胃給予缺失川芎的中藥組合物；各實驗組大鼠按給藥體積為10mL/kg體重，連續(xù)給藥30天。2.4學習記憶能力測試給藥第23天后開始進行Morris水迷宮訓練。每次訓練四個象限，觀察記錄大鼠在60s內(nèi)找到逃逸平臺所用的時間，即定向航行試驗中大鼠找到逃逸平臺的平均逃避潛伏期，計算各實驗組大鼠訓練1、3、5天后平均逃避潛伏期。訓練第5天后，通過水池上方固定的攝像頭記錄大鼠找到隱蔽平臺的活動，進行圖像采集并用動物行為學視頻分析系統(tǒng)進行處理，規(guī)劃出各實驗組大鼠在定向航行試驗中第5天典型的原始游泳軌跡。給藥第30天進行空間搜索試驗。具體方法為撤除平臺后，大鼠憑空間記憶尋找平臺的位置，記錄60s內(nèi)大鼠跨平臺次數(shù)。在整個測試過程中，水池周圍參照物和實驗者本身的位置保持不變。3、實驗結(jié)果定向航行試驗中各實驗組大鼠找到平臺的平均逃避潛伏期結(jié)果表明：模型對照組較空白對照組相比，第3、5天逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；本發(fā)明組合物低、中、高劑量組在訓練第5天后逃避潛伏期顯著縮短，且與模型對照組比較，本發(fā)明組合物中劑量組具有顯著性差異(P<0.05)，本發(fā)明組合物低、高劑量組具有極顯著性差異(P<0.01)，顯示本發(fā)明組合物可明顯改善SD大鼠的學習記憶和空間定位以及認知能力；缺失人參的中藥組合物組及缺失川芎的中藥組合物組大鼠在訓練第5天后逃避潛伏期，與模型對照組相比無顯著改變，顯示缺失人參或川芎的中藥組合物無明顯改善大鼠空間學習和記憶功能。具體見表1。定向航行試驗中各實驗組大鼠第5天典型的原始游泳軌跡結(jié)果表明：模型對照組較空白對照組相比，模型對照組大鼠在四個象限內(nèi)游泳多次后未找到逃逸平臺，空白對照組大鼠直接從第二象限游向位于第三象限的逃逸平臺，說明模型對照組大鼠記憶力嚴重減退，反應遲慢，驗證了本次實驗造模成功；本發(fā)明組合物低、中、高劑量組大鼠在訓練第5天后均成功找到逃逸平臺，且與模型對照組大鼠比較，本發(fā)明組合物低、中、高劑量組大鼠從游泳起點位置到逃逸平臺的路線均較明確，說明本發(fā)明組合物低、中、高劑量組大鼠學習、記憶、認知能力優(yōu)于模型對照組大鼠，證明本發(fā)明組合物低、中、高劑量組大鼠的老年癡呆均得到了明顯改善；缺失人參或川芎的中藥組合物組大鼠在四個象限內(nèi)游泳多次后才找到逃逸平臺，與模型對照組相比無明顯改善效果，說明缺失人參或川芎的中藥組合物無明顯改善大鼠空間記憶及認知能力。具體見圖6。空間探索試驗結(jié)果表明：與空白組相比，模型組大鼠在規(guī)定時間內(nèi)穿越站臺次數(shù)明顯減少(P<0.05)；與模型對照組相比，本發(fā)明組合物制劑低、中、高劑量組能顯著提高大鼠穿越站臺次數(shù)(P<0.01)，提高大鼠記憶能力；與模型對照組相比，缺失人參或川芎的中藥組合物組無明顯改善大鼠記憶能力。具體見表9。表9各實驗組對Aβ致癡呆大鼠學習記憶能力影響(n＝10,)注：模型對照組與空白對照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；各試驗組與模型對照組比較，#表示P<0.05，##表示P<0.01。綜上，本發(fā)明組合物明顯優(yōu)于相同劑量下缺失部分藥物的中藥組合物，說明本發(fā)明組合物中各組分配伍得當，具有協(xié)同增效的作用。本發(fā)明組合物中各組分聯(lián)合使用，可充分發(fā)揮藥物的多效性以適應老年癡呆的復雜病情，有助于提高療效，減少毒副作用，用于氣虛血弱，痰阻清竅，淤血阻絡(luò)而致的記憶力嚴重減退，行動不便，步履不穩(wěn)，情感淡漠，精神萎靡或易怒，甚至不識家人，不知回家道路等癥狀具有良好的治療效果。對所公開的實施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。當前第1頁1 2 3