相關申請案之交叉引用

本申請案是主張美國臨時申請案第62/121,842號之優(yōu)先權(quán)之國際pct申請案。該美國臨時申請案提交與2015年2月27號，并以全文引用之方式并入本文中。

背景技術：

t細胞（淋巴細胞的一種）于細胞介導之免疫力中起主要作用，因其細胞表面上存在t細胞受體（tcr），而使其不同于其他淋巴細胞諸如b細胞及自然殺傷細胞（nk細胞）。輔助性t細胞（亦稱為cd4+t或cd4t細胞）其表面上表達cd4糖蛋白。當輔助性t細胞曝露于由mhcii類分子呈遞之肽抗原時，該細胞經(jīng)活化。一經(jīng)活化，此等細胞會迅速增殖并分泌調(diào)節(jié)免疫反應之細胞因子。細胞毒性t細胞（亦稱為cd8+t細胞或cd8t細胞）其表面上表達cd8糖蛋白。當細胞毒性t細胞曝露于由mhci類分子呈遞之肽抗原時，該細胞經(jīng)活化。記憶t細胞（一種t細胞亞群）長期保持并回應于其等同源抗原，從而提供具有抵抗過往感染及／或腫瘤細胞之“記憶”之免疫系統(tǒng)。

經(jīng)基因改造后，t細胞可于其表面生產(chǎn)生特殊受體（稱為嵌合抗原受體（car））。car是容許t細胞識別腫瘤細胞質(zhì)特定蛋白（抗原）之蛋白。此等cart細胞經(jīng)改造后于實驗室中生長，直至其等數(shù)量以數(shù)十億計。然后將經(jīng)擴增后之cart細胞群體輸注至病患中。

迄今為止，臨床試驗已顯示嵌合抗原受體（cat）t細胞于對標準化學療法具有抗性之血液惡性腫瘤中具有極佳前景。最顯著的是，特定之cd19cart細胞療法已具有顯著效果，包括對b-細胞惡性腫瘤之長期緩解(kochenderfer,wilson等人，2010,kalos,levine等人，2011；porter,levine等人，2011；davila,riviere等人，2013；grupp,frey等人，2013；grupp,kalos等人，2013；kalos,nazimuddin等人，2013；kochenderfer,dudley等人，2013；kochenderfer,dudley等人，2013；lee,shah等人，2013；park,riviere等人，2013；maude,frey等人，2014)。

盡管car療法于b-細胞白血病及淋巴瘤中獲得成功，但針對t細胞惡性腫瘤之car療法之應用尚未確定。鑒于t細胞惡性腫瘤之療法比b細胞惡性腫瘤之療法具有明顯更差之效果（abramson,feldman等人，2014），因此car療法在這方面具有更大進一步解決臨床需要之潛力。

有80%以上之t細胞急性淋巴母細胞性白血病表達cd5。因t細胞白血病或t細胞淋巴瘤細胞表達cd5表面分子，其中一種治療選擇是以抗cd5抗體治療病患。然而，此等嘗試只獲得有限之成功。

因此，現(xiàn)仍需要更有效、更安全且更高效靶向t細胞相關惡性腫瘤之改良之嵌合抗原受體之療法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供靶向惡性腫瘤之嵌合抗原受體（car）、其組合物及使用方法。

在一個實施例中，本發(fā)明提供經(jīng)改造之嵌合抗原受體多肽，該多肽包含：訊息肽、cd2抗原識別域、鉸鏈區(qū)、跨膜域、至少一個共刺激域及傳訊域。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供經(jīng)改造之嵌合抗原受體多肽，該多肽包含：訊息肽、cd3抗原識別域、鉸鏈區(qū)、跨膜域、至少一個共刺激域及傳訊域。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供經(jīng)改造之嵌合抗原受體多肽，該多肽包含：訊息肽、cd4抗原識別域、鉸鏈區(qū)、跨膜域、至少一個共刺激域及傳訊域。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供經(jīng)改造之嵌合抗原受體多肽，該多肽包含：訊息肽、cd5抗原識別域、鉸鏈區(qū)、跨膜域、至少一個共刺激域及傳訊域。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供經(jīng)改造之嵌合抗原受體多肽，該多肽包含：訊息肽、cd7抗原識別域、鉸鏈區(qū)、跨膜域、至少一個共刺激域及傳訊域。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供經(jīng)改造之嵌合抗原受體多肽，該多肽包含：訊息肽、cd8抗原識別域、鉸鏈區(qū)、跨膜域、至少一個共刺激域及傳訊域。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供經(jīng)改造之嵌合抗原受體多肽，該多肽包含：訊息肽、cd52抗原識別域、鉸鏈區(qū)、跨膜域、至少一個共刺激域及傳訊域。

在一個實施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)改造之嵌合抗原受體多核苷酸，其編碼具有對cd2具有選擇性之抗原識別域之嵌合抗原受體多肽。

在一個實施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)改造之嵌合抗原受體多核苷酸，其編碼具有對cd3具有選擇性之抗原識別域之嵌合抗原受體多肽。

在一個實施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)改造之嵌合抗原受體多核苷酸，其編碼具有對cd4具有選擇性之抗原識別域之嵌合抗原受體多肽。

在一個實施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)改造之嵌合抗原受體多核苷酸，其編碼具有對cd5具有選擇性之抗原識別域之嵌合抗原受體多肽。

在一個實施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)改造之嵌合抗原受體多核苷酸，其編碼具有對cd7具有選擇性之抗原識別域之嵌合抗原受體多肽。

在一個實施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)改造之嵌合抗原受體多核苷酸，其編碼具有對cd8具有選擇性之抗原識別域之嵌合抗原受體多肽。

在一個實施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)改造之嵌合抗原受體多核苷酸，其編碼具有對cd52具有選擇性之抗原識別域之嵌合抗原受體多肽。

在一個實施例中，本發(fā)明提供表達上述嵌合抗原受體多肽中之任何一者之經(jīng)改造之細胞。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供表達上述嵌合抗原受體多肽中之任何一者之經(jīng)改造之細胞。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)表達具有對cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52有選擇性之抗原識別域之嵌合抗原受體多肽或多核苷酸之經(jīng)改造之細胞之方法。該方法包括(i)提供外周血細胞或臍帶血細胞；(ii)將上述多核苷酸引入上述細胞中；(iii)擴增步驟(ii)之細胞；及分離步驟(iii)之細胞以提供該經(jīng)改造之細胞。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)表達具有對cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52有選擇性之抗原識別域之嵌合抗原受體多肽或多核苷酸之經(jīng)改造之細胞之方法。該方法包括(i)提供外周血細胞或臍帶血細胞；(ii)將上述多核苷酸引入上述細胞中；(iii)擴增步驟(ii)之細胞；及分離步驟(iii)之細胞以提供該經(jīng)改造之細胞。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于產(chǎn)生表達具有對cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52具有選擇性之抗原識別域之嵌合抗原多肽或多核苷酸之經(jīng)改造之細胞之方法。該方法包括(i)提供胎盤細胞、胚胎干細胞、誘導多能干細胞或造血干細胞；(ii)將上述多核苷酸引入步驟(i)之細胞中；(iii)擴增步驟(ii)之細胞；及(iv)分離步驟(iii)之細胞以提供該經(jīng)改造之細胞。

在一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于向有此需要之病患賦予針對cd4陽性t細胞白血病或cd4陽性t細胞淋巴瘤之抗白血病或抗淋巴瘤免疫力之方法。該方法包括(i)向有此需要之病患給予有效治療之數(shù)量之表達具有cd4抗原識別域之car多肽之經(jīng)改造之細胞；及(ii)視需要地，分析該病患針對t細胞白血病或t細胞淋巴瘤之免疫力。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于減少cd4陽性t細胞白血病細胞或cd4陽性t細胞淋巴瘤細胞之數(shù)量之方法。該方法包括(i)使cd4陽性t細胞白血病細胞或cd4陽性t細胞淋巴瘤細胞與有效量之表達具有cd4抗原識別域之car多肽之經(jīng)改造之細胞接觸；及(ii)視需要地，分析cd4陽性t細胞白血病細胞或cd4陽性t細胞淋巴瘤細胞。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于減少具有cd2抗原之免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之方法。該方法包括(i)使該等免疫調(diào)節(jié)細胞與有效量之表達具有cd2抗原識別域之car多肽之經(jīng)改造之細胞接觸；及(ii)視有需要地，分析免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之減少。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于減少具有cd3抗原之免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之方法。該方法包括(i)使該等免疫調(diào)節(jié)細胞于有效量之表達具有cd3抗原識別域之car多肽之經(jīng)改造之細胞接觸；及(ii)視需要地，分析免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之減少。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于減少具有cd4抗原之免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之方法。該方法包括(i)使該等免疫調(diào)節(jié)細胞與有效量之表達具有cd4抗原識別域之car多肽之經(jīng)改造之細胞接觸；及(ii)視需要地，分析免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之減少。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于減少具有cd5抗原之免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之方法。該方法包括(i)使該等免疫調(diào)節(jié)細胞與有效量之表達具有cd5抗原識別域之car多肽之經(jīng)改造之細胞接觸；及(ii)視需要地，分析免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之減少。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于減少具有cd7抗原之免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之方法。該方法包括(i)使該等免疫調(diào)節(jié)細胞與有效量之表達具有cd7抗原識別域之car多肽之經(jīng)改造之細胞接觸；及(ii)視需要地，分析免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之減少。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于減少具有cd8抗原之免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之方法。該方法包括(i)使該等免疫調(diào)節(jié)細胞與有效量之表達具有cd8抗原識別域之car多肽之經(jīng)改造之細胞接觸；及(ii)視需要地，分析免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之減少。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于減少具有cd52抗原之免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之方法。該方法包括(i)使該等免疫調(diào)節(jié)細胞與有效量之表達具有cd52抗原識別域之car多肽之經(jīng)改造之細胞接觸；及(ii)視需要地，分析免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之減少。

在一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于治療細胞增殖性疾病之方法。該方法包括(i)向由此需要之病患投與治療有效量之表達具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52抗原識別域之car多肽之經(jīng)改造之細胞。

在一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于治療自體免疫性疾病之方法。該方法包括(i)向有需要之病患予有效治療之數(shù)量之表達具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52抗原識別域之car多肽之經(jīng)改造之細胞。

在一個實施例中，本發(fā)明提供用于治療細胞增殖性疾病之表達具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52抗原識別域之car多肽之經(jīng)改造之細胞。其用途包括向有此需要之病患給予該等經(jīng)改造之細胞。

在一些實施例中，car通常包含胞內(nèi)傳訊域、鉸鏈域及／或跨膜域之至少一者。第一代car包含胞內(nèi)傳訊域cd3z，而第二代car包含衍生自（例如，單不限于）cd28或4-1bb之單一共刺激域。第三代car包括兩個共刺激域，諸如（但不限于）cd28、4-1bb（亦稱為cd137）及ox-40及任何其他共刺激分子。

在一些實施例中，具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52抗原識別域之car是表達組件之一部分。在一些較佳的實施例中，該表達基因或表達組件可包含輔助基因或標簽或其一部分。該輔助基因可為可誘導型自殺基因或其一部分，包括（但不限于）半胱天冬酶9（cas瀃ase9）基因。該”自殺基因”之消除機制改善該基因療法之安全性，并僅在藉由特定化合物或分子活化時殺死細胞。在一些實施例中，抗原決定基標簽c-瀀yc標簽、鏈霉親合素結(jié)合肽（sbp）、截短egfr基因（egfrt）或者其一部分或組合。

【圖式簡單說明】

圖1：cd4car表達。（a），編碼cd4car之重組慢病毒載體之例示性代表圖。cd4car表達是藉由sffv（形成脾臟病灶病毒）啟動子啟動。第三代cd4car含有前導序列、抗cd4scfv、鉸鏈域（h）、跨膜域（tm）及如下的細胞內(nèi)傳訊域：cd28、4-1bb（兩個均為共刺激分子）及cd3z。（b）：用慢病毒質(zhì)粒針對gfp（道1）及cd4car（道2）轉(zhuǎn)染293ft細胞以在轉(zhuǎn)染后48h進行蛋白質(zhì)印跡法分析并用小鼠抗人類cd3z抗體探測。（c）：靶向cd4表達細胞質(zhì)第三代嵌合抗原受體t細胞之組分之展示。

圖2：cd4cart細胞之產(chǎn)生。（a），實驗設計。（b），用抗cd3抗體及il-2激活cb白細胞層（buffycoat）細胞。用gfp（中間）或cd4car（右側(cè)）慢病毒上清液轉(zhuǎn)導細胞。培養(yǎng)7天后，依序使用與生物素共軛之山羊抗鼠fab2或山羊igg抗體及鏈霉親和素-pe藉由流式細胞分析法分析細胞。左側(cè)顯示未經(jīng)傳導之標記過之cb細胞。（c）：cd4cart細胞在t細胞擴增期間耗盡cd4+群體。用抗cd3抗體及il-2將cb軟層細胞激活兩天。cb白細胞層（buffycoat）細胞含有兩組不同之t細胞、cd8+細胞毒性t細胞及cd4+輔助性t表（左側(cè)）。用gfp（中間）或cd4car（右側(cè)）慢病毒上清液轉(zhuǎn)導細胞。培養(yǎng)3天后，使用小鼠-抗人cd4（fitc）及cd8（apc）抗體藉由流式細胞分析法分析細胞。亦標記未經(jīng)轉(zhuǎn)導之pmbc（左側(cè)）。（d）：大多數(shù)cd4cart細胞具有中央型記憶顯型。用抗cd3抗體將cb白細胞層（buffycoat）細胞激活2天。用cd4car慢病毒上清液轉(zhuǎn)導細胞。擴增6天后，藉由流式細胞分析法分析cd8+細胞之cd62l、cd45ro及cd45ra顯型（n=3）。

圖3：cd4cart細胞在共培養(yǎng)分析中消除t細胞白血病細胞。（a），cd4cart細胞在共培養(yǎng)中消除karpas299t細胞白血病細胞。將經(jīng)gfp（中間）或cd4car（右側(cè)）慢病毒上清液轉(zhuǎn)導之經(jīng)激活之人類cb白細胞層（buffycoat）細胞與karpas299細胞以2:1之比率培養(yǎng)。24小時共培養(yǎng)后，細胞用小鼠抗人cd4（apc）及cd8（percp）抗體進行染色并藉由流式細胞分析法分析t細胞亞群（n=3）。（b）及（c）：cd4cart細胞在共培養(yǎng)中消除原發(fā)性t細胞白血病細胞。將經(jīng)gfp（中間）或cd4car（右側(cè)）慢病毒上清液轉(zhuǎn)導之經(jīng)激活之人類cb白細胞層（buffycoat）細胞與經(jīng)細胞膜染料cmtmr預染色之sp53被套細胞淋巴瘤細胞以2:1之比率培養(yǎng)。24小時共培養(yǎng)后，細胞用小鼠抗人cd3（perc瀃）進行染色然后藉由流式細胞分析法（n=2）分析。經(jīng)cmtmr預染色之sp53細胞亦單獨標記（左側(cè)）。

圖4：衍生自pbmc之cd4cart細胞極其強化cd8+t細胞并針對性殺死表達cd4抗原之白血病細胞。（a）衍生自pbmc之cd4cart細胞極其強化cd8+t細胞。用抗cd3抗體及il-2將由cd4+與cd8+t細胞組成之pmbc白細胞層（buffycoat）細胞激活2天，然后用gfp（中間）或cd4car（右側(cè)）慢病毒上清液轉(zhuǎn)導。培養(yǎng)3天后，標記細胞并借由流式細胞分析法分析t細胞亞群。未經(jīng)轉(zhuǎn)導之pmbc亦經(jīng)標記（左側(cè)）。（b）：cd4cart細胞特別地針對并殺死karpas299細胞。將經(jīng)gfp對照組或cd4car慢病毒上清液轉(zhuǎn)導之pmbct細胞與經(jīng)cfse染色之parpas299分別以2:1、5:1及10:1之比率培養(yǎng)。在37℃下培養(yǎng)過夜后，添加染劑7aad，將該等細胞藉由流式細胞分析法進行分析，再藉由比較靶細胞之存活相對于陰性對照組細胞（sp53細胞，經(jīng)cmtmr染色之b細胞淋巴瘤細胞系）之存活來測量靶細胞之殺傷率。

圖5：cd4cart細胞利用不同模式高效減輕活體內(nèi)抗白血病效應。nsg小鼠接受2.5gy亞致死照射。照射二十四小時后，向小鼠皮下注射1x10⁶(在a中)或0.5x10⁶個(在b及c中)karpas299細胞。被注射之小鼠經(jīng)不同之cd4cart細胞或?qū)φ战Mt細胞之療程處理。各組有n=5只被注射之小鼠。(a)：低劑量（2x10⁶個）之cd4cart細胞會在第3天注射。在第22天發(fā)現(xiàn)腫瘤生長加速后，再注射高劑量（8x10⁶個）之cd4cart細胞。(b)：分別在第3及第10天注射兩個大劑量之cd4cart細胞(8x10⁶個及5.5x10⁶個)。(c)：每5天注射相同之低劑量(2.5x10⁶個)之cd4cart細胞，總共四次。(d)：用經(jīng)指示之cd4cart細胞或?qū)φ战Mgfpt細胞之數(shù)量處理之存活之小鼠。n=10。

圖6：hek-293細胞表面上表達cd4car。hek-293細胞用cd4car或gfp對照組病毒上清液轉(zhuǎn)導6小時。培養(yǎng)3天后，用流式細胞術分析細胞。

圖7：比較經(jīng)lenti-gfp及cd4car病毒轉(zhuǎn)導之經(jīng)活化之pmbc白細胞層細胞之細胞生長。在第0天用gfp對照組或cd4-car慢病毒上清液轉(zhuǎn)導經(jīng)活化之pmbc白細胞層細胞。在第1天清洗細胞并在第3及第5天添加培養(yǎng)基。

圖8：cd4car構(gòu)筑體。(a)編碼藉由形成脾臟病灶病毒(sffv)啟動子驅(qū)動之第三代cd4car之慢病毒載體之例示性代表圖。該構(gòu)筑體含有前導序列、抗cd4scfv、鉸鏈域(h)、跨膜域(tm)及傳訊域cd28、4-1bb及cd3ζ。(b)：hek293ft細胞經(jīng)gfp載體對照組(道1)及cd4car(道2)慢病毒質(zhì)體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染四十八小時后，移除細胞并與小鼠抗人類cd3z抗體一起用于蛋白印跡法分析。(c)靶向表達cd4之細胞之第三代carnk細胞之繪示。

圖9：cd4carnk細胞產(chǎn)生。(a，上方格)在藉由facs(n=3)分選前，nk細胞上cd4car之表達程度；(a，下方格)在分選及擴增后，在共培養(yǎng)實驗(n=3)前，nk細胞上之cd4car表達。

圖10：cd4carnk細胞在共培養(yǎng)分析中消除cd4+白血病及淋巴瘤細胞。共培養(yǎng)實驗是以2:1效應細胞對靶細胞比率進行24小時并藉由流式細胞術直接分析cd56及cd4(方格a及b)。各分析由靶細胞單獨對照組(左側(cè))及用載體對照組(中央)或用cd4car(右側(cè))慢病毒上清液轉(zhuǎn)導之nk細胞共培養(yǎng)之靶細胞組成。頂行，方格a：karpas299(n=3)。中間行，方格a：hl-60t細胞(n=2)。底行，方格a：ccrfcem細胞(n=2)。cd4carnk細胞消除來自患有cd4+t細胞淋巴瘤/sézary癥候群(n=2)及表達cd4之小兒t細胞all(n=2)之病患之原發(fā)性t細胞白血病細胞。(c)：條形圖總結(jié)2:1及5:1e:t比率之共培養(yǎng)分析結(jié)果。

圖11：共培養(yǎng)特異性及劑量反應殺傷曲線表。cd4carnk細胞以劑量依賴性及特異性方式溶解表達cd4之白血病細胞系。將cd4carnk及載體對照組細胞與相等比率之經(jīng)cfse染色之「中靶」(karpas299或ccrf-cem)細胞及經(jīng)cmtmr染色之「脫靶」molt4細胞以1:4、1:2及1:1效應細胞對靶細胞比率培養(yǎng)。24小時后，添加7-aad染料并藉由流式細胞術分析剩余活細胞。藉由比較cd4carnk細胞共培養(yǎng)物中cd4+karpas299或ccrf-cem之細胞存活量與載體對照組nk細胞共培養(yǎng)物中cd4+karpas299或ccrf-cem之細胞存活測量靶細胞之殺傷率。

圖12：cd4carnk細胞以2:1效應細胞對靶細胞比率消除分離自人類臍帶血之cd4+t細胞，但不影響造血干細胞/祖代室產(chǎn)量。(a)以2:1效應細胞對靶細胞比率進行共培養(yǎng)分析24小時，之后，用小鼠抗人類cd56及cd4抗體給細胞染色。靶細胞作為對照組(左側(cè))單獨培養(yǎng)。nk細胞用載體對照組(中央)或cd4car(右側(cè))慢病毒上清液轉(zhuǎn)導并與分離自人類臍帶血之cd4+t細胞一起培養(yǎng)。(n=2)(b)將cd4carnk細胞分別以2:1及5:1之效應細胞:靶細胞比率與500cd34+臍帶血細胞于經(jīng)il-2補充之nk細胞培養(yǎng)基中共培養(yǎng)24小時。使用之實驗對照組是cd34+細胞單獨，且未經(jīng)轉(zhuǎn)導之nk細胞以各自2:1及5:1效應細胞:靶細胞比率與cd34+cb細胞共培養(yǎng)。第16天以紅血球爆裂形成單位(bfu-e)及顆粒球/單核球集落形成單位(cfu-gm)之數(shù)量之形成評定造血室輸出。經(jīng)由α設定在0.05之雙向anova進行cfu統(tǒng)計分析。

圖13：cd4carnk細胞證實活體內(nèi)抗白血病效應。nsg小鼠經(jīng)亞致死照射且皮內(nèi)注射表現(xiàn)螢光素酶之karpas299細胞(第0天)以誘發(fā)可測量之腫瘤之形成。在第1天及每5天總共6個療程，對小鼠靜脈內(nèi)注射5x10⁶個cd4carnk細胞或載體對照組nk對照組細胞。(a)在第7、14及21天，小鼠在皮下被注射redijectd-螢光素并經(jīng)受ivis成像。(b)：將注射cd4carnk之小鼠之平均光強度與注射載體對照組nk之小鼠之平均光強度進行比較。(c)在第1天及之后每隔一天，測量腫瘤尺寸面積并比較兩組間之平均腫瘤尺寸。(d)測量小鼠之存活百分率并在兩組間進行比較。

圖14：cd4carnk細胞在共培養(yǎng)分析中消除cd4陽性白血病及淋巴瘤細胞。所示之所有分析是以5:1效應細胞對靶細胞比率進行24小時共培養(yǎng)，之后，用小鼠抗人類cd56及cd4抗體對細胞進行染色。各分析由經(jīng)載體對照組(中央)或cd4car(右側(cè))慢病毒上清液轉(zhuǎn)導并經(jīng)靶細胞共培養(yǎng)之nk細胞，及作為對照組(左側(cè))經(jīng)單獨培養(yǎng)之靶細胞組成。cd4carnk細胞消除karpas299白血病t細胞(a)、hl-60t細胞(b)及ccrf-cem細胞(c)。cd4carnk細胞消除來自患有表達cd4之t細胞白血病/sézary癥候群(e)之病患及表達cd4之小兒t細胞all(f)之病患之原發(fā)性t細胞白血病細胞。

圖15：nk細胞經(jīng)載體對照組或cd4car慢病毒上清液轉(zhuǎn)導或經(jīng)培養(yǎng)用于未經(jīng)轉(zhuǎn)導之對照組。培養(yǎng)7天后，收獲細胞并依序使用經(jīng)生物素標記后之山羊抗小鼠f(ab’)2及鏈霉親和素-pe藉由流式細胞術分析。分選后，nk細胞有>85%cd4car+。

圖16：cd4carnk細胞不溶解cd4-、cd5+molt4陰性對照組。(a)molt4細胞免疫顯型經(jīng)證實幾乎全部是cd4-及cd5+。(b)：藉由相較于載體對照組nk細胞腫瘤溶解(上方格)評定，cd4carnk細胞在5:1效應細胞對靶細胞比率下在0h、4h、8h及24h(下方格)時不分解molt4細胞。(c)用cd4+karpas299陽性對照組以5:1e:t比率在4h時證實抗cd4cdcarnk抗腫瘤活性。

圖17：cd5car之產(chǎn)生。a：cd5car之dna基因構(gòu)筑體及經(jīng)轉(zhuǎn)譯之蛋白構(gòu)筑體，及錨固cd5scfv抗體及展示cd5car之產(chǎn)生及功能之草圖。第三代cd5car構(gòu)筑體之dna構(gòu)筑體自5'向3'閱讀為：前導序列、抗cd5細胞外單鏈抗體(抗cd5scfv)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)及將此構(gòu)筑體界定為第3代car之三個細胞內(nèi)傳訊域；cd28、4-1bb及cd3ζ。錨固cd5scfv抗體之dna構(gòu)筑體與無細胞內(nèi)傳訊域之cd5car構(gòu)筑體相同，如同用于錨固cd5scfv抗體之經(jīng)轉(zhuǎn)譯之蛋白產(chǎn)品。該等經(jīng)轉(zhuǎn)譯之蛋白構(gòu)筑體含有將結(jié)合至cd5靶細胞之抗cd5scfv、容許將抗cd5scfv適當?shù)囟ㄎ辉谝匀菰S最佳化結(jié)合cd5靶細胞之位置之鉸鏈區(qū)、及跨膜區(qū)。完整之cd5car蛋白亦含有兩個共刺激域及cd3ζ鏈之細胞內(nèi)域。此構(gòu)筑體視為第3代car：cd28、4-1bb及cd3ζ。b：蛋白印跡法分析證實hek293細胞中之cd5car表達。將已經(jīng)gfp(作為陰性對照組)或cd5car慢病毒轉(zhuǎn)導48h之hek293細胞用于使用cd3ζ抗體之蛋白印跡法分析中以測定cd5car之表達。左道，gfp對照組hek293細胞，如預期般無條帶。右道顯示約50kda之條帶，預料中之分子量，基于cd5car構(gòu)筑體之分子量。c：經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)導之cd5cart細胞之表面上之cd5car表達之流式細胞術分析。此分析是用第二次慢病毒轉(zhuǎn)導后之第8天于經(jīng)雙轉(zhuǎn)導之cd5cart細胞上進行分析。左：同型對照組t細胞群體(陰性對照組)；右：使用山羊抗小鼠f(ab')2-pe藉由流式細胞術，測量出20.53%之cd5car表達在之經(jīng)轉(zhuǎn)導之t細胞上。

圖18：cd5cart細胞之轉(zhuǎn)導之研究略圖。a：藉由單轉(zhuǎn)導產(chǎn)生cd5cart細胞之步驟。b：藉由雙轉(zhuǎn)導產(chǎn)生cd5cart細胞之步驟。c：比較利用cd5car慢病毒進行之單轉(zhuǎn)導及雙轉(zhuǎn)導對t細胞上之cd5表達之下調(diào)。細胞外cd5蛋白及gfpt細胞對照組在慢病毒轉(zhuǎn)導后8天內(nèi)之下調(diào)之分析。經(jīng)單轉(zhuǎn)導之cd5cart細胞在第8天沒有顯示在細胞表面之cd5之完全下調(diào)，且cd5蛋白表達在第6天減少最大。在經(jīng)雙轉(zhuǎn)導之群體中，cd5+、cd3+雙陽性cd5cart細胞之絕對數(shù)量隨時間變化而減少，自第0天減少24.44%至第4天之接近完全沒有cd5之表達。相比之下，該gfpt細胞對照組自第2天至第8天一直保持cd5+、cd3+雙陽性群體大于95%。

圖19：在用錨固cd5scfv抗體進行慢病毒轉(zhuǎn)導7天后，t細胞上之cd5表達下調(diào)。a：用錨固cd5scfv慢病毒進行轉(zhuǎn)導(單轉(zhuǎn)導)之研究略圖。b：錨固cd5scfv下調(diào)或減少t細胞之表面cd5表達之數(shù)量。流式細胞術分析證實在cd5scfv之單轉(zhuǎn)導及7天培養(yǎng)后，cd5蛋白表達顯著減少(~32%)。觀察到cd5表達消除，但7天后仍未完全消除，且目前正針對經(jīng)雙轉(zhuǎn)導之錨固cd5scfv抗體完成后續(xù)研究。

圖20：cd5car細胞有效溶解表達cd5之t-all細胞系，且不溶解不表達cd5之t白血病細胞系。a：t-all細胞系單獨(左欄)、與經(jīng)gfp載體轉(zhuǎn)導之t細胞(中間列)共培養(yǎng)及與經(jīng)cd5car轉(zhuǎn)導之t細胞(右列)共培養(yǎng)之流式細胞術分析。各細胞系見于各行中，cd5+tall細胞系(ccrf-cem及molt-4)位于頂行及中間行，cd5陰性細胞系見于底行(karpas299)。kaepas299是cd5陰性t細胞淋巴瘤。所有共培養(yǎng)時間為24小時，效應細胞:靶細胞比率為5:1。相較于gfp對照組，兩種cd5tall白血病細胞系之細胞溶解相較于gfp對照組均超過78%。b：此條形圖指示當相較于描述于圖20a中之gfpt細胞共培養(yǎng)時，cd5cart細胞達成該等t細胞溶解。在與cd5陰性之karpas299一起培養(yǎng)之cd5cart細胞共培養(yǎng)物中未觀察到溶解(一式兩份地完成n=3次獨立實驗)。

圖21：cd5car細胞有效溶解來自表達cd5之病患樣品之t-細胞急性淋巴性白血病細胞。a：t-all細胞單獨(左欄)、與gfpt細胞(中間列)共培養(yǎng)及與cd5cart細胞(右列)共培養(yǎng)之流式細胞術分析。各病患細胞給定一行并編號以維持病患保密原則。所有共培養(yǎng)時間為24小時，及效應細胞:靶細胞比率為5:1。與對照組相比，tall-1之細胞溶解度相較于gfp對照組超過71.3%。剩余細胞系亦證實陽性細胞溶解，但溶解程度較小，在33至47%之間。此可與表達cd5之各白血病樣品相關，且討論于下文中。b：此條形圖指示當相較于圖21a中描述之gfpt細胞共培養(yǎng)時，cd5cart細胞達成t細胞溶解。所有實驗都是一式兩份地完成。c：流式細胞術分析資料證實圖21a中所分析之病患t細胞all樣品之cd3及cd5表達程度。t-all1及t-all3有不同之cd5陽性。d.在同一個模版上之四個病患樣品t-all細胞群體之cd5表達程度之流式細胞術分析。藉由流式細胞術分析測量平均螢光強度(mfi)之差異(圖21c)。

圖22：針對病患t-all細胞(t-all-8)之cd5cart細胞殺傷力之詳細分析。流式細胞術分析證實cd5cart細胞有殺死病患tall細胞之能力。對照組gfp-t細胞及t-all-8細胞共培養(yǎng)見左側(cè)，cd5car及t-all8共培養(yǎng)見右側(cè)。所有cd5陽性細胞(cd34陽性(紅圈)及cd34陰性(綠圈，t細胞))劇烈溶解靶細胞，cd5陰性細胞無溶解靶細胞。當相較于gfp對照組時，cd5cart細胞溶解最少93.1%cd5陽性tall-8細胞。實驗一式兩份地完成。此外，cd5cart細胞基本上消除t細胞群體(cd5+cd34-，綠圈)。

圖23：cd5cart細胞有效消除正常經(jīng)gfp標記之t細胞。a：cd5cart細胞以劑量依賴性方式殺死正常t細胞。cd5cart細胞或cd123cart細胞(對照組)與經(jīng)gfp標記之t細胞以0.25:1、0.5:1及1:1效應細胞對靶細胞比率進行共培養(yǎng)。24小時后，藉由流式細胞術分析剩余之活gfpt細胞。藉由比較cd5共培養(yǎng)物中之gfpt細胞存活相對于對照組cd123cart細胞(因為t細胞不表達cd123)中之gfpt細胞存活測量靶細胞之殺傷率。b：基于a資料之共培養(yǎng)殺傷曲線圖。

圖24：t細胞在與cd5car或錨固cd5scfvt細胞共培養(yǎng)時持續(xù)表達cd5。a：產(chǎn)生cd5cart細胞或錨固cd5scfvt細胞及cd123cart細胞(對照組)之步驟。b：經(jīng)不同car轉(zhuǎn)導之t細胞上之cd5表達程度(第2次轉(zhuǎn)導后第3天)。用表達cd5car或錨固cd5scfv及cd123car之慢病毒轉(zhuǎn)導經(jīng)激活之t細胞。轉(zhuǎn)導3天后，藉由流式細胞術分析cd5表達。

圖25：進行共培養(yǎng)分析以判定正常t細胞在以1:1比率與cd5car或錨固cd5scfvt細胞或cd123car(對照組)共培養(yǎng)2天(圖25a)或4天(圖25b)時是否持續(xù)表達cd5。用經(jīng)gfp標記之t細胞與cd5cart細胞或錨固cd5scfvt細胞或cd123cart(對照組)細胞進行共培養(yǎng)且藉由流式細胞術分析經(jīng)共培養(yǎng)后之經(jīng)gfp標記之t細胞之cd5表達及活細胞。c(圖25c)，經(jīng)cd5car-或錨固cd5scfv轉(zhuǎn)導之ccrf-cem或molt-4tall細胞顯示cd5表達下調(diào)。ccrf-cem或molt-4tall細胞經(jīng)表達cd5car或錨固cd5scfv之慢病毒轉(zhuǎn)導。第二次轉(zhuǎn)導后，藉由流式細胞術分析經(jīng)轉(zhuǎn)導之白血病細胞之cd5表達。

圖26：cd5cart細胞展示活體內(nèi)深度抗白血病效應。nsg小鼠經(jīng)亞致死量照射24小時后，靜脈注射1x10⁶個表現(xiàn)螢光素酶之ccrf-cem細胞(第0天)以引起可測量之腫瘤形成。在第3及第4天，對小鼠靜脈內(nèi)注射5x10⁶個cd5cart細胞或載體對照組t細胞。在第6及第7天重復此等注射，總計每只小鼠注射2.0x10⁷個細胞。a：在第5、8、10及13天，對小鼠皮下注射redijectd-螢光素并經(jīng)受ivis成像。b：將注射cd5cart之小鼠之平均光強度與注射載體對照組t之小鼠之平均光強度進行比較。c：經(jīng)cd5cart細胞處理之小鼠相較于對照組之小鼠之腫瘤細胞之殺傷率。d：在第15天將自小鼠中抽取外周血并測量白血病細胞之百分率且與載體對照組或經(jīng)正常注射之小鼠之白血病細胞之百分率進行比較。

圖27：cd5carnk細胞(nk-92)有效消除活體外ccrfcemt-all細胞系。a及b：以指示之e:t(效應細胞:靶細胞)細胞比率將表達cd5之t-淋巴性細胞系ccrfcem與cd5carnk細胞共培養(yǎng)24小時。使用cd56及cd5分別分離nk-car及靶細胞群體藉由流式細胞術定量靶群體。經(jīng)轉(zhuǎn)導之載體對照組nk細胞之細胞存活表達及各條形圖表示n=2次重復樣品之平均統(tǒng)計資料。c：cd5carnk細胞以劑量依賴性方式消除ccrf-cem細胞。以指示之e:t(效應細胞:靶細胞)細胞比率將表達cd5之t-淋巴性細胞系ccrf-cem與cd5carnk細胞進行共培養(yǎng)及e:t比率之下界減少。在2:1之e:t比率達成飽和且在減小之比率下之共培養(yǎng)看出cd5消除之劑量依賴性方式。在5:1時達成ccrf-cem之完全消除。

圖28：cd5carnk細胞有效溶解兩種cd5+t-all細胞系，molt-4及jurkat。a：以指示之e:t(效應細胞:靶細胞)細胞比率將cd5carnk細胞與molt-4細胞共培養(yǎng)24小時。細胞存活相對于經(jīng)轉(zhuǎn)導之體對照組nk細胞之表達及各條形圖表示n=2次實驗重復樣品之平均統(tǒng)計資料。b：以指示之e:t(效應細胞:靶細胞)細胞比率將cd5carnk細胞與jurkat細胞共培養(yǎng)24小時。細胞存活相對于經(jīng)轉(zhuǎn)導之載體對照組nk細胞之表達及各條形圖表示n=2次實驗重復樣品之平均統(tǒng)計資料。

圖29：cd5carnk細胞有效消除人類樣品的侵襲性cd5+t-all細胞。a：以指示之e:t(效應細胞:靶細胞)細胞比率將病患t-all#1之t-all細胞與cd5carnk細胞共培養(yǎng)24小時。b：以指示之e:t(效應細胞:靶細胞)細胞比率將病患t-all#2之t-all細胞與cd5carnk細胞共培養(yǎng)24小時。閘控靶群體并使用細胞cytotracker染料(cmtmr)藉由流式細胞術定量以篩選t-all病患樣品。資料顯示重復樣品之平均統(tǒng)計資料。利用同型對照組閘控靶cd5+cd34+細胞群體。細胞存活展示在條形圖，相對于經(jīng)轉(zhuǎn)導載體之對照組nk細胞。從左至右，該條形圖顯示各比率于cd34+cd5+之資料（左側(cè)）和于cd5+cd34-之資料（右側(cè)）。cd5carnk顯示以抗低cd5+cd34+潛在腫瘤干細胞群體之活性使高表達cd5+靶群體幾乎完全溶解。在2:1下達成飽和，表示需要稀釋e:t比率。圖29c及29d：來自病患#3(ptcl)及病患#4(sezary癥候群)之白血病細胞分別以指示之e:t(效應細胞:靶細胞)細胞比率與cd5carnk細胞共培養(yǎng)24小時。

圖30：cd5nk-car特別地消除臍帶血t細胞。t細胞分離自臍帶血(ucb)t細胞并以指示之e:t(效應細胞:靶細胞)細胞比率與cd5carnk細胞共培養(yǎng)24小時。使用cd56及cd5分別分離nk-car及t細胞群體并藉由流式細胞術定量。細胞存活相對于經(jīng)轉(zhuǎn)導之載體對照組nk細胞之表達及各條形圖表示重復樣品之平均統(tǒng)計資料。

圖31：cd5carnk細胞有效消除cd5+被套細胞淋巴瘤及慢性淋巴性白血病。將cd5carnk細胞與jeko細胞(圖31a)及來自患有被套細胞淋巴瘤(圖31b)及慢性淋巴細胞性白血病(圖31c)之病患之白血病細胞進行共培養(yǎng)。表達cd5之主要子集合之被套細胞系淋巴瘤衍生之細胞系jeko以指示之e:t(效應細胞:靶細胞)細胞比率與cd5carnk細胞共培養(yǎng)6小時。被套細胞淋巴瘤或cll進行共培養(yǎng)24小時。閘控靶群體并以流式細胞術定量，如圖示中繪示。cd5carnk細胞特別地靶向cd5+cd19+白血病群體及cd5+cd19-t細胞群體。細胞存活相對于經(jīng)轉(zhuǎn)導之載體對照組nk細胞之表達及各條形圖表示重復樣品之平均統(tǒng)計資料。

圖32：總結(jié)cd5carnk細胞共培養(yǎng)研究之條形圖。

圖33：cd5carnk細胞展示活體內(nèi)強效抗白血病效應。nsg小鼠經(jīng)亞致死量照射24小時后，靜脈內(nèi)注射1x10⁶個表現(xiàn)螢光素酶之ccrf-cem細胞(第0天)以引起可測量之腫瘤形成。在第3及第4天，對小鼠靜脈內(nèi)注射5x10⁶個cd5carnk細胞或載體對照組nk細胞。在第6及第7天重復此等注射，總計每只小鼠注射2.0x10⁷個細胞。a：在第5天，對小鼠皮下注射redijectd-螢光素并經(jīng)受ivis成像。b：經(jīng)cd5carnk細胞處理之小鼠相對于對照組之腫瘤細胞之殺傷率。

圖34：cd3car之結(jié)構(gòu)及其表達。a：cd3car之結(jié)構(gòu)于慢病毒載體中之圖示。car表達是由sffv(脾臟病灶形成病毒)啟動子驅(qū)動并作為第3代構(gòu)筑體，其含有前導序列、抗cd3scfv、鉸鏈域(h)、跨膜域(tm)、兩個共刺激域cd28及4-bb及細胞內(nèi)傳訊域cd3ζ。b：hek-293ft細胞經(jīng)gfp(道1)及cd3car(道2)之慢病毒質(zhì)體轉(zhuǎn)導以用于在轉(zhuǎn)導后48h進行蛋白印跡法分析并用小鼠抗人類cd3ζ抗體探測。

圖35：cd3carnk細胞消除活體外表達cd3之t-all細胞系。a：約80%cd3之t-淋巴性細胞系jurkat以指示之e:t(效應細胞:靶細胞)細胞比率與cd3carnk細胞進行共培養(yǎng)6小時。b：經(jīng)分選(ccrf-cd3)或未經(jīng)分選之ccrf-cem(ccrfcem)細胞與cd3carnk細胞進行共培養(yǎng)24小時。使用cd56及cd3分別分離nkcar及靶細胞群體并藉由流式細胞術定量靶群體。細胞存活相對于經(jīng)轉(zhuǎn)導之載體對照組nk細胞之表達及各條形圖表示n=2次實驗之重復樣品之平均統(tǒng)計資料。

圖36：該等cd3carnk細胞針對病患樣品之原發(fā)性cd3+白血病細胞顯示出強殺傷力。a：spt-1(sezary癥候群)病患細胞是cd3陽性并以指示之e:t(效應細胞:靶細胞)細胞比率與cd3carnk細胞進行共培養(yǎng)24小時。使用cd56及cd3分別分離nk-car及靶細胞群體藉由流式細胞術定量靶群體。盡管spt-1是異源性細胞群體，但表達cd3+之廣泛群體仍被cd3nk-car所消除。b：pt4(未分類之ptcl)病患細胞是cd3+cd7-并以指示之e:t(效應細胞:靶細胞)細胞比率與cd3carnk細胞進行共培養(yǎng)24小時。閘控靶群體并定量，如圖式中所示。pt4白血病細胞分為cd3+cd7-類型并被cd3carnk細胞有效消除。cd3+廣泛群體亦受cd3carnk細胞影響。

圖37：cd3carnk細胞如預期可溶解正常t細胞。正常t細胞分離自臍帶血并經(jīng)表達gfp之慢病毒轉(zhuǎn)導。該等經(jīng)轉(zhuǎn)導之gfpt細胞用與cd3carnk細胞進行共培養(yǎng)。共培養(yǎng)條件是于具有2.5%血清之nk細胞培養(yǎng)基中進行。共培養(yǎng)物培養(yǎng)24小時并經(jīng)標記以用于流式細胞術分析。藉由比較共培養(yǎng)后殘留之cd3+gfpt細胞之數(shù)量評估cd3carnk細胞溶解靶t細胞之能力。重要地，隨培養(yǎng)時間增加，靶cd3+gfpt細胞顯示在5:1效應細胞對靶細胞比率之劑量下以超過80%之效率被溶解。

圖38：cd3carnk細胞展示活體內(nèi)深度抗白血病效應。a：nsg小鼠經(jīng)亞致死量照射24小時后，靜脈內(nèi)注射1x10⁶個表現(xiàn)螢光素酶之jurkat細胞(第0天)以誘導可測量之腫瘤形成。在第3及第4天，對小鼠每天靜脈內(nèi)注射5x10⁶個cd3carnk細胞或載體對照組nk細胞。在第6及第7天重復此等注射，并在第10天再次注射，總計每只小鼠注射2.5x10⁷個細胞。(a)在第4、7、9及13天，對小鼠皮下注射redijectd-螢光素并經(jīng)受ivis成像。b：比較注射cd3carnk之小鼠之平均光強度與注射載體對照組nk細胞之小鼠之平均光強度。c：經(jīng)cd3carnk細胞處理之小鼠相對于對照組之腫瘤細胞殺傷率。

圖39：用于產(chǎn)生靶向t細胞淋巴瘤或t細胞白血病之cart或nk細胞之步驟。

圖40：以chopchop設計之三對sgrna之基因，以靶向cd2、cd3、cd5及cd7。以chopchop設計三對sgrna以靶向指定之基因。將特定之基因sgrna選殖至表達經(jīng)e2a自裂解連接子連接之人類cas9及嘌呤霉素(puromycin)抗性基因之慢病毒載體(lentiu6-sgrnasffv-cas9-puro-wpre)中。該u6-sgrna基因盒位于cas9元件前面。sgrna及cas9puro之表達是分別藉由u6啟動子及sffv啟動子驅(qū)動。

圖41：使用crispr/cas9慢病毒系統(tǒng)產(chǎn)生穩(wěn)定之cd5缺乏型ccrf-cem及molt-4t細胞。a：流式細胞術分析證實使用兩種不同sgrna(lenti-u6-sgcd5a-sffvcas9puro(sgcd5a)及l(fā)enti-u6-sgcd5b-sffv-cas9puro(sgcd5b))后之有crispr/cas9kd之ccrf-cemt細胞在嘌呤霉素選擇后失去cd5表達。野生型對照組見于左側(cè)大部分散點圖中。因為使用sgrnacd5a之crispr/cas9kd技術在cd5蛋白下調(diào)中更成功，所以選擇此群體(藉由籃圈及箭頭指示)以進行圖41b中之分選、純化及分析。b：流式細胞術分析資料指示使用sccd5acrispr/cas9技術轉(zhuǎn)導之純分選穩(wěn)定之cd5陰性ccrf-cem細胞之百分率。吾人注意到>99%純度之cd45陽性、cd5陰性ccrfsgcd5at細胞。c：流式細胞術分析證實具有使用兩種不同sgrna序列(序列cd5a及cd5b，中間欄及右欄)之crispr/cas9kd之molt-4t細胞在嘌呤霉素處理后失去cd5表達。野生型對照組見于左側(cè)大部分散點圖中。因為具有引子cd5a之crispr/cas9kd技術在cd5蛋白下調(diào)中更成功，所以選擇此群體(藉由籃圈及箭頭指示)以進行圖4d中之分選、純化及分析。d：流式細胞術分析資料指示使用sccd5acrispr/cas9技術轉(zhuǎn)導之純分選穩(wěn)定之cd5陰性molt-4細胞之百分率。吾人注意到>99%純度之cd45陽性、cd5陰性molt-4sgcd5at細胞。

圖42：使用crispr/cas9慢病毒系統(tǒng)產(chǎn)生并細胞分選于ccrfcem細胞或nk-92細胞中之穩(wěn)定cd7損失。使用cd45及cd7抗體并藉由流式細胞術分析在嘌呤霉素處理后測定使用sgcd7a(lenti-u6-sgcd7a-sffv-cas9-puro)及sgcd7b(lenti-u6-sgcd7b-sffv-cas9-puro)之ccrf-cem(圖42a及b)或nk-92(圖42c及d)中之cd7損失百分率。嵌入于圖式中之數(shù)值顯示陽性及陰性表達cd45或cd7之百分率。右方格指示經(jīng)分選之穩(wěn)定cd7陰性細胞于制備自使用sgcd7a或sgcd7dcrispr慢病毒轉(zhuǎn)導之cd7陰性細胞之ccrf-cem(b)或nk-92細胞(d)中之純度百分率。

圖43：cd7carnk7--92細胞有效溶解表達cd7之t細胞all細胞系t細胞。為避免自殺，產(chǎn)生cd7缺乏型nk-92(nk7--92)細胞并經(jīng)cd7car轉(zhuǎn)導。用兩種經(jīng)轉(zhuǎn)導之cd7carnk7--92細胞#a及#b測試其等殺傷力。a：ccrf-cem細胞單獨(左欄)、與gfpnk-92細胞共培養(yǎng)(中間欄)及與cd7car-nk-92-細胞#a及b#共培養(yǎng)(右欄)之流式細胞術分析。b：獲得自a之資料之條形圖。

圖44：cd3多亞基蛋白質(zhì)復合體。cd3包含蛋白復合體且由上圖中描述之四條不同鏈構(gòu)成。該復合體包含cd3δ鏈、cd3γ鏈及兩個cd3ε鏈。此等鏈與由αβ鏈構(gòu)成之t細胞受體(tcr)結(jié)合。

【詳細說明】

本發(fā)明提供嵌合抗原受體(car)組合物，其制造方法及使用該等car組合物之方法。

組合物

嵌合抗原受體多肽

在一個實施例中，本發(fā)明提供具有訊息肽、抗原識別域、鉸鏈區(qū)、跨膜域、至少一個共刺激域及傳訊域之嵌合抗原受體(car)多肽。

如本文使用，術語「肽」、「多肽」及「蛋白」可交換使用，且是指具有藉由肽鍵共價連接之胺基酸殘基之化合物。蛋白或肽必須含有至少兩個胺基酸且包括蛋白之序列或肽之序列，沒有最大氨基酸數(shù)量限制。多肽包括具有兩個或更多個藉由肽鍵彼此連接之胺基酸之任何肽或蛋白。如本文使用，該術語是指短鏈，其在此項技術中通常亦稱為(例如)肽、寡肽及寡聚物；及長鏈，其在此項技術中通常亦稱為蛋白(其等具有許多類型)?！付嚯摹拱?例如)生物活性片段、大體上同源多肽、寡肽、同源二聚體、異二聚體、多肽之變體、經(jīng)改性之多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。該等多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。

「訊息肽」包括引導細胞內(nèi)之肽及任何結(jié)合之多肽運輸及定位至例如某一細胞胞器(諸如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)))及/或細胞表面之肽序列。

該訊息肽是引導本發(fā)明之多肽運輸至細胞膜及細胞表面并提供本發(fā)明之多肽之正確定位之任何分泌或跨膜蛋白之肽。特定言之，本發(fā)明之訊息肽將本發(fā)明之多肽引導至細胞膜，其中該多肽之細胞外部分顯示于細胞表面上，跨膜部分跨越質(zhì)膜及活性域是位于細胞質(zhì)部分中或位于細胞之內(nèi)部中。

在一個實施例中，該訊息肽是穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)后裂解，即其是可裂解之訊息肽。在一實施例中，該訊息肽是i型、ii型、iii型或iv型人類蛋白。在一實施例中，該訊息肽包括免疫球蛋白重鏈訊息肽。

「抗原識別域」包括對靶抗原、靶受體、靶肽配體或靶蛋白配體、或靶多肽具有選擇性之多肽。

靶針對性抗原識別域較佳包括自抗靶抗原之抗體；或結(jié)合靶抗原之肽；或結(jié)合結(jié)合靶抗原之抗體之肽或蛋白；或結(jié)合靶上之受體之肽或蛋白配體(包括但不限于生長因子、細胞介素或激素)衍生之抗原結(jié)合域；或衍生自結(jié)合靶上之肽或蛋白配體之受體(包括但不限于生長因子受體、細胞介素受體或激素受體)之域。該靶包括cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52。在另一實施例中，該靶包括cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52之任何部分。在一個實施例中，該靶包括cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52多肽之表面曝露部分。

在另一實施例中，該靶是cd2之細胞外域(seqidno.19)。在另一實施例中，該靶是cd3ε鏈細胞外域(seqidno.20)。在另一實施例中，該靶是cd4細胞外域(seqidno.21)。在另一實施例中，該靶是cd5細胞外域(seqidno.22)。在另一實施例中，該靶是cd7細胞外域(seqidno.23)。在另一實施例中，該靶是cd8α鏈細胞外域(seqidno.24)。在另一實施例中，該靶是cd8β鏈細胞外域(seq

idno.25)。在另一實施例中，該靶是cd52campath-1抗原(seqidno.26)。

在一個實施例中，該抗原識別域包括針對該靶(對該靶具有選擇性)之單株或多株抗體之結(jié)合部分或可變區(qū)。

在一個實施例中，該抗原識別域包括片段抗原-結(jié)合片段(fab)。在另一實施例中，該抗原識別域包括單鏈可變片段(scfv)。scfv是免疫球蛋白之重鏈(vh)及輕鏈(vl)之可變區(qū)經(jīng)短連接子肽連接而成之融合蛋白。

在另一實施例中，該抗原識別域包括駱駝科單域抗體或其部分。在一個實施例中，駱駝科單域抗體包括發(fā)現(xiàn)于駱駝科中之重鏈抗體或vhh抗體。駱駝科(例如駱駝、單峰駱駝、駱馬及駝羊)之vhh抗體是指駱駝科單鏈抗體之可變片段(參見nguyen等人，2001；muyldermans,2001)，且亦包括駱駝科之經(jīng)分離之vhh抗體、駱駝科之重組vhh抗體或駱駝科之合成vhh抗體。

在另一實施例中，該抗原識別域包括接合其等同源受體之配體。在另一實施例中，該抗原識別域是人類化。

該抗原識別域可于其序列中包括一些可變性且仍對本文揭示之靶具有選擇性。因此，預期該抗原識別域之多肽可與本文揭示之抗原識別域多肽具有至少95%、至少90%、至少80%或至少70%一致性并仍對本文描述之靶具有選擇性，且在本發(fā)明之范圍內(nèi)。

在另一實施例中，該抗原識別域?qū)eqidno.19、seqidno.20、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24或seqidno.25或seqidno.26具有選擇性。

該鉸鏈區(qū)定位于例如(包括但不限于)嵌合抗原受體與至少一個共刺激域及傳訊域之間之序列。該鉸鏈序列可獲得(包括，例如)自任何屬(包括人類)之任何合弁之序列或其一部分。此類鉸鏈區(qū)在此項技術領域中已知。在一個實施例中，該鉸鏈區(qū)包括人類蛋白之鉸鏈區(qū)，包括cd-8α、cd28、4-1bb、ox40、cd3-ζ、t細胞受體α或β鏈、cd3ζ鏈、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、icos、cd154、其功能性衍生物及其組合。

在一個實施例中，該鉸鏈區(qū)包括cd8鉸鏈區(qū)。

在一些實施例中，該鉸鏈區(qū)包括選自(但不限于)免疫球蛋白(例如，igg1、igg2、igg3、igg4及igd)之鉸鏈區(qū)。

該跨膜域包括跨越細胞膜之疏水性多肽。特定言之，該跨膜域自細胞膜之一側(cè)(細胞外)跨越通到該細胞膜之另一側(cè)(細胞內(nèi)或細胞質(zhì))。

該跨膜域可為α螺旋或β桶或其組合之形式。該跨膜域可包括異地同型蛋白(polytopicprotein)，其具有許多跨膜區(qū)段，各α螺旋、β片或其組合。

在一個實施例中，使用天然與car中之域中之一者結(jié)合之跨膜域。在另一實施例中，該跨膜域可藉由胺基酸取代加以選擇或改性以避免此類域結(jié)合至相同或不同表面膜蛋白之跨膜域使得與受體復合體之其他成員之相互作用最小化。

例如，跨膜域包括t細胞受體α或β鏈、cd3ζ鏈、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、icos、cd154、其功能性衍生物及其組合之跨膜域。

人造設計之跨膜域主要包含疏水性殘基(諸如白胺酸及纈胺酸)之多肽。在一個實施例中，苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸三聯(lián)體發(fā)現(xiàn)于合成跨膜域之各端。

在一個實施例中，該跨膜域是cd8跨膜域。在另一實施例中，該跨膜域是cd28跨膜域。此類跨膜域在此項技術領域中已知。

傳訊域及共刺激域包括提供免疫細胞之活化以刺激或活化免疫細胞傳訊路徑之至少一些態(tài)樣之多肽。

在一實施例中，該傳訊域包括cd3ζ、常見fcrγ(fcer1g)、fcγrlla、fcrβ(fcεrib)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd79a、cd79b、dnax活化蛋白10(dap10)、dnax活化蛋白12(dap12)、其活性片段、其功能性衍生物及其組合之功能性傳訊域之多肽。此類傳訊域在此項技術領域中已知。

在一實施例中，該car多肽進一步包含一或多個共刺激域。在一實施例中，該共刺激域來自蛋白之功能性傳訊域，該蛋白包括ox40、cd27、cd28、cd30、cd40、pd-1、cd2、cd7、cd258、自然殺手組2成員c(nkg2c)、自然殺手組2成員d(nkg2d)、b7-h3、結(jié)合至cd83之配體、icam-1、lfa-1(cdlla/cd18)、icos及4-1bb(cd137)、其活性片段、其功能性衍生物及其組合。

在一個實施例中，該car多肽是cd2car，且包括seqidno.10或seqidno.11。在一個實施例中，該car多肽是cd3car且包括seqidno.12。在一個實施例中，該car多肽是cd4car且包括seqidno.13或seqidno.14。在一個實施例中，該car多肽是cd5car且包括seqidno.15。在一個實施例中，該car多肽是cd7car且包括seqidno.17。在一個實施例中，該car多肽是cd52car且包括seqidno.18。

編碼嵌合抗原受體之多核苷酸

本發(fā)明進一步提供上述嵌合抗原受體多肽編碼多核苷酸。編碼該car之多核苷酸易于藉由任何習知方法自指定car之胺基酸序列來制備。編碼胺基酸序列之基礎序列可自各域之胺基酸序列之上述ncbirefseqid或基因庫之登錄號獲得，且本發(fā)明之核酸可使用標準分子生物學及/或化學程序來制備。例如，基于基礎序列，可合成多核苷酸，且本發(fā)明之多核苷酸可藉由組合使用聚合酶鏈反應(pcr)獲得自cdna庫之dna片段來制備。

在一個實施例中，本文揭示之多核苷酸是基因之一部分，或一個表達或克隆盒。

如本文所使用，術語「多核苷酸」定義為核苷酸鏈。多核苷酸包括dna及rna。此外，核酸是核苷酸之聚合物。因此，本文所使用之核酸及多核苷酸是可交換的。熟習此項技術者具有核酸系多核苷酸(其可水解成單體「核苷酸」)之常識。該等單體核苷酸可水解成核苷。如本文所使用，多核苷酸包括(但不限于)藉由此項技術中可得之任何方法獲得之所有核酸序列，該等方法包括(但不限于)重組方法(亦即，使用一般選殖技術及聚合酶鏈反應(pcr)等自重組庫或細胞基因體選殖核酸序列)及藉由合成方法。

在一個實施例中，該多核苷酸包括seqidno.1或seqidno.2之cd2car多核苷酸。在一個實施例中，該多核苷酸包括seqidno.3之cd3car多核苷酸。在一個實施例中，該多核苷酸包括seqidno.4或seqidno.5之cd4car多核苷酸。在一個實施例中，該多核苷酸包括seqidno.6之cd5car多核苷酸。在一個實施例中，該多核苷酸包括seqidno.8之cd7car多核苷酸。在一個實施例中，該多核苷酸包括seqidno.9之cd52car多核苷酸。

多核苷酸載體

可將上述多核苷酸克隆至載體中?！篙d體」包含經(jīng)分離之多核苷酸且可用于將該經(jīng)分離之多核苷酸遞開至細胞內(nèi)部之物質(zhì)組合物。此項技術中已知許多載體，包括(但不限于)線性多核苷酸、與離子或兩親性化合物結(jié)合之多核苷酸、質(zhì)體、噬菌粒(phagemid)、黏粒(cosmid)及病毒。病毒包括噬菌體、噬菌體衍生物。因此，術語「載體」包括自主復制型質(zhì)體或病毒。此術語亦應視為包括促進核酸轉(zhuǎn)移至細胞中之非質(zhì)體及非病毒化合物，諸如聚離胺酸化合物、脂質(zhì)體及類似物。病毒載體之實例包括(但不限于)腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體及類似物。

在一個實施例中，載體包括選殖載體、表達載體、復制載體、探針形成載體、整合載體及定序載體。

在一實施例中，該載體是病毒載體。在一實施例中，該病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體。在一實施例中，該經(jīng)改造之細胞是經(jīng)病毒轉(zhuǎn)導以表達該多核苷酸序列。

許多機遇病毒之系統(tǒng)已開發(fā)且針對將基因轉(zhuǎn)移至哺乳動物細胞中。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒為基因遞開系統(tǒng)提供便捷平臺。所選定之基因可使用此項技術中已知的技術插入載體中并封裝于逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子中。該重組病毒可隨后經(jīng)分離并活體內(nèi)或活體外遞開至個體之細胞中。此項技術中已知許多逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)。在一些實施例中，使用腺病毒載體。此項技術領域中已知許多腺病毒載體。在一個實施例中，使用慢病毒載體。

病毒載體技術在此項技術領域中與被熟知并描述(例如)于sambrook等人，(2001,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)及其他病毒學及分子生物手冊中。適用作載體之病毒包括(但不限于)逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒及慢病毒。一般而言，合適之載體含有至少一個有機體中之復制功能起源、啟動子序列、習知之限制性核酸內(nèi)切酶位點及一或多個可選擇之標記物(例如，wo01/96584；wo01/29058及美國專利案第6,326,193號)。

嵌合抗原受體多核苷酸之表達可使用(例如)表現(xiàn)載體來達成，該等表現(xiàn)載體包括(但不限于)sffv或人類延長因子11α(ef)啟動子、cag(具有cmv強化子之雞β-肌動蛋白啟動子)啟動子人類延長因子1α(ef)啟動子中之至少一者。利用之強度較小/表達較弱之啟動子之實例可包括(但不限于)猴病毒40(sv40)早期啟動子、細胞巨大病毒(cmv)即時早期啟動子、泛蛋白c(ubc)啟動子及磷酸甘油酸激酶1(pgk)啟動子或其一部分。嵌合抗原受體之可誘導型表達可使用(例如)四環(huán)素反應性啟動子來達成，該四環(huán)素反應性啟動子包括(但不限于)tre3gv(tet-反應元件，包括所有代且較佳是第3代)、可誘導型啟動子(clontechlaboratories,mountainview,ca)或其一部分或組合。

合適之啟動子之一個實例是即時早期細胞巨大病毒(cmv)啟動子序列。此啟動子序列是強組成性啟動子序列，其可操作地連接至其之任何多核苷酸序列以達到高表達程度。合適之啟動子之另一實例是延長生長因子-1a(ef-1a)。然而，亦可使用其他組成性啟動子序列，其等包括(但不限于)猴病毒40(sv40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(mmtv)、人類免疫缺陷病毒(hiv)長端重復(ltr)啟動子、momulv啟動子、禽類白血病病毒啟動子、epstein-barr(艾司坦氏-巴爾氏)病毒即時早期啟動子、勞斯(rous)肉瘤病毒啟動子及人類基因啟動子諸如(但不限于)肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子及肌胺酸激酶啟動子。此外，本發(fā)明應不限于使用組成性啟動子，可誘導型啟動子亦應視為本發(fā)明之一部分?？烧T導型啟動子之使用提供分子開關，其當需要此種表達時可開啟可操作連接之多核苷酸序列之表達或當無需表達時關閉表達?？烧T導型啟動子之實例包括(但不限于)金屬硫蛋白(metallothionein)啟動子、糖皮質(zhì)素啟動子、孕酮啟動子及四環(huán)素啟動子。

「表達載體」是指包含重組多核苷酸之載體，該重組多核苷酸包含可操作地連接至待表達之核苷酸序列之表達對照序列。表達載體包括用于表達之充分順式作用元件；其他用于表達之元件可藉由宿主細胞提供或提供于活體外表現(xiàn)系統(tǒng)中。表達載體包括所有此項技術中已知者，諸如黏粒、質(zhì)體(例如，裸露或含于脂質(zhì)體中)及合并重組多核苷酸之病毒(例如，慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。

額外之啟動子元件(例如，強化子)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄啟動之頻率。通常，此等啟動子元件位于起始位點上游之30-100bp區(qū)，然而許多啟動子最近已顯示亦于起始位點下游含有功能元件。啟動子元件間之間隔經(jīng)常是可撓性的，使得當胸苷激酶(tk)啟動子中之元件相對于另一元件倒轉(zhuǎn)或移動時保留啟動子功能，啟動子元件間之間隔在活性開始減弱后可增加至50bp間隔。取決于啟動子，個別元件似乎可合作或獨立地發(fā)揮作用以活化轉(zhuǎn)錄。

為評定car多肽或其部分之表達，待引入細胞中之表現(xiàn)載體亦可含有可選擇之標記物基因或報導基因或兩者以促進自力求透過病毒載體轉(zhuǎn)染或感染之細胞群體中識別并選擇表達細胞，在其他態(tài)樣中，該等可選擇之標記物可攜載于獨立的dna片段上且用于共轉(zhuǎn)染程序中?？蛇x擇之標記物及報導基因均可位于弁當之調(diào)節(jié)序列之側(cè)面以實現(xiàn)于宿主細胞中之表達。適用之可選擇之標記物包括(例如)抗生素抗藥基因，諸如neo及類似物。

報導基因用于識別潛在經(jīng)轉(zhuǎn)染之細胞及評估調(diào)節(jié)序列之功能性。一般而言，報導基因是不存在于接受者有機體或組織中或非由接受者有機體或組織表現(xiàn)且編碼多肽之基因，該多肽之表達藉由一些可容易偵測之性質(zhì)(例如，酵素活性)顯示。報導基因之表達在已將dna引入接受者細胞中后之合弁之時間下加以分析。合弁之報導基因可包括編碼以下各物之基因：螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙醯基轉(zhuǎn)移酶、分泌之堿性磷酸酶或綠螢光蛋白基因(例如，ui-tei等人，2000febsletters479:79-82)。合適之表現(xiàn)系統(tǒng)是熟知且可使用已知技術制得或購買獲得。一般而言，將具有顯示報導基因之最高表達程度之最小5'側(cè)翼區(qū)之構(gòu)筑體識別為啟動子。此類啟動子區(qū)可連接至報導基因并用以評估藥劑調(diào)節(jié)由啟動子驅(qū)動之轉(zhuǎn)錄之能力。

此項技術領域中已知將基因引入細胞中并于該細胞中表達該等基因之方法。在表現(xiàn)載體之內(nèi)文中，該載體可藉由此項技術中之任何方法容易引入宿主細胞例如哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞中。例如，該表現(xiàn)載體可藉由物理、化學或生物方法轉(zhuǎn)移至宿主細胞中。

用于將多核苷酸引入宿主細胞中之物理方法包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔等。用于產(chǎn)生包含載體及/或外源性核酸之細胞之方法是此項技術領域中熟知。參見，例如，sambrook等人(2001,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)。用于將多核苷酸引入宿主細胞中之較佳方法是磷酸鈣轉(zhuǎn)染。

用于將受關注之多核苷酸引入宿主細胞中之生物方法包括使用dna及rna載體。病毒載體及(尤其)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已成為將基因插入哺乳動物(例如，人類細胞)中之最廣泛使用之方法。其他病毒載體可衍生自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒i、腺病毒及腺相關病毒等。參見，例如，美國專利案第5,350,674及5,585,362號。

用于將多核苷酸引入宿主細胞中之化學方法包括膠體分散系統(tǒng)(諸如巨分子復合體、奈米膠囊、微球、珠粒)及基于脂質(zhì)之系統(tǒng)(包括水包油乳液、微胞、混合微胞及脂質(zhì)體)。用作活體外及活體內(nèi)遞開載體之例示性膠體系統(tǒng)是脂質(zhì)體(例如，人造膜囊泡)。在其中利用非病毒遞開系統(tǒng)之情況下，例示性遞開載體是脂質(zhì)體。脂質(zhì)調(diào)配物之使用預期用于將核酸(活體外(invitro)、離體(exvivo)或活體內(nèi)(invivo))引入宿主細胞中。在另一態(tài)樣中，該核酸可與脂質(zhì)結(jié)合。與脂質(zhì)結(jié)合之核酸可囊封于脂質(zhì)體之水性內(nèi)部中；散布于脂質(zhì)體之脂質(zhì)雙層中；經(jīng)由與脂質(zhì)體及寡核苷酸兩者結(jié)合之連接分子結(jié)合至脂質(zhì)體；包埋于脂質(zhì)體中；與脂質(zhì)體錯合；分散于含有脂質(zhì)之溶液中；與脂質(zhì)混合；與脂質(zhì)組合；作為懸浮液含于脂質(zhì)中；含于微胞中或與微胞復合；或與脂質(zhì)結(jié)合的其他形式。脂質(zhì)、脂質(zhì)/dna或脂質(zhì)/表現(xiàn)載體結(jié)合組合物不限于溶液中之任何特定結(jié)構(gòu)。例如，其等可作為微胞存在于雙層結(jié)構(gòu)中，或具有「塌陷」結(jié)構(gòu)。其等亦可簡單地散布于溶液中，可能形成尺寸或形狀不均勻之聚集物。脂質(zhì)是脂肪物質(zhì)，該等脂肪物質(zhì)是天然生成或合成之脂質(zhì)。例如，脂質(zhì)包括天然生成于細胞質(zhì)中之脂肪小滴及含有長鏈脂族烴及其等衍生物(諸如脂肪酸、醇、胺、胺醇及醛)之化合物類別。

適用之脂質(zhì)可獲得自商業(yè)來源。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(「dmpc」)可獲得自sigma,st.louis,mo；磷酸二鯨蠟脂(「dcp」)可獲得自k&klaboratories(plainview,ny)；膽固醇(「choi」)可獲得自calbiochem-behring；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(「dmpg」)及其他脂質(zhì)可獲得自avantipolarlipids,inc.(birmingham,al)。脂質(zhì)于氯仿或氯仿/甲醇中之原液可儲存在約-20℃下。氯仿僅用作溶劑，因為其相較于甲醇更容易蒸發(fā)。

「脂質(zhì)體」是通用術語，其涵蓋各種藉由產(chǎn)生密閉脂質(zhì)雙層或聚集物所形成之單層及多層脂質(zhì)載體。脂質(zhì)體可表征為具有囊泡結(jié)構(gòu)，該等囊泡結(jié)構(gòu)具有磷脂雙層膜及內(nèi)部水性介質(zhì)。多層脂質(zhì)體具有多個藉由水性介質(zhì)分離之脂質(zhì)層。其等在磷脂懸浮于過量水溶液中時自發(fā)形成。該等脂質(zhì)組分在形成密閉結(jié)構(gòu)前經(jīng)歷自重排并將水及溶解的溶質(zhì)捕獲于脂質(zhì)雙層之間(ghosh等人，191glycobiology5;505-10)。然而，亦涵蓋于溶液中具有結(jié)構(gòu)不同于正常囊泡結(jié)構(gòu)之組合物。例如，該等脂質(zhì)可假定微胞結(jié)構(gòu)或僅作為脂質(zhì)分子之不均勻聚集物存在。亦預期脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(lipofectamine)-核酸復合體。

無論使用何種方法將外源性多核苷酸引入宿主細胞中或另外使細胞曝露于本發(fā)明之多核苷酸，為證實重組dna序列存在于宿主細胞中，可進行各種分析。此類分析包括(例如)熟習此項技術者熟知的「分子生物學」分析，諸如印跡雜交法及蛋白印跡法、rt-pcr及pcr；「生物化學」分析，諸如(例如)藉由免疫學方法(ellsa及蛋白印跡法)或藉由本文描述之分析識別落于本發(fā)明之范圍內(nèi)之藥劑而偵測特定肽之存在或缺乏。

經(jīng)改造之細胞

在另一實施例中，本發(fā)明提供經(jīng)改造之細胞，其表達上述嵌合抗原受體多肽或表達編碼該等嵌合抗原受體多肽之多核苷酸，且如上文描述。

「經(jīng)改造之細胞」意謂任何有機體之藉由添加或改性基因、dna或rna序列或蛋白或多肽而經(jīng)改性、轉(zhuǎn)形或操作之任何細胞。本發(fā)明之經(jīng)分離之細胞、宿主細胞及經(jīng)基因改造之細胞包括經(jīng)分離之免疫細胞，諸如含有編碼嵌合抗原受體或嵌合抗原受體復合體之dna或rna序列且于細胞表面上表達該嵌合受體之nk細胞及t細胞。經(jīng)分離之宿主細胞及經(jīng)改造之細胞可用于例如增強nk細胞活性或t淋巴細胞活性；治療癌癥；及治療傳染病。

可使用任何可表達如本文揭示之嵌合抗原受體多肽及/或可將如本文揭示之嵌合抗原受體多肽整合于細胞膜中之細胞。

在一實施例中，該經(jīng)改造之細胞包括免疫調(diào)節(jié)細胞。免疫調(diào)節(jié)細胞包括t細胞，諸如cd4t細胞(輔助性t細胞)、cd8t細胞(細胞毒性t細胞，ctl)及記憶t細胞或記憶干細胞t細胞。在另一實施例中，t細胞包括自然殺手t細胞(nkt細胞)。

在一實施例中，該經(jīng)改造之細胞包括自然殺手細胞。自然殺手細胞在此項技術領域中被熟知。在一個實施例中，自然殺手細胞包括細胞系，諸如nk-92細胞。nk細胞系之其他實例包括nkg、yt、nkys、hank-1、yts細胞及nkl細胞。

nk細胞介導抗腫瘤效應而無gvhd之風險且相較于t細胞存活期較短。因此，nk細胞在破壞癌細胞后將立即耗盡，從而降低消除經(jīng)改性之細胞之car構(gòu)筑體對可誘導型自殺基因之需求。

在一個實施例中，該經(jīng)改造之細胞可包括多于一種類型之本文描述之嵌合抗原受體多肽。已預期其中該經(jīng)改造之細胞包括cd2car、cd3car、cd4car、cd5car、cd7car、cd8car及cd52car中之至少兩者之實施例。例如，該經(jīng)改造之細胞可包括cd4嵌合抗原受體多肽(cd4car)及cd5嵌合抗原受體多肽(cd5car)。

如本文使用，cdxcar是指具有cdx抗原識別域之嵌合抗原受體。如本文使用之cdx可為cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52中之任何一者。

用于攜載car之tcr缺乏型t細胞

在一個實施例中，經(jīng)改造之細胞(特定言之，獲得自供體之同種異體t細胞)可經(jīng)改性以使涉及mhc識別之tcr(t細胞受體)之組分不活化(inactivate)。因此，tcr缺乏型t細胞將不引起移植物抗宿主疾病(gvhd)。

t-抗原缺乏型t及nk細胞

t細胞淋巴瘤或t細胞白血病表達特定的抗原，該等特定抗原可作為此等疾病之有用靶。例如，t細胞淋巴瘤或白血病表達cd7、cd2、cd3及cd5。然而，cd7、cd2、cd3及cd5亦表達于cart或nk細胞(除cd3及cd5外)中，此抵消其等靶向此等抗原之能力。自殺可發(fā)生于具有靶向任一此等抗原之car之t細胞或nk細胞中。此使得難以產(chǎn)生靶向此等抗原之car。因此，當t或nk細胞作為裝備car之目標使用時，可能需要使t或nk細胞中之內(nèi)源性抗原不活化。

在另一實施例中，該經(jīng)改造之細胞經(jīng)進一步改性以使細胞表面多肽不活化以防止經(jīng)改造之細胞作用于其他經(jīng)改造之細胞。例如，該等經(jīng)改造之細胞之內(nèi)源性cd2、cd3、cd4、cd5及cd7基因中之一或多者可經(jīng)敲除或不活化。在一較佳實施例中，該經(jīng)改造之細胞系具有經(jīng)抑制或不活化之內(nèi)源性cd2及cd7基因中之至少一者之自然殺手細胞。

在另一較佳實施例中，該經(jīng)改造之細胞系具有經(jīng)抑制或不活化之內(nèi)源性cd2、cd3、cd4、cd5、cd7及cd8基因中之至少一者之t細胞。在另一較佳實施例中，該經(jīng)改造之細胞具有經(jīng)敲除或不活化之內(nèi)源性cd2及cd7基因中之至少一者之nk細胞。

在一個實施例中，表達具有特定抗原識別域之car之經(jīng)改造之細胞中表達該抗原之基因已經(jīng)不活化或敲除。例如，具有cd2car之t細胞將具有經(jīng)不活化或敲除之cd2抗原基因。在另一實施例中，具有含cd4抗原識別域之car之經(jīng)改造之細胞(例如，nk細胞或t細胞)將經(jīng)改性使得該cd4抗原不表達于其細胞表面上。在另一實施例中，具有一個含cd2抗原識別域之car及另一個含cd7抗原識別域之car之經(jīng)改造之細胞(例如，nk細胞或t細胞)中該cd2抗原基因及該cd7抗原基因兩者可已經(jīng)敲除或不活化。

敲除基因或使基因不活化之方法在此項技術領域中眾所周知。例如，可使用

crispr/cas9系統(tǒng)、鋅指核酸酶(zfn)及tale核酸酶(talen)且大范圍核酸酶以敲

除經(jīng)改造之細胞之cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52基因或使其不活化。

細胞源

該等經(jīng)改造之細胞可獲得自外周血、臍帶血、骨髓、腫瘤浸潤淋巴細胞、淋巴結(jié)組織或胸腺組織。該等宿主細胞可包括胎盤細胞、胚胎干細胞、誘導多能干細胞或造血干細胞。該等細胞可獲得自人類、猴、黑猩猩、狗、貓、小鼠、大鼠及其基因轉(zhuǎn)殖物種。該等細胞可獲得自既定細胞系。

上述細胞可藉由任何習知方法獲得。該等細胞可與經(jīng)改造之細胞之接受者自體的、同基因的、同種異體的或異種基因的。

術語「自體」是指衍生自同一個體之任何材料，該材料稍后重新引入至該個體中。

術語「同種異體」是指衍生自與其中引入材料之個體屬于相同物種之不同動物之任何材料。當一或多個基因座上之基因不同時，認為兩個或更多個個體彼此是同種異體的。在一些態(tài)樣中，來自相同物種之個體之同種異體材料可為基因不同至足以抗原性相互作用。

術語「異種基因」是指衍生自不同物種之動物之移植物。

術語「同基因」是指尤其關于抗原或免疫反應極為接近之基因相似性或一致性。同基因系統(tǒng)包括(例如)其中器官及細胞(例如，癌細胞及其等非癌對應物)來自相同個體之模型及/或其中器官及細胞來自具有相同近親株之不同個體動物之模型。

自殺系統(tǒng)

本發(fā)明之經(jīng)改造之細胞亦可包含自殺系統(tǒng)。自殺系統(tǒng)提供可使上述經(jīng)改造之細胞去活化(deactivated)或被破壞之機制。此種特征容許對其中使用該等經(jīng)改造之細胞之任何治療進行精確之治療控制。如本文使用，自殺系統(tǒng)提供可使具有該自殺系統(tǒng)之細胞去活化或被破壞之機制。自殺系統(tǒng)在此項技術領域中已被熟知。

在一個實施例中，自殺系統(tǒng)包含如需要可經(jīng)藥理學活化以消除所含細胞之基因。在特定態(tài)樣中，該自殺基因?qū)哂卸嗪塑账峄蚣毎拗鞑划a(chǎn)生免疫原性。在一個實例中，該自殺系統(tǒng)包含使cd20表達于經(jīng)改造之細胞之細胞表面上之基因。因此，可使用利妥昔單抗(rituximab)之投與以破壞含有該基因之經(jīng)改造之細胞。

在一些實施例中，該自殺系統(tǒng)包含抗原決定基標簽。抗原決定基標簽之實例包括c-myc標簽、鏈霉親和素-結(jié)合肽(sbp)及截短egfr基因(egfrt)。在此實施例中，該抗原決定基標簽表達于經(jīng)改造之細胞中。因此，可使用抗抗原決定基標簽之抗體之投與以破壞含有該基因之經(jīng)改造之細胞。

在另一實施例中，該自殺系統(tǒng)包含使截短表皮生長因子受體表達于經(jīng)改造之細胞之表面上之基因。因此，可使用西妥昔單抗(cetuximab)之投與以破壞含有該基因之經(jīng)改造之細胞。

在另一實施例中，該自殺基因可包括半胱天冬酶8（caspase8）基因、半胱天冬酶9（caspase9）基因、胸苷激酶、胞嘧啶去胺酶(cd)或細胞色素p450。

其他自殺系統(tǒng)之實例包括彼等由jones等人，(jonesbs、lambls、goldmanf

及distasia(2014)improvingthesafetyofcelltherapyproductsbysuicidegenetransfer.

front.pharmacol.5:254.doi:10.3389/fphar.2014.00254)描述者，其以全文引用之方式并入本文中。

cd2car

cd2黏附分子表達在所有外周血t細胞及自然殺手細胞上但不表達于b淋巴細胞上之細胞表面抗原。cd2之細胞外域含有可介導同源二聚化之類免疫球蛋白域。

cd58(lfa-3)或cd48接合cd2會幫助t細胞黏于抗原呈遞細胞上，并觸發(fā)增強透過t細胞受體對抗原之傳訊之訊息轉(zhuǎn)導路徑。cd2敲除小鼠顯示正常免疫功能，且據(jù)信

cd2之功能與其他t細胞共刺激受體(諸如cd28)之功能相似。

cd2表達在t-all、t細胞淋巴瘤/白血病、急性前骨髓細胞白血病(微粒變體)、全身性肥大細胞增生癥、肥大細胞疾病、胸腺瘤及急性骨髓淋巴瘤(m0)及nk細胞白血病之細胞上。

在一個實施例中，本發(fā)明提供具有對cd2抗原具特異性之抗原識別域之嵌合抗原受體多肽，及表達該嵌合抗原受體多肽之經(jīng)改造之細胞。

在另一實施例中，本發(fā)明提供具有對cd2抗原具特異性之抗原識別域之序列之變體之嵌合抗原受體多肽，及表達該嵌合抗原受體多肽之經(jīng)改造之細胞。

在一個實施例中，該cd2car包含至少一個共刺激域。在另一實施例中，該cd2car包含至少兩個共刺激域。

在一個實施例中，該cd2car包含seqidno.10及seqidno.11。

cd3car

cd3由蛋白復合體組成且由如上圖描述之四條不同鏈構(gòu)成。該復合體含有cd3δ鏈、cd3γ鏈及兩條cd3ε鏈。此等鏈與由αβ鏈構(gòu)成之t細胞受體(tcr)結(jié)合。

該tcr/cd3復合體是t譜系細胞之獨特標記物。已開發(fā)出各種抗此復合體之單株抗體。一種此類單株抗體是抗表面cd3之鼠類單株抗體okt3。cd3是t細胞及t細胞惡性腫瘤之普通標記物?？筩d3ε之okt3是用于識別t細胞之普通抗體。作為治療用的抗cd3單株抗體包括：(1)急性腎、心臟或肝同種異體移植物排斥；(2)來自供體骨髓之t細胞在移植前之損耗；(3)新發(fā)i型糖尿病。抗cd3ε鏈之cd3是用以識別良性及惡性疾病中之t細胞之最具特異性之t細胞抗體。cd3發(fā)現(xiàn)于86%之周圍t細胞淋巴瘤中。

在一些實施例中，本發(fā)明包括一種用于產(chǎn)生cd3car之方法。在其他實施例中，cd3car包括特異性結(jié)合至cd3之表面蛋白之scfv抗體。

在一些實施例中，cd3car包括明確地結(jié)合至tcr/cd3復合體之scfv分子。

在一些實施例中，car中之scfv可為特異性結(jié)合至與cd3結(jié)合之αβtcr之細胞外域之分子。

cd4car

在一個實施例中，本發(fā)明之嵌合抗原受體包括cd4抗原識別域(cd4car)。

在一個實施例中，該cd4car包含至少一個共刺激域。在另一實施例中，該cd4car包含至少兩個共刺激域。

在一個實施例中，cd4car包含seqidno.13及seqidno.14。

cd5car

在另一實施例中，本發(fā)明提供具有明確針對cd5之抗原識別域之嵌合抗原受體多肽，及表達該嵌合抗原受體多肽之經(jīng)改造之細胞。

在一個實施例中，該cd5car包含至少一個共刺激域。在另一實施例中，該cd5car包含至少兩個共刺激域。

cd7car

cd7是跨膜蛋白，其是免疫球蛋白超家族之成員。此蛋白表達于成熟t細胞之表面上。是最早在t細胞譜系細胞上表達之表面抗原。cd7是t-all之極佳標記物且超過90%之t-all表達cd7。

cd7亦表達在nk淋巴瘤、t細胞淋巴瘤/白血病、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病及富含淋巴細胞之胸腺瘤中。

在一個實施例中，本發(fā)明提供具有明確針對cd7之抗原識別域之嵌合抗原受體多肽，及表達該嵌合抗原受體多肽之經(jīng)改造之細胞。

在一個實施例中，該cd7car包含至少一個共刺激域。在另一實施例中，該cd7car包含至少兩個共刺激域。

方法

制造經(jīng)改造之細胞之方法

在一個實施例中，本發(fā)明亦提供用于制造上述經(jīng)改造之細胞之方法。

在此實施例中，上述細胞是獲得或經(jīng)分離。該等細胞可藉由任何已知方法進行分離。該等細胞包括周圍血細胞或臍帶血細胞。在另一實施例中，該等細胞是胎盤細胞、胚胎干細胞、誘導多能干細胞或造血干細胞。

編碼上述嵌合抗原受體多肽之多核苷酸是藉由任何已知方法而引入外周血細胞或臍帶血細胞中。在一個實例中，編碼上述嵌合抗原受體多肽之多核苷酸是借助于病毒載體而引入細胞中。

編碼上述嵌合抗原受體多肽之多核苷酸是藉由任何已知方法而引入胎盤細胞、胚胎干細胞、誘導多能干細胞或造血干細胞中。在一個實例中，編碼上述嵌合抗原受體多肽之多核苷酸是借助于病毒載體而引入細胞中。

在其他實施例中，該嵌合抗原受體多核苷酸可構(gòu)筑成經(jīng)暫態(tài)rna改性之「可生物降解之衍生物」。該經(jīng)rna改性之衍生物可經(jīng)電穿孔引入t細胞或nk細胞中。

在另一實施例中，本文描述之嵌合抗原受體可構(gòu)筑于轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)(亦稱為「睡美人(sleepingbeauty)」)中，該系統(tǒng)將嵌合抗原受體多核苷酸整合于無病毒載體之宿主基因體中。

上述多核苷酸一經(jīng)引入細胞中以提供經(jīng)改造之細胞，則使該等經(jīng)改造之細胞擴增。藉由任何已知方法擴增含有上述多核苷酸之經(jīng)改造之細胞。

該等經(jīng)擴增之細胞是藉由任何已知方法分離以提供本發(fā)明之經(jīng)分離之經(jīng)改造之細胞。

使用方法

本發(fā)明提供殺死免疫調(diào)節(jié)細胞、減少免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量或耗盡免疫調(diào)節(jié)細胞之方法。在另一實施例中，本發(fā)明提供殺死具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52中之至少一者之細胞、減少具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52中之至少一者之細胞之數(shù)量或耗盡具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52中之至少一者之細胞之方法。

如本文使用，「減少數(shù)量」包括減少至少5%、至少10%、至少25%、至少50%、至少75%、至少80%、至少90%、至少99%或100%。

如本文使用，「耗盡」包括減少至少75%、至少80%、至少90%、至少99%或100%。

在一個實施例中，本發(fā)明包括藉由使具有cd2之免疫調(diào)節(jié)細胞與有效量之表達具有cd2抗原識別域之嵌合抗原受體肽之上述經(jīng)改造之細胞接觸而減少該等免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之方法。視需要地，具有cd2之免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之減少可藉由此項技術中已知的任何細胞死亡分析來測定。

如本文使用，該等免疫調(diào)節(jié)細胞可存在于病患中；可存在于細胞培養(yǎng)物中或經(jīng)分離。

如本文使用，「病患」包括哺乳動物。本文參考之哺乳動物可為任何哺乳動物。如本文使用，術語「哺乳動物」是指任何哺乳動物，包括(但不限于)嚙齒目之哺乳動物(諸如小鼠與倉鼠)及兔形目之哺乳動物(諸如兔)。該等哺乳動物可來自食肉目，包括貓科(貓)及犬科(狗)。該等哺乳動物可來自偶蹄目(包括?？?牛)及豬科(豬))或是奇蹄目動物(包括馬科(馬))。該等哺乳動物可為靈長目、類猴目(ceboid)或類猿目(simoid)(猴))或可為類人猿目(人類及猿)。較佳地，該哺乳動物是人類。

在某些實施例中，該病患是0至6月齡、6至12月齡、1至5年齡、5至10年齡、5至12年齡、10至15年齡、15至20年齡、13至19年齡、20至25年齡、25至30年齡、20至65年齡、30至35年齡、35至40年齡、40至45年齡、45至50年齡、50至55年齡、55至60年齡、60至65年齡、65至70年齡、70至75年齡、75至80年齡、80至85年齡、85至90年齡、90至95年齡或95至100年齡之人類。

如本文使用，術語「有效量」及「治療有效量」之經(jīng)改造之細胞意謂足以提供所需治療或生理效應或結(jié)果之量之經(jīng)改造之細胞。此種效應或結(jié)果包括細胞疾病之癥狀之減少或改善。非所欲效應(例如，副作用)有時伴隨所需之治療效應顯示；因此，行醫(yī)者在判定弁當之「有效量」中應平衡潛在利益與潛在風險。所需之精確量將視個體不同而變化，此取決于該個體之物種、年齡及一般情況、投與模式等。因此，可能無法指定精確之「有效量」。然而，任何個別情況下之弁當之「有效量」可由一般技術者使用僅例行實驗判定。通常，該(等)經(jīng)改造之細胞是以一定量且在足以減少靶細胞增生之條件下給定。

在一個實施例中，本發(fā)明包括藉由使具有cd2之免疫調(diào)節(jié)細胞與有效量之表達具有cd2抗原識別域之嵌合抗原受體肽之上述經(jīng)改造之細胞接觸而減少該等免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之方法。視需要地，具有cd2之免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之減少可藉由此項技術中已知的任何細胞死亡分析來測定。

在一個實施例中，本發(fā)明包括藉由使具有cd3之免疫調(diào)節(jié)細胞與有效量之表達具有cd3抗原識別域之嵌合抗原受體肽之上述經(jīng)改造之細胞接觸而減少該等免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之方法。視需要地，具有cd3之免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之減少可藉由此項技術中已知的任何細胞死亡分析來測定。

在一個實施例中，本發(fā)明包括藉由使具有cd4之免疫調(diào)節(jié)細胞與有效量之表達具有cd4抗原識別域之嵌合抗原受體肽之上述經(jīng)改造之細胞接觸而減少該等免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之方法。視需要地，具有cd4之免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之減少可藉由此項技術中已知的任何細胞死亡分析來測定。

在一個實施例中，本發(fā)明包括藉由使具有cd5之免疫調(diào)節(jié)細胞與有效量之表達具有cd5抗原識別域之嵌合抗原受體肽之上述經(jīng)改造之細胞接觸而減少該等免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之方法。視需要地，具有cd5之免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之減少可藉由此項技術中已知的任何細胞死亡分析來測判定。

在一個實施例中，本發(fā)明包括藉由使具有cd7之免疫調(diào)節(jié)細胞與有效量之表達具有cd7抗原識別域之嵌合抗原受體肽之上述經(jīng)改造之細胞接觸而減少該等免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之方法。視需要地，具有cd7之免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之減少可藉由此項技術中已知的任何細胞死亡分析來測定。

在一個實施例中，本發(fā)明包括藉由使具有cd8之免疫調(diào)節(jié)細胞與有效量之表達具有cd8抗原識別域之嵌合抗原受體肽之上述經(jīng)改造之細胞接觸而減少該等免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之方法。視需要地，具有cd8之免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之減少可藉由此項技術中已知的任何細胞死亡分析來測定。

在一個實施例中，本發(fā)明包括藉由使具有cd52之免疫調(diào)節(jié)細胞與有效量之表達具有cd52抗原識別域之嵌合抗原受體肽之上述經(jīng)改造之細胞接觸而減少該等免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之方法。視需要地，具有cd52之免疫調(diào)節(jié)細胞之數(shù)量之減少可藉由此項技術中已知的任何細胞死亡分析來測定。

治療方法

在另一實施例中，本發(fā)明提供用于治療細胞增生性疾病之方法。該方法包括向有此需要之病患投與治療有效量之經(jīng)改造之細胞。

細胞增殖性疾病是癌癥、贅生性疾病或任何涉及失控之細胞增生(例如，形成細胞塊)而彼等細胞不分化成特定不同細胞之疾病中之任何一者。

細胞增生性疾病亦包括惡性或癌前病癥(諸如脊髓發(fā)育不良癥候群或白血病前期或淋巴瘤前期)。

根據(jù)本文揭示之方法，該癌癥可為任何癌癥，包括以下中之任何一者：急性淋巴細胞性癌癥、急性骨髓性白血病、齒槽橫紋肌肉瘤、膀胱癌(bladdercancer)(例如，膀胱癌瘤(bladdercarcinoma))、骨癌、腦癌(例如，神經(jīng)管胚細胞瘤(medulloblastoma))、乳癌、肛門癌、肛管癌或肛門直腸癌、眼癌、肝內(nèi)膽管癌、關節(jié)癌、頸癌、膽囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、陰門癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓癌、結(jié)腸癌、食管癌、宮頸癌、纖維肉瘤、胃腸道類癌腫瘤、頭頸癌(例如，頭頸鱗狀細胞癌)、霍奇金氏淋巴瘤(hodgkinlymphoma)、下咽癌、腎癌、喉癌、白血病、液體腫瘤、肝癌、肺癌(例如，非小細胞肺癌)、淋巴瘤、惡性間皮瘤、肥胖細胞瘤、黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金氏淋巴瘤、b-慢性淋巴性白血病、毛細胞白血病、急性淋巴性白血病(all)、t細胞急性淋巴性白血病及巴氏淋巴瘤(burkitt'slymphoma)、淋巴結(jié)外nk/t細胞淋巴瘤、nk細胞白血病/淋巴瘤、移植后淋巴組織增生性疾病、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、網(wǎng)膜癌及腸系膜癌、咽喉癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、實體腫瘤、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌及輸尿管癌。較佳地，該癌癥是血液惡性腫瘤(例如，白血病或淋巴瘤，包括(但不限于)霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病、急性淋巴細胞性癌癥、急性骨髓性白血病、b-慢性淋巴細胞性白血病、毛細胞白血病、急性淋巴母細胞性白血病(all)及巴氏淋巴瘤)、胸腺癌、彌漫性大細胞淋巴瘤、被套細胞淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤(sll)及慢性類淋巴白血病(cll)、t細胞淋巴瘤及周圍t細胞淋巴瘤。

本發(fā)明提供一種藉由耗盡與cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52相關聯(lián)之t及nk細胞治療急性器官排斥之方法。

在一個實施例中，本發(fā)明包括一種藉由耗盡與cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52中之至少一者相關聯(lián)之t細胞及nk細胞治療急性或慢性移植物抗宿主疾病(gvhd)之方法。

在一個實施例中，本發(fā)明提供一種藉由向已經(jīng)歷器官移植或?qū)⒔?jīng)歷器官移植之病患投與有效量之具有cd3car之經(jīng)改造之細胞而預防器官排斥之方法。

在另一實施例中，本發(fā)明提供一種藉由向有此需要之病患投與有效量之具有cd3car之經(jīng)改造之細胞而預防或治療gvhd之方法。

在一個實施例中，本發(fā)明包括一種針對干細胞移植于活體內(nèi)使用cart或nk細胞以耗盡或減少供體及宿主t或nk細胞之方法。此可藉由在緊接于輸注骨髓干細胞移植物前向病患投與cart或nk細胞而完成。

本發(fā)明提供免疫療法作為調(diào)節(jié)或移植前的過渡治療策略(bridgeto-transplant)或獨立用于治療與cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52中之至少一者相關聯(lián)之細胞增生性疾病之方法。

本發(fā)明提供用于治療與cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52中之至少一者相關聯(lián)之細胞增生性疾病之方法。

在另一實施例中，本發(fā)明提供用于治療與cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52中之至少一者之表達相關聯(lián)之非癌癥相關疾病之方法。

在一些實施例中，用于治療細胞增生性疾病之具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52抗原識別域之car是與查核點阻斷(諸如ctla-4及pd1/pd-l1)組合。此可導致增強之腫瘤根除。

免疫抑制微環(huán)境之存在可限制cart/nk細胞之完整功能。在一些實施例中，cd4car與查核點阻斷(諸如ctla-4及pd1/pd-l1)之組合可導致增強之腫瘤根除。

目前查核點阻斷正在臨床試驗中組合cart細胞進行測試。

在一些實施例中，具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52抗原識別域之car是用作深化、移除、減少、抵抗及/或延長對初始化學療法之反應之策略，或當與其他輔助療法組合時使用。所有可獲得以治療或預防疾病病癥之輔助療法視為本發(fā)明之一部分且在本發(fā)明之范圍內(nèi)。

在一些實施例中，具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52抗原識別域之nk細胞car是「現(xiàn)成(off-the-shelf)」投給任何患有癌癥及/或自體免疫性疾病之哺乳動物。

cd3car

在一些實施例中，攜帶cd3car之nk細胞顯示抗腫瘤免疫力并發(fā)揮殺死表達cd3之白血病/淋巴瘤之療效。

本發(fā)明提供使用cd3carnk細胞刪除或減少骨髓、血液及器官中之異?；驉盒詔細胞之方法。在一些實施例中，cd3陽性惡性腫瘤可包括(但不限于)前驅(qū)物t淋巴性白血病/淋巴瘤、成熟t細胞淋巴瘤/白血病、ebv-陽性t細胞淋巴增生性疾病、成年型t細胞白血病/淋巴瘤、蕈樣真菌病/sezary癥候群、原發(fā)性皮膚cd30-陽性t細胞淋巴增生性疾病、周圍t細胞淋巴瘤(未另外列出)、血管免疫母細胞性t細胞淋巴瘤及廿行性大細胞淋巴瘤。

在一些實施例中，cd3carnk細胞可用于治療不弁合干細胞療法或經(jīng)許多強化化學療法方案但從未達成緩解之t-白血病/淋巴瘤病患。在其他實施例中，cd3carnk細胞可用作用于骨髓移植之調(diào)節(jié)方案之組成或骨髓移植前的過渡治療。

cd4car

在一個實施例中，該具有cd4car之經(jīng)改造之細胞在car之抗原識別域結(jié)合至其相應抗原時顯示抗腫瘤免疫力。在一較佳實施例中，包含該car之cd8t細胞發(fā)揮殺死表達cd4之白血病/淋巴瘤細胞之療效。

本發(fā)明包括用于刪除、減少、治療、預防或消除發(fā)現(xiàn)于包括(但不限于)骨髓、血液及/或器官中之異?；驉盒詔細胞之方法。在一些實施例中，惡性cd4表達細胞存在于患有以下各物之病患中：前驅(qū)物t淋巴母細胞性白血病/淋巴瘤、成熟t細胞淋巴瘤/白血病細胞，諸如(例如)t細胞幼淋巴細胞性白血病、ebv-陽性t細胞淋巴增生性疾病、成年型t細胞白血病/淋巴瘤、蕈樣真菌病/sezary癥候群、原發(fā)性皮膚cd30-陽性t細胞淋巴增生性疾病、周圍t細胞淋巴瘤(未另外列出)、血管免疫母細胞性t細胞淋巴瘤及廿行性大細胞淋巴瘤。

在一些實施例中，cd4car細胞是用于治療不弁合干細胞療法或經(jīng)許多強化化學療法方案但從未達成緩解之病患中之t-白血病/淋巴瘤細胞。

在一些實施例中，cd4car細胞是用于治療表達cd4之急性骨髓單核球性白血病、急性單核母細胞性白血病、單核細胞性白血病及慢性骨髓單核球性白血病。

在一些實施例中，該等cd4cart細胞可于t細胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基中擴增及子群體(諸如中央記憶t細胞或天然t細胞)可經(jīng)分離并用于改善植入。此等細胞可保留并支持記憶t細胞功能，該等功能將使其等成為用于癌癥之長期控制之理想候選者。

免疫抑制微環(huán)境之存在可限制cart/nk細胞之完整功能。在一些實施例中，cd4car與查核點阻斷(諸如ctla-4及pd1/pd-l1)之組合可導致增強之腫瘤根除。

在一些實施例中，cd4car細胞是用作深化、移除、減少、抵抗及/或延長對初始化學療法之反應之策略，或當與其他輔助療法組合時使用。所有可獲得以治療或預防疾病病癥之輔助療法視為本發(fā)明之一部分且在本發(fā)明之范圍內(nèi)?；瘜W療法包括(但不限于)chop(環(huán)磷醯胺、阿霉素(doxorubicin)、長春新堿(vincristine)、強的松(prednisone))、epoch(依托泊苷(etoposide)、長春新堿、阿霉素、環(huán)磷醯胺、強的松)或任何其他多藥物方案。在一較佳實施例中，cd4car細胞是用于治療或預防干細胞移植及/或化學療法后之殘留疾病。

在一個實施例中，包含cd4car之細胞在car之抗原識別域結(jié)合至其相應抗原時顯示免疫調(diào)節(jié)細胞之損耗。例如，包含cd4car之細胞包括(但不限于)cd8t細胞、nk細胞或nk-92細胞中之至少一者。當與cd4輔助性細胞相遇時顯示及/或發(fā)揮對該等cd4輔助性細胞之高效刪除，借此可預防器官移植排斥或可控制或減輕自體免疫性疾病之具有cd4car之任何其他合弁之細胞視為本發(fā)明之一部分且在本發(fā)明之范圍內(nèi)。

此沒有cart細胞中觀察到持續(xù)性car相關副作用之疑慮。在一些實施例中，cd4carnk細胞可在急性或決定性臨床環(huán)境中投給患有自體免疫性疾病之病患以迅速耗盡免疫調(diào)節(jié)細胞(諸如cd4輔助性t細胞)，且借此能夠使或讓新穎或非記憶cd4輔助性t細胞再生。

本發(fā)明包括一種產(chǎn)生cd4car之方法。在一些實施例中，cd4car是使用t細胞產(chǎn)生。在其他實施例中，cd4car是使用nk細胞或nk-92細胞產(chǎn)生，使得其等「現(xiàn)成」投給患有癌癥及/或自體免疫性疾病之任何哺乳動物。在一些實施例中，cd4carnk-92或nk細胞可殺死細胞、減少、耗盡及/或預防特定cd4+t細胞或表達cd4之癌細胞。

在一些實施例中，具有cd4car之高表達程度之cd4carnk-92細胞可使用山羊-抗小鼠fab抗體或其部分藉由流式細胞術來產(chǎn)生。使用任何其他屬產(chǎn)生之任何其他類型之抗體視為本發(fā)明之一部分且在本發(fā)明之范圍內(nèi)。

在一些實施例中，cd4carnk-92細胞可在干細胞移植或化學療法后具有微小殘留疾病時用于一種療法。

在一些實施例中，該cd4car是表達基因或表達匣之一部分。在一較佳實施例中，該表達基因或該表達匣除cd4car外亦可包含輔助基因或抗原決定基標簽或其一部分。該輔助基因可為可誘導型自殺基因或其一部分，包括(但不限于)半胱天冬酶9基因、胸苷激酶、胞嘧啶去胺酶(cd)或細胞色素p45029?！缸詺⒒颉瓜椒ǜ纳苹虔煼ㄖ踩郧覂H當藉由特定化合物或分子活化時殺死細胞。在一些實施例中，該自殺基因是可誘導型并使用二聚化之特定化學誘導物(cid)活化。

在一些實施例中，該輔助標簽是c-myc標簽、截短egfr基因(egfrt)或其一部分或其組合。該輔助標簽可用作非免疫性(nonimmunogenic)選擇工具或用于追蹤標記物。

在一些實施例中，該等表達cd4car之宿主細胞可與一或多種額外治療藥劑一起投給哺乳動物(例如，人類)。在這方面，包含含有cd4car之宿主細胞或載體之組合物可第一投與，且一或多種額外治療藥劑可第二投與，或反之亦然。

本發(fā)明將向哺乳動物投與典型量之表達cd4car之宿主細胞包括在其范圍內(nèi)，該典型量(例如)可在50萬至10億個細胞之范圍內(nèi)。所有子范圍及在上文指示之范圍外之范圍視為本發(fā)明之一部分且在本發(fā)明之范圍內(nèi)。

在一較佳實施例中，使用sffv啟動子以將cd8t細胞重定向至表達cd4之靶細胞及驅(qū)動cd4car表達。在一些實施例中，該car包括功能特性，諸如scfv之細胞外表達及當與表達cd4細胞相遇時發(fā)揮強免疫反應。

在一個實施例中，該包含cd4car之細胞是選自包括細胞毒性t淋巴細胞(ctl)及自然殺手(nk)細胞之群。在一較佳實施例中，該具有car之細胞包括(但不限于)cd8t細胞、nk細胞及nk-92細胞。

在一些實施例中，cd4car可與藥物共軛物(包括dna/核酸共軛物、肽、化學實體及/或小分子)一起使用以提供增強之療效及安全性。

hiv病患中之hiv-1感染控制可使用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法之組合來達成，然而，該病毒載量在中止后增加。再出現(xiàn)之hiv-1來源或儲器是記憶cd4t細胞。在一個實施例中，本發(fā)明之cd4car是用于耗盡記憶cd4t細胞，借此完成用于hiv感染之滅菌治愈。在另一實施例中，該cd4car有助于阻斷hiv病毒進入，而cd4car結(jié)合至cd4蛋白(hiv進入所必需之蛋白)。

因此，本發(fā)明提供一種藉由耗盡cd4t細胞而預防器官移植排斥之方法。該方法包括向有此需要之病患投與治療有效量之具有含cd4抗原識別域之嵌合抗原受體多肽之經(jīng)改造之細胞。

cd5car

在另一實施例中，具有cd5抗原識別域之car多肽(cd5car)是用于治療類風濕性關節(jié)炎。在另一實施例中，cd5car可用于預防骨髓移植療法(bmt)療法后之移植物抗宿主疾病。在另一實施例中，cd5car可在自體免疫性疾病及惡性腫瘤之治療中用于改性cd5表達。

在一些實施例中，本發(fā)明之具有對cd5具有選擇性之嵌合抗原受體之經(jīng)改造之細胞可為彼等不再回應于化學療法或患有微小殘留疾病且不弁合骨髓移植之病患充當骨髓移植之過渡治療。在其他實施例中，cd5car可消除cd5陽性白血病細胞，接著進行骨髓干援助以支持淋巴球減少癥。

在特定實施例中，cd5cart或nk細胞靶向表達cd5之細胞。靶細胞可為(但不限于)癌細胞，諸如t細胞淋巴瘤或t細胞白血病、前驅(qū)物急性t細胞淋巴母細胞性白血病/淋巴瘤、b細胞慢性淋巴細胞性白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤、被套細胞淋巴瘤、cd5陽性彌漫性大b細胞淋巴瘤及胸腺癌。

在一個實施例中，cd5car可用于治療非血液疾病，該等非血液疾病包括(但不限于)類風濕性關節(jié)炎、移植物抗宿主疾病及自體免疫性疾病。

該等經(jīng)改造或經(jīng)改性之t細胞可在il-2或/及il-7及il-15兩者之存在下或使用其他分子進行擴增。

car之引入可在藉由向病患投與前擴增活體外經(jīng)改造之t細胞而使cd5不活化之前或之后來完成。

在特定實施例中，cd5之不活化可藉由下列方法中之任何一者來達成：

(1)在經(jīng)由鉸鏈區(qū)連接至跨膜域之t細胞表面上表達抗cd5scfv。此可導致cd5-陽性

t細胞轉(zhuǎn)化成cd5陰性t細胞。

(2)表達明確地結(jié)合至cd5蛋白或其cd5之陰性調(diào)節(jié)子或其片段或域之抗cd5scfv。

在一些實施例中，抗cd5之scfv(單鏈抗體)是衍生自結(jié)合至細胞內(nèi)cd5之單株或多株抗體且阻礙cd5蛋白運輸至細胞表面。在一較佳實施例中，抗cd5scfv包括er(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))保留序列kdel。當抗cd5scfv細胞內(nèi)表達并保留至er或golgi，其使cd5陷入分泌路徑，此導致阻止cd5本身之細胞表面定位于t細胞中。

在一些實施例中，cd5cart細胞是與免疫調(diào)節(jié)子藥物(諸如(但不限于)ctla-4及pd-1/pd-l1阻斷)或細胞介素(諸如il-2及il12)或群落刺激因子-1受體(csf1r)之抑制劑(諸如fpa008)共投與，此導致更佳治療結(jié)果。

在另一實施例中，本發(fā)明提供一種用于賦予、幫助、增加或促進抗白血病或抗淋巴瘤免疫力之方法。

包括表達car之經(jīng)改造之細胞作為活性成分之治療藥劑可皮內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹腔內(nèi)、鼻內(nèi)、動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、瘤內(nèi)投與或投與至傳入淋巴管中、借由非經(jīng)腸投與(例如，藉由注射或輸注)，然而該投與途徑并無限制。

本發(fā)明之任何方法可進一步包括向個體遞開額外之癌癥療法(諸如外科手術、放射療法、激素療法、化學療法、免疫療法或其組合)之步驟。

化學療法包括(但不限于)chop(環(huán)磷醯胺、阿霉素、長春新堿、強的松)、epoch(依托泊苷、長春新堿、阿霉素、環(huán)磷醯胺、強的松)或任何其他多藥物方案。

在一較佳實施例中，cd54car細胞是用于治療或預防干細胞移植及/或化學療法后之

殘留疾病。

在另一實施例中，本發(fā)明之任何方法可進一步包括抗病毒療法：用于ms病患之西多福韋(cidofovir)及介白素-2、阿糖胞苷(cytarabine)(亦稱為ara-c)或那他珠單抗(natalizumab)治療或用于牛皮癬病患之依法利珠單抗或用于pml病患之其他治療。

在其他態(tài)樣中，本發(fā)明之t細胞可與化學療法、放射療法、免疫抑制劑諸如環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤、胺甲喋呤、麥考酚酸酯(mycophenolate)及fk506、抗體或其他免疫清除藥劑諸如campath、抗cd3抗體或其他抗體療法、細胞毒素、氟達拉濱(fludarabine)、環(huán)孢菌素、fk506、雷帕霉素(rapamycin)、麥考酚酸、類固醇、fr901228、細胞介素及輻射組合用于治療方案中。亦可使用抑制鈣依賴性磷酸酶鈣調(diào)蛋白(phosphatasecalcineurin)(環(huán)孢菌素及fk506)或抑制p70s6激酶(其對由生長因子引起之傳訊(雷帕霉素)而言是重要的)之藥物(liu等人，cell66:807-815,1991；henderson等人，immun.73:316-321,1991；bierer等人，curr.opin.immun.5:763-773,1993)。

在另一態(tài)樣中，本發(fā)明之細胞組合物是結(jié)合(例如，投與前、同時或投與后)骨髓移植、使用化學療法藥劑(諸如氟達拉濱、外束輻射療法(xrt)、環(huán)磷醯胺)或抗體(諸如okt3或campath)之t細胞消除療法向病患投與。在一項態(tài)樣中，本發(fā)明之細胞組合物是在b-細胞消除療法(諸如與cd20反應之藥劑，例如，美羅華(rituxan))后投與。例如，在一個實施例中，個體可經(jīng)歷以高劑量化學療法進行之標準治療，接著經(jīng)歷外周血干細胞移植。在某些實施例中，在移植后，個體接受本發(fā)明之經(jīng)擴增之免疫細胞之輸注。在一額外之實施例中，經(jīng)擴增之細胞是在外科手術前或外科手術后投與。

如本文所使用，術語「自體免疫性疾病」定義為由自體免疫反應所導致之疾病。自體免疫性疾病是對自我抗原之不弁當且過度反應之結(jié)果。自體免疫性疾病之實例包括(但不限于)阿狄森氏疾病(addison'sdisease)、斑禿(alopeciaareata)、僵直性脊椎炎、自體免疫性肝炎、自體免疫性腮腺炎、克羅恩氏疾病(crohn'sdisease)、糖尿病(1型)、失養(yǎng)性水皰性表皮松解癥、附睪炎、腎小球性腎炎、葛瑞夫茲氏疾病(graves'disease)、吉蘭-巴雷(guillain-barr)癥候群、橋本氏疾病(hashimoto'sdisease)、溶血性貧血、全身性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、尋常性天皰瘡、牛皮癬、風濕熱、類風濕性關節(jié)炎、類肉瘤病、硬皮病、休格倫氏癥候群(sjogren'ssyndrome)、脊椎關節(jié)病、甲狀腺炎、血管炎、白斑病、黏液性水腫、惡性貧血及潰瘍性結(jié)腸炎。

參考下文闡述之實例可更好地了解本發(fā)明。下列實例提出以向一般技術者提供如何制造及評估本文主張之化合物、組合物、物件、器件及/或方法之完整揭示及描述，且意欲僅為示范性且無意限制本發(fā)明。

在用于治療、抑制或預防癌癥之遞開系統(tǒng)后，可以熟習行醫(yī)者熟知之各種方法評估治療性經(jīng)改造之細胞之療效。例如，一般技術者藉由觀察治療性經(jīng)改造之細胞減少癌細胞載量或預防癌細胞載量進一步增加將了解連合化學佐劑遞開之治療性經(jīng)改造之細胞對治療或抑制個體之癌癥有效。癌細胞載量可藉由此項技術中已知的方法測量，例如使用聚合酶鏈反應分析以偵測某些癌細胞核酸之存在，或識別血液中某些癌細胞標記物，使用例如抗體分析以偵測來自個體或病患之樣品(例如，但不限于，血液)中標記物之存在，或藉由測量病患中循環(huán)癌細胞抗體含量之程度。

在本說明書通篇中，是藉由范圍及藉由范圍之下邊界及上邊界定義。各下邊界可與各上邊界組合以定義范圍。下邊界及上邊界應各視為個別元件。

在本說明書通篇中提及的「一個實施例」、「一實施例」、「一個實例」或「一實例」意謂所述的與該實施例或?qū)嵗嘘P之特定特征、結(jié)構(gòu)或特性包括于本發(fā)明實施例之至少一個實施例中。因此，在整個本說明書通篇之各處中出現(xiàn)之片語「在一個實施例中」、「在一實施例中」、「一個實例」或「一實例」不一定全部是指相同實施例或?qū)嵗４送?，該等特定特征、結(jié)構(gòu)或特性可以任何合弁之組合及/或子組合形式組合于一或多項實施例或?qū)嵗?。此外，應了解因此隨本文所提供之圖式出于向一般技術者闡述之目的且該等圖式不一定成比例繪制。

如本文使用，術語「包含」、「包括」、「具有」或其任何其他變化意欲涵蓋非排他性包含物。例如，包含元件列表之方法、物件或裝置不一定限于僅彼等元件，但亦可包括未明確列舉或此種方法、物件或裝置固有之其他元件。

此外，除非明確相反指出，否則「或」是指包含性「或」且非指排他性「或」。例如，條件a或b滿足以下各物中之任何一者：a正確(或存在)及b錯誤(或不存在)；a錯誤(或不存在)及b正確(或存在)；及a與b兩者皆正確(或存在)。

此外，本文給定之任何實例或圖式不應視為以任何方式限制或表示利用其等之任何術語之定義。相反，此等實例或圖式應視為針對一項特定實施例所描述且僅具有說明性。一般技術者將了解利用此等實例或圖式之任何術語將包含隨后或于本說明書中其他處可給定或可不給定之其他實施例且所有此類實施例意欲包括于該或該等術語之范圍內(nèi)。指定此類非限制性實例及圖式之語言包括(但不限于)：「例如(forexample、forinstance、e.g)及「在一個實施例中」。在本說明書中，描述含有多個成員之各種參數(shù)組。在一組參數(shù)中，各成員可與其他成員中之任何一者或多者組合以制造額外之子組。例如，若一組中之成員是a、b、c、d及e，則明確預期之額外子組包括該等成員中之任何一、二、三或四者，例如，a及c；a、d及e；b、c、d及e等。

實例

使用經(jīng)cd4特異性嵌合抗原受體(car)改造之t細胞靶向人類t細胞惡性腫瘤

材料及方法

血液供體、原發(fā)性腫瘤細胞及細胞系人類淋巴瘤細胞及外周血單核細胞是獲得自殘留樣品。臍帶血細胞是獲得自石溪大學醫(yī)院(stonybrookuniversityhospital)中之供體。sp53及karpas299淋巴瘤細胞系是獲得自atcc(馬納薩斯市，va)。

慢病毒產(chǎn)生及t細胞之轉(zhuǎn)導為產(chǎn)生病毒上清液，根據(jù)制造商提供之實驗步驟使用lipofectamine2000(lifetechnologies,carlsbad,ca)，以pmd2g及pspax病毒封裝質(zhì)體及以prsc.cd4.3g或gfp慢病毒載體共轉(zhuǎn)染293ft細胞。慢病毒轉(zhuǎn)導前，將臍帶血或外周血單核膚色血球?qū)蛹毎?00iu/mlil-2及1μg/ml抗人類cd3(miltenyibiotec,germany)之存在下活化兩天。

t細胞擴增

使經(jīng)car轉(zhuǎn)導之t細胞在經(jīng)il-2補充之t細胞培養(yǎng)基(50%aimv、40%rpmi1640、10%fbs及1x青霉素/鏈霉素；全部為gibco)中擴增7天。每日計數(shù)細胞且每2至3天添加培養(yǎng)基以保持t細胞計數(shù)低于2x106個細胞/ml。

car免疫表達型

為分析car細胞免疫表達型，擴增7天后，用cd45ro、cd45ra、cd62l及cd8(全部來自bdbiosciences)對cd4cart細胞及gfp對照細胞染色以用于流式細胞術分析。

共培養(yǎng)靶細胞消除分析

于不含il-2的1mlt細胞培養(yǎng)基中，以2:1、5:1及10:1(分別是200,000、500,000或100萬個效應細胞對100,000個靶細胞)之比率將cd4cart細胞或gfpt細胞(對照組)與靶細胞一起培養(yǎng)24h。靶細胞是karpas299細胞(表達cd4之退行性大t細胞淋巴瘤)、來自患有cd4+t細胞白血病(sezary癥候群)之病患及來自患有cd4+ptcl淋巴瘤之病患之白血病細胞。作為陰性對照組，于1ml單獨反應中，以相同比率亦將cd4cart細胞及gfpt細胞與不表達cd4的sp53(被套細胞淋巴瘤)細胞一起培養(yǎng)。共培養(yǎng)24小時后，用小鼠抗人類cd8及cd4抗體對細胞進行染色。

在具有sp53細胞之實驗中，sp53細胞系在與t細胞共培養(yǎng)前用cmtmr(lifetechnologies)標記，及t細胞在共培養(yǎng)后用小鼠抗人類cd3(percp)標記。

活體內(nèi)小鼠異種基因模型

根據(jù)經(jīng)石溪大學iacuc批準之協(xié)定使用來自jacksonlaboratory之nsg小鼠(nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj)。小鼠全為雄性且在8至12周齡之間。無盲法(noblinding)地進行三組活體內(nèi)實驗。就各組而言，10只小鼠被用亞致死(2.5gy)劑量之γ射線進行照射并隨機分配給治療組或?qū)φ战M。24h后，給小鼠皮內(nèi)注射0.5x10⁶或1.0x10⁶個karpas299細胞以在7天內(nèi)形成可測量之皮下腫瘤。每隔一天測量腫瘤尺寸面積。在第一組中，注射100萬個karpas299細胞后三天，向小鼠靜脈內(nèi)(藉由尾部靜脈注射)注射200萬個cd4cart(5只小鼠)或200萬個gfpt對照組細胞(5只小鼠)。在第22天靜脈內(nèi)注射第二劑量之800萬個細胞。在第二組中，照射10只nsg小鼠并注射0.5x10⁶個karpas299細胞。在第2天，向小鼠靜脈內(nèi)注射一個療程之800萬個cd4cart細胞(5只小鼠)及800萬個gfpt對照組細胞(5只小鼠)。在第10天靜脈內(nèi)注射第二劑量之550萬個細胞。在第三組中，照射10只nsg小鼠并注射0.5x10⁶個karpas299細胞。在第1天，向小鼠靜脈內(nèi)注射2.5x10⁶個cd4cart細胞或注射gfpt對照組細胞(每組5只小鼠)。每5天重復靜脈內(nèi)注射，總計四個療程。

結(jié)果

第三代cd4car之產(chǎn)生

抗cd4分子之scfv(單鏈可變片段)核苷酸序列是衍生自人類化單株依巴里單抗(ibalizumab)(亦稱為hu5a8或tnx-355)。此單株抗體已用于各種i期或ii期臨床試驗中。為透過cd4car改善訊息轉(zhuǎn)導，使cd28及4-1bb共刺激因子之細胞內(nèi)域融合至cd3ζ傳訊域。此外，引入cd8之前導序列以于細胞表面上高效表達cd4car分子。實際上，該抗cd4scfv藉由cd8衍生之鉸鏈(h)及跨膜(tm)區(qū)(圖1a)連接至細胞內(nèi)傳訊域。該cd4cardna分子經(jīng)次選殖進入慢病毒質(zhì)體中。因為存在兩個共刺激域(cd28及4-1bb)，所以cd4car視為第三代car。cd4car表達受強sffv(脾臟病灶形成病毒)啟動子控制且及適用于血液應用中。

cd4car之特征描述

為證實cd4car構(gòu)筑體，對經(jīng)轉(zhuǎn)染之293-ft細胞用蛋白印跡法進行分析。以抗cd3ζ單株抗體進行之免疫印跡法顯示對應cd4carcd3ζ融合蛋白之預期尺寸之條帶(圖1b)。正如預期，針對gfp對照組載體(圖1b)未觀察到cd3ζ表達。經(jīng)由針對scfv之流式細胞術亦測試已產(chǎn)生之cd4car慢病毒于hek293細胞中之轉(zhuǎn)導效率(圖6)。因此，吾人證實吾人之已產(chǎn)生之第三代cd4car含有cd3ζ細胞內(nèi)域于細胞內(nèi)端上及scfv于細胞外端上，此意謂所有其他元件均存在：cd8鉸鏈域及跨膜域及cd28及4-1bb共刺激域(圖1c)。為臨床前表征t細胞中之cd4car表達及功能，用抗cd3抗體及il-2活化人類t細胞，然后分別用cd4car及gfp對照組慢病毒上清液轉(zhuǎn)導。使該等t細胞在轉(zhuǎn)導后擴增7天。

臍帶血衍生之cd4cart細胞針對cd8+t細胞高度富集且其等中之大部分具有類中央記憶t細胞免疫表現(xiàn)型。

人類臍帶血(cb)是用于同種異體t細胞療法之替代源?；罨祟恈b白細胞（buffycoat）層細胞并用cd4car或?qū)φ战M(gfp)慢病毒轉(zhuǎn)導。轉(zhuǎn)導后，將cd4cart細胞及gfpt細胞擴增7天，針對cd4car及gfpt細胞兩者均觀察到細胞計數(shù)增加20倍(圖7)。在第7天，藉由流式細胞術針對t細胞子集合分析細胞(圖2a)。流式細胞術分析顯示~54%之t細胞表達cd4car(圖2b)。此外，吾人在cd4car轉(zhuǎn)導后之t擴增之過程期間分析cd4及cd8子集合。與先前發(fā)現(xiàn)一致，小子集合之cd8細胞在用抗cd3及共刺激分子進行t細胞活化期間經(jīng)誘導以表達cd4(圖2c)。正如預期，與gfp對照組(其中~33%之細胞保留cd4+(圖2c))相比，該cd4+t子集合在cd4car轉(zhuǎn)導后3或4天內(nèi)幾乎完全耗盡。此等資料指示cd4cart細胞在t細胞擴增期間顯示強效活體外抗cd4活性。

吾人亦在各培養(yǎng)結(jié)束時評估cd4cart細胞之免疫表現(xiàn)型。刺激后，天然t細胞失去cd45ra并獲得cd45ro以變?yōu)橹醒胗洃泃細胞。來自3個代表性實驗之流式細胞術分析顯示96%之經(jīng)擴增之t細胞是cd45ro+，~83%是cd62l+及~80%是cd8+cd45ro+cd62l+，然而少于4%是cd45ra+(圖2d)。該cd8+cd45ro+cd62l+免疫表現(xiàn)型與類中央記憶表現(xiàn)型之獲得結(jié)果一致，及低cd45ra+表達證實天然t細胞狀態(tài)之損失。

衍生自臍帶血之cd4cart細胞明確地殺死表達cd4之白血病/淋巴瘤，包括退行性大細胞淋巴瘤、sezary癥候群及未分類之ptcl淋巴瘤。

產(chǎn)生針對cd8+t細胞高度富集之cd4cart細胞(圖2c)。然后使用karpas299細胞系活體外測試該等細胞之抗白血病功能。該karpas299細胞系最初建立自患有表達cd4之廿行性大t細胞淋巴瘤之病患之外周血。細胞遺傳學分析先前已顯示karpas299細胞具有許多細胞遺傳學異常。在共培養(yǎng)實驗期間，cd4car細胞顯示深度白血病細胞殺傷力(圖3a)。首先，測試cb衍生之cd4cart細胞消除karpas299細胞之能力。實際上，在24h培養(yǎng)及在2:1之低e:t(效應細胞:靶細胞)下，cd4car細胞成功消除karpas299細胞。作為對照，亦測試該等cd4cart細胞消除cd4陰性淋巴瘤細胞之能力。sp53被套細胞淋巴瘤細胞系是不表達cd4之人類b-細胞淋巴瘤細胞系。流式細胞術分析顯示cd4cart細胞無法溶解或消除sp53被套細胞淋巴瘤(圖3d)。

亦使用病患樣品進行研究。病患1患有cd4+t細胞白血病之攻擊性形式(sezary癥候群)，其不回應于標準化學療法。病患2患有未指定之cd4+ptcl淋巴瘤。兩個病患樣品之流式細胞術分析顯示強且均勻之cd4表達，且?guī)缀跛邪籽〖毎磉_cd4(圖3b及c)。如藉由流式細胞術分析可視化，病患樣品與cd4car共培養(yǎng)24小時導致cd4+惡性腫瘤之迅速及完全消除，且再一次地，針對sezary癥候群及ptcl兩者共培養(yǎng)物均觀察到約98%之消除，此與先前顯示之karpas之消除一致(圖3b及3c)。因此，吾人顯示，在共培養(yǎng)分析中，cd4cart細胞甚至在2:1之低e:t比率下直接自病患樣品中高效消除兩種不同類型之侵略性cd4+淋巴瘤/白血病細胞(圖3b及3c)。此等資料支持cd4是有前景之cd4陽性t細胞白血病及淋巴瘤治療靶，類似于cd19于經(jīng)由抗cd19car靶向b-細胞惡性腫瘤中之角色。因此，吾人之病患樣品及cd4car共培養(yǎng)分析延伸到使用car靶向cd4陽性惡性腫瘤之概念。

衍生自pbmc之cd4cart細胞明確地殺死表達cd4之腫瘤細胞系。

由于自體同源接受性cart療法常用于臨床中，因此吾人測試衍生自pbmc(外周血單核細胞)之cd4cart細胞?；罨痯bmc并用cd4car慢病毒轉(zhuǎn)導。藉由流式細胞術在細胞擴增期間監(jiān)測該等cd4及cd8集合，并與經(jīng)對照組gfp轉(zhuǎn)導之細胞之監(jiān)測結(jié)果相比較。與衍生自cb之cd4cart細胞觀察一樣，pbmc衍生之cd4cart細胞亦針對cd8+t細胞高度富集(圖4a)，此指示cd4car于cd4+之耗盡中之作用。使用karpas299細胞系隨后測試pbmc衍生之cd4car細胞消除cd4陽性白血病/淋巴瘤細胞之能力。該消除分析涉及cd4cart細胞或gfpt細胞與karpas299細胞及與sp53被套細胞淋巴瘤細胞系陰性對照組之共培養(yǎng)。24小時后停止反應：用7-aad(7-胺基放線菌素d)對死細胞進行染色并藉由流式細胞術分析活細胞。與cd4cart細胞一起培養(yǎng)過夜之karpas299細胞在2:1、5:1及10:1之e:t比率下分別以38%、62%及85%之速率消除(圖4b)。合并的此等資料證實強劑量-反應關系。當靶細胞與gfp對照組t細胞一起培養(yǎng)時，未觀察到殺死karpas299細胞。此等結(jié)果證實cd4cart細胞消除對cd4+靶具有針對性。

cd4cart細胞顯示顯著活體內(nèi)抗腫瘤活性。

為評估活體內(nèi)抗腫瘤活性，吾人開發(fā)一種使用karpas299細胞系的異種基因小鼠模型。使用多種不同設定以測試活體內(nèi)cd4cart細胞療效。吾人首先用單一低劑量測試cd4cart細胞延遲nsg小鼠中之白血病之出現(xiàn)之能力。注射前，如藉由流式細胞術分析證實，經(jīng)改性之t細胞顯示~40至50%之細胞表達cd4car。小鼠接受karpas299細胞之皮內(nèi)注射及然后給定低劑量(200萬)之單一全身性注射(靜脈內(nèi)投與)之cd4cart細胞。向患有白血病之小鼠單一低劑量投與全身性cd4cart細胞引起白血病塊之僅暫態(tài)廿化或延遲白血病塊之出現(xiàn)(圖5a)。當白血病生長開始加快時，額外療程之8x10⁶個cd4cart細胞之投與顯著遏制白血病生長(圖5a)。

為進一步測試cd4car抗白血病活性之療效，吾人投與兩個療程之相對大劑量之cd4cart細胞。類似地，總計13.5x10⁶個cd4cart細胞的兩次注射相較于較低cd4car劑量引起更深度之白血病生長遏制，但最終白血病細胞群體恢復(圖5b)。最終，吾人研究低劑量cd4cart細胞(各2.5x10⁶細胞)之多療程注射之療效。一經(jīng)每4或5天總計注射4次后，吾人以重復靜脈內(nèi)注射cd4cart細胞處理患有皮下白血病之小鼠。四個療程之cd4cart細胞投與后，四只經(jīng)處理之小鼠中之一者無腫瘤并顯示無中毒外觀。相較于單一劑量，經(jīng)多劑量cd4cart細胞處理之小鼠顯示更顯著之抗白血病效應(圖5c及5a)。此外，相較于施用經(jīng)gfp轉(zhuǎn)導之對照組t細胞之治療，使用cd4cart細胞之治療顯著延長患有karpas299淋巴瘤之小鼠之存活(圖5d)。

抗cd4嵌合抗原受體(cd4car)nk細胞于臨床前模型中高效靶向t細胞惡性腫瘤

方法材料

原發(fā)性腫瘤細胞及細胞系

人類白血病細胞是根據(jù)經(jīng)石溪大學機構(gòu)審查委員會(institutionalreviewboardofstonybrookuniversity)批準之協(xié)定獲得自殘留樣品。臍帶血細胞亦根據(jù)協(xié)定獲得自石溪大學醫(yī)院中之供體。書面知情同意書獲得自所有供體。karpas299、hl-60、ccrfcem、molt4及nk-92細胞系是獲得自atcc(manassas,va)。nk-92細胞是培養(yǎng)于經(jīng)過濾之nk細胞培養(yǎng)基中，除非另有說明，否則該培養(yǎng)基定義為不含核糖核苷及去氧核糖核苷但含以下物質(zhì)之補充有il-2(300iu/ml)之α-mem：2mml-麩醯胺酸、1.5g/l重碳酸鈉、12.5%熱滅活馬血清、12.5%熱滅活fbs、1xpen/strep、0.2%肌醇、0.02%葉酸及50μmβ-巰基乙醇。karpas299、ccrf-cem及molt4細胞是培養(yǎng)于rpmi、10%fbs、1xpen/strep(gibco,waltham,ma,usa)中。hl-60細胞是培養(yǎng)于imdm、10%fbs、1xpen/strep(gibco,waltham,ma,usa)中。

car構(gòu)筑體產(chǎn)生

cd4針對性car(prsc.sffv.cd4.3g)是經(jīng)設計以含有細胞內(nèi)cd28域位于4-1bb及cd3ζ域上游，借此使該構(gòu)筑體成為第三代car。

慢病毒產(chǎn)生及轉(zhuǎn)導

為產(chǎn)生病毒上清液，根據(jù)制造商提供之實驗步驟使用lipofectamine2000(lifetechnologies,carlsbad,ca)，以pmd2g及pspax病毒封裝質(zhì)體及以prsc.cd4.3g或gfp慢病毒載體共轉(zhuǎn)染293ft細胞。在用病毒上清液轉(zhuǎn)導前，將nk細胞在300iu/mlil-2之存在下培養(yǎng)最少2天。轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)導程序進一步描述于補充資料中。

于經(jīng)轉(zhuǎn)導之nk細胞上之car偵測

為測定car表達，在轉(zhuǎn)導后3天，清洗nk細胞并將其等懸浮于fac緩沖液(0.2%bsa于dpbs中)中。使用正常山羊igg(jacksonimmunoresearch,westgrove,pa)以阻斷非針對性結(jié)合。用經(jīng)生物素標記之多株山羊抗小鼠f(ab’)2(1:250,jacksonimmunoresearch,westgrove,pa)在4℃下探測各nk細胞樣品30分鐘。清洗細胞一次并再懸浮于fac緩沖液中。然后用經(jīng)pe標記之鏈霉親和素(1:250,jacksonimmunoresearch,westgrove,pa)在4℃下對細胞進行染色30分鐘。用fac緩沖液清洗細胞并再懸浮于2%福爾馬林中。使用faccalibur儀器(bectondickinson,franklinlakes,nj)進行流式細胞術并使用kaluza軟體(beckmancoulter,brea,ca)分析結(jié)果。

共培養(yǎng)分析

將cd4car或載體對照組nk細胞與表達cd4之karpas299細胞(退行性大t細胞淋巴瘤)、hl-60細胞(急性前骨髓細胞白血病)、ccrf-cem細胞(t細胞急性淋巴性白血病:t-all)、分離自人類臍帶血之cd4+t細胞或表達cd4之原發(fā)性人類白血病細胞(成人sézary癥候群及小兒t-all)以2:1及5:1(分別是200,000及500,000個效應細胞對100,000個靶細胞)培養(yǎng)于1ml不含il-2之nk-細胞培養(yǎng)基中。24小時共培養(yǎng)后，收獲剩余之活細胞并用小鼠抗人類cd56及cd4抗體染色且在4℃下培養(yǎng)30分鐘。cd56+單陽性指示nk細胞及cd4+單陽性指示靶細胞。所有細胞用fac緩沖液清洗，懸浮于2%福爾馬林中并藉由流式細胞術分析。

細胞毒性分析

將cd4car或載體對照組nk細胞與中靶細胞(經(jīng)cfse染色之karpas299細胞及經(jīng)cmtmr染色之ccrf-cem細胞)與經(jīng)cmtr標記之脫靶molt4細胞之50:50之混合物以1:1、1:2及1:4比率之效應細胞:靶細胞比率培養(yǎng)在1ml不含il-2之nk-細胞培養(yǎng)基中。24小時后，用7-aad(biolegend,sandiego,ca)對細胞進行染色，用fac緩沖液清洗并藉由流式細胞術分析活7-aad陰性細胞。

集落形成單位(cfu)分析

將cd4carnk細胞與500個cd34+cb細胞分別以2:1及5:1之共培養(yǎng)效應細胞:靶細胞比率于經(jīng)il-2補充之nk細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。所用對照組是cd34+細胞單獨及未經(jīng)轉(zhuǎn)導之nk細胞以2:1及5:1效應細胞:靶細胞比率與cd34+cb細胞共培養(yǎng)。經(jīng)由在第16天形成紅血球爆裂形成單位(bfu-e)及顆粒球/單核球集落形成單位(cfu-gm)之數(shù)量評定造血室輸出。經(jīng)由α設定在0.05的雙向anova進行cfu統(tǒng)計分析。

異種基因小鼠模型

雄性12周齡nsg小鼠(nod.cg-prkdcsidil2rgtm1wjl/szj)是購買自jacksonlaboratory(barharbor,me)并根據(jù)經(jīng)石溪大學iacuc批準之協(xié)定使用。nsg小鼠經(jīng)亞致死(2.5gy)劑量之γ射線照射。二十四小時后，對小鼠皮內(nèi)注射已經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導以表現(xiàn)螢光素酶之0.5x10⁶個karpas299細胞，以引起可測量之皮下腫瘤之形成。在第1天，注射karpas299細胞后二十四小時，經(jīng)由尾部靜脈向小鼠靜脈內(nèi)注射5x10⁶個cd4carnk細胞或載體對照組nk細胞(n=4只每組)。每5天重復靜脈內(nèi)注射，總計6個療程。每隔一天測量腫瘤尺寸面積。在注射karpas299細胞后之第7、14及21天，對小鼠皮下注射100μlredijectd-螢光素(perkinelmer,waltham,ma)并經(jīng)受ivis成像(perkinelmer,waltham,ma)。使用caliperlifesciences軟體(perkinelmer,waltham,ma)分析成像。

統(tǒng)計資料

使用2個樣品2側(cè)相等概率分析(90%概率(power)及<5%顯著性)評估異種基因模型樣品尺寸。使用非成對學生t檢驗以測定腫瘤尺寸面積及光強度之顯著性。使用kaplan-meier方法構(gòu)建存活曲線并使用以p<0.05視為顯著之對數(shù)秩(mantel-cox)檢驗進行存活之統(tǒng)計分析。使用graphpadprism6軟體進行統(tǒng)計分析。經(jīng)測定，在非成對學生檢驗前，治療組與對照組間之方差相似。

結(jié)果

第三代cd4car之產(chǎn)生

抗cd4分子之單鏈可變片段(scfv)核苷酸序列是衍生自人類化單株抗體依巴里單抗(hu5a8或tnx-355)?其安全性及療效已于hiv臨床試驗中經(jīng)充分研究。為改善訊息轉(zhuǎn)導，cd4car是經(jīng)設計具有融合至cd3ζ傳訊域之cd28及4-1bb域，使得其成為第三代car。靶向cd19之第三代cart細胞先前已用于臨床試驗中，其等具有極佳之療效。就cd4car分子于nk細胞表面上之高效表達而言，使用強脾臟病灶形成病毒啟動子(sffv)并將cd8之前導序列并入該構(gòu)筑體中。該抗cd4scfv藉由cd8衍生之鉸鏈(h)及跨膜(tm)區(qū)與細胞內(nèi)傳訊域隔開(圖8a及8c)。該cd4cardna分子接著次選殖至慢病毒質(zhì)體中。

cd4car之特征描述

為驗證cd4car構(gòu)筑體，用cd4car慢病毒質(zhì)體或載體對照組質(zhì)體轉(zhuǎn)染hek293-ft細胞，及48小時后收獲該等細胞以用于蛋白印跡法分析中。以抗cd3ζ單株抗體進行之免疫印跡法顯示對應cd4car-cd3ζ融合蛋白之預期尺寸之條帶(圖8b)。正如預期，針對gfp載體對照組蛋白未觀察到cd3ζ表達(圖8b)。

cd4carnk細胞之產(chǎn)生

cd4carnk轉(zhuǎn)導效率是測定為15.9%，如藉由流式細胞術測定(圖9a上方格)。接著，使用經(jīng)螢光活化之細胞分選(facs)以進一步針對cd4car+nk細胞富集。分選后，收集之cd4car高nk細胞經(jīng)證實超過85%cd4car陽性(圖15)。在cd4car高細胞之facs收集后，cd4car表達程度在擴增多達10個繼代期間及在冷凍保存(cryopreservation)后始終穩(wěn)定保持75-90%于nk細胞上。實際上，在共培養(yǎng)實驗開始時，經(jīng)擴增之cd4car高nk細胞以85%表達car(圖9a下方格)cd4carnk細胞針對性溶解cd4+血液癌細胞，包括廿行性大t細胞淋巴瘤(karpas299)、急性骨髓性白血病(hl-60)及t細胞急性淋巴性白血病(ccrf-cem)。

使用下列cd4+細胞是測試cd4carnk細胞之活體外抗淋巴瘤活性：karpas299、hl-60及ccrf-cem。該karpas299細胞系是建立自患有廿行性大t細胞淋巴瘤之25歲病患之外周血。該hl-60細胞系是建立自患有急性前骨髓細胞白血病之36歲病患之外周血。該ccrf-cem細胞系是建立自患有t細胞急性淋巴母細胞性白血病(tall)之4歲病患之外周血。

在24小時共培養(yǎng)實驗期間，cd4carnk細胞顯示在2:1(圖10a)之低效應細胞對靶細胞比率(e:t)及標準5:1比率(圖10c)之效應細胞對靶細胞比率(e:t)下深度殺死cd4陽性白血病/淋巴瘤細胞。在共培養(yǎng)細胞毒性分析中，藉由cd4+、cd56-免疫表現(xiàn)型(在流式細胞術圖上用藍色標記)識別靶腫瘤細胞。正如預期，載體對照組nk細胞顯示一些nk細胞固有之非針對性腫瘤細胞殺傷力，但正如預期，相較于cd4carnk細胞，載體對照組nk細胞遠無法有效抗cd4+腫瘤細胞。karpas299細胞單獨之分析證實99.1%之cd4+表達(圖10a上方格)，顯著地，在2:1之e:t比率下，cd4carnk細胞相較于載體對照組(n=2)完全消除100%之karpas299細胞(圖10a上方格及10c)。類似地，hl-60及ccrf-cem細胞單獨之分析證實cd4之高表達，分別是99.9%及92.1%(圖10a中間方格及下方格)。同樣地，在2:1之e:t比率下，與載體對照組相比，cd4carnk細胞有力溶解75%之hl-60細胞及97%之ccrf-cem細胞(圖10a及10c)。合并的此等資料顯示cd4carnk細胞除保留nk細胞固有之非特異性抗腫瘤細胞活性外亦特異性及強效靶向cd4+細胞。

使用病患樣品亦進行共培養(yǎng)研究(圖10b及10c)。病患1患有sézary癥候群，且對標準化學療法沒有反應之cd4+皮膚t細胞淋巴瘤侵略性形式。sézary癥候群是ptcl之子集合。經(jīng)由流式細胞術評定，病患1之白血病細胞是78.1%cd4+(圖10b)。病患2患有cd4+小兒t細胞急性淋巴性白血病(t-all)。類似地，經(jīng)由流式細胞術評定，病患2之細胞是43.7%cd4+(圖10b)。以2:1之低e:t比率共培養(yǎng)24小時后，cd4carnk細胞溶解病患1中58%之cd4+sézary癥候群細胞及病患2中78%之cd4+t-all細胞(n=2)。此外，在增加之5:1(car共培養(yǎng)分析之標準)之e:t比率下，cd4carnk細胞溶解病患1中82%之sézary癥候群細胞及病患2中82%之t-all細胞(n=2)(圖10c及圖14)。此等資料有力表明針對成人及小兒cd4+t細胞白血病及淋巴瘤兩者之細胞系及病患樣品設定中之劑量依賴性反應及強效cd4carnk細胞抗腫瘤活性。

cd4carnk細胞以劑量依賴性方式特異性溶解表達cd4之腫瘤細胞系。

cd4carnk細胞在1:4、1:2及1:1效應細胞:靶細胞比率下以劑量依賴性方式特異性溶解活體外cd4+karpas299及ccrf-cem白血病細胞系(圖11)。就各共培養(yǎng)e:t比率而言，將cd4carnk效應細胞或載體對照組nk效應細胞與由等數(shù)量中靶cd4+細胞、經(jīng)cfse染色之karpas299或經(jīng)cfse染色之ccrf-cem及經(jīng)cmtmr染色之「脫靶」cd4-、cd5+molt4急性淋巴性白血病細胞構(gòu)成之腫瘤細胞培養(yǎng)。

molt4細胞被包括在以說明初始細胞數(shù)量之變化及自發(fā)性靶細胞死亡內(nèi)。24小時后，藉由流式細胞術分析活細胞。藉由比較cd4carnk共培養(yǎng)中之cd4+靶細胞存活與載體對照組nk共培養(yǎng)中之cd4+靶細胞存活測量靶細胞之溶解百分率。在1:4、1:2及1:1效應細胞對靶細胞比率下，分別以67%、95%及100%之速率消除karpas299細胞(圖11)。及在相同e:t比率下，分別以39%、58%及69%之速率消除ccrfcem細胞(圖11)。正如預期，cd4carnk細胞不溶解經(jīng)cmtmr標記之molt4細胞，藉由流式細胞術分析證實是<5%cd4+(圖16a)。額外之共培養(yǎng)實驗證實cd4carnk細胞在0h、4h、8h及24h時不溶解molt4細胞(圖16b)，然而cd4carnk細胞早在4h時即溶解karpas299細胞，如藉由流式細胞術偵測(圖16c)。合并的此等資料指示cd4carnk細胞抗腫瘤細胞毒性是劑量依賴性、迅速開始并對cd4+細胞具有高度針對性。

使用分離自臍帶血之cd4+t細胞進行額外之共培養(yǎng)研究。在此等實驗中，cd4carnk細胞在2:1效應細胞:靶細胞比率下在24小時共培養(yǎng)后完全耗盡cd4+t細胞，及剩余之細胞0.0%cd4+。正如預期，在cd4+臍帶血細胞與相應載體對照組nk細胞(cd56+、cd4-)共培養(yǎng)后，該cd4+群體保持較大完整性(圖12a)，此進一步證實健康組織上之cd4+群體之經(jīng)特異性及強cd4carnk介導之耗盡。

cd4carnk細胞不影響造血室中之干細胞輸出。

cfu(集落形成單位)分析顯示cd4carnk細胞不顯著影響造血室之cd34+臍帶血干細胞輸出。造血室輸出是藉由紅血球祖代及顆粒球/巨噬細胞祖代在第0天之存在加以評定，藉由第16天之紅血球爆裂形成單位(bfu-e)之數(shù)量及顆粒球/單核球集落形成單位(cfugm)之數(shù)量測定(圖12b)。此發(fā)現(xiàn)與對造血干細胞及早期祖代具有有限影響之特異性靶向cd4(成熟t細胞標記物)一致，且缺乏譜系偏移(lineageskewing)(治療安全性之量度)之證據(jù)。

cd4carnk細胞顯示顯著之活體內(nèi)抗腫瘤活性

為評估cd4carnk細胞之活體內(nèi)抗腫瘤活性，吾人開發(fā)一種異種基因小鼠模型，其使用經(jīng)亞致死量照射并皮內(nèi)注射表現(xiàn)螢光素酶之karpas299細胞以誘導可測量之腫瘤形成之nsg小鼠。在第1天，注射karpas299細胞后24小時，且之后每5天注射總計6個療程，每次投與向小鼠靜脈內(nèi)注射5x10⁶個cd4carnk細胞或載體對照組nk對照組細胞。在第7、14及21天，對小鼠皮下注射redijectd-螢光素并經(jīng)受ivis成像以測量腫瘤負擔(圖13a)。將針對注射cd4carnk之小鼠之平均光強度與針對注射載體對照組nk之小鼠之平均光強度進行比較(圖13b)。在第21天前，該等注射cd4carnk之小鼠比載體對照組具有顯著更低之光強度且因此更少腫瘤負擔(p<0.01)。在第1天，且之后每隔一天，測量腫瘤尺寸面積并比較兩組間之平均腫瘤尺寸(圖13c)。非成對學生t檢驗分析顯示自第17天(p<0.05)起并在第19至25天持續(xù)(p<0.01)，注射cd4carnk之小鼠之平均腫瘤尺寸顯著小于注射載體對照組nk之小鼠之平均腫瘤尺寸。接著，吾人比較跨兩組之小鼠存活(圖13d)。所有注射cd4carnk之小鼠在第30天后仍存活。然而，注射載體對照組nk之小鼠之存活百分率在17天時開始減少且在第23天前無存活?？偠灾说然铙w內(nèi)資料指示cd4carnk細胞顯著減小注射karpas299之nsg小鼠中之腫瘤負擔并延長該等nsg小鼠之存活。

抗cd5嵌合抗原受體(cd5car)t細胞有效靶向cd5陽性血液惡性腫瘤

實例

結(jié)果

第三代cd5car之產(chǎn)生

cd5car之構(gòu)筑體及錨固cd5scfv抗體是經(jīng)設計以測試cd5cart細胞之靶向并溶解表達cd5之細胞之功能及機制及cd5cart細胞下調(diào)其等自身cd5cart細胞群體內(nèi)的cd5表達之能力(圖17a)。為證實cd5car構(gòu)筑體，將所產(chǎn)生之cd5car慢病毒轉(zhuǎn)導至hek293細胞中。用cd5car或gfp-慢病毒處理48h后，使用cd3ζ抗體藉由蛋白印跡法分析驗證cd5car于hek293細胞中之表達，該等cd3ζ抗體識別cd5car蛋白之c端(圖17b)。所得之條帶是在經(jīng)cd5car轉(zhuǎn)導之hek293細胞中之cd5car蛋白之預期尺寸，但經(jīng)gfp轉(zhuǎn)導之hek293細胞藉由蛋白印跡法分析不顯示任何特異性條帶。為評估cd5car蛋白用于后續(xù)實驗之功能，將cd5car慢病毒轉(zhuǎn)導至經(jīng)活化之人類t細胞中。使用山羊抗小鼠f(ab’)抗體藉由流式細胞術分析評估cd5car于t細胞表面上之表達，該山羊抗小鼠f(ab’)抗體識別cd5car蛋白之scfv區(qū)。流式細胞術分析顯示相較于同型對照組在經(jīng)cd5car轉(zhuǎn)導之t細胞上觀察到約20%之cd5car表達(圖17c)。此等結(jié)果指示吾人成功產(chǎn)生用于下列實驗之表達cd5car之t細胞。

針對car療法cd5表達下調(diào)

在cd5cart細胞共培養(yǎng)及動物分析前，下調(diào)cd5于cd5cart細胞之表面上之表達以避免在cd5cart群體內(nèi)自殺。cd5之下調(diào)將防止cart細胞群體內(nèi)之cart細胞之自殺，且cd5之下調(diào)是與t細胞群體之增強之殺傷力相關聯(lián)。于無cd5表達之t細胞內(nèi)產(chǎn)生之car可為超功能car，其與該car其本身之構(gòu)筑體無關。用于產(chǎn)生cd5cart細胞之步驟及使用cd5car慢病毒之單轉(zhuǎn)導或雙轉(zhuǎn)導下調(diào)cd5之比較顯示于圖18a及b中。經(jīng)未經(jīng)濃縮之lent-cd5car病毒單轉(zhuǎn)導之cd5cart細胞在第8天前不顯示細胞表面之cd5蛋白之完全下調(diào)，及最大cd5陰性群體在第6天多達46%(圖18c)。在經(jīng)雙轉(zhuǎn)導之群體中，約90%經(jīng)轉(zhuǎn)導之t細胞在經(jīng)4天培養(yǎng)后變成cd5陰性。相比之下，該gfpt細胞對照組自第2天至第8天保持cd5+、cd3+雙陽性群體超過95%(圖18c)。

t細胞上之cd5表達之下調(diào)可藉由錨固cd5carscfv慢病毒之轉(zhuǎn)導來完成。

為進一步闡述cd5car下調(diào)t細胞上之cd5表達之機制，創(chuàng)造標題為錨固cd5scfv之新穎構(gòu)筑體(seqidno.7)(圖17a)。此構(gòu)筑體包含經(jīng)由鉸鏈區(qū)(其容許cd5scfv固定于t細胞表面上)連接至跨膜域之抗cd5scfv。該錨固cd5scfv多肽(seqidno.16)結(jié)合至cd5靶而不溶解靶細胞，與使用功能cd5car所觀察般。單轉(zhuǎn)導及流式資料分析顯示于圖19a及19b中，及在培養(yǎng)之第7天針對t細胞部分下調(diào)cd5表達。此與在單轉(zhuǎn)導后針對cd5cart細胞所見之cd5表達之部分下調(diào)一致。

cd5cart細胞有效溶解t-細胞all細胞系。

首先測試cd5cart細胞針對t細胞all建立之細胞系ccrfcem及molt-4及退行性大細胞白血病細胞系karpas299之殺傷力，如圖20a及20b中所示。當相較于gfp對照組時，觀察到對兩種cd5+細胞系之強殺傷力，及針對兩種細胞系而言靶細胞溶解超過75%。在針對cd5呈陰性之退行性大細胞系karpas299中觀察到0%溶解。

cd5cart細胞有效溶解來自人類樣品之t-細胞all細胞。

使用多個病患樣品亦評定cd5car溶解病患樣品t-all細胞之能力及cd5car細胞共培養(yǎng)顯示于圖21及圖22中。雖然針對t-all1病患白血病細胞注意到與當cd5car細胞靶向t細胞all細胞系時所見之cd5靶細胞溶解類似的高效細胞殺傷，但三個其他病患白血病細胞顯示靶細胞之相對較弱溶解(圖21a及圖21b)。

cd5car殺死病患白血病細胞之能力與cd5表達之強度相關聯(lián)，如圖21a、21b及21d中所示。如圖21c及21d中所示，通過流式細胞術分析觀察到t-all-1、t-all3、t-all6及t-all7之cd5表達。除t-all-1樣品外，該等t-all病患樣品之cd5表達明顯較低。

cd5cart細胞顯示特異性及強效將靶細胞殺死。

作為對照，亦測試cd5cart細胞消除cd5陰性白血病t細胞之能力。退行性大t細胞淋巴瘤系是不表達cd5之細胞系。流式細胞術分析顯示cd5cart細胞無法溶解或消除karpas299細胞，如圖21a下方格中所示。

具有高cd5表達程度之病患樣品(t-all-8)是獲得自患有t-all之最小疾病之病患。用cd5car進行共培養(yǎng)并詳細分析，如圖22中所示。在共培養(yǎng)后藉由流式細胞術評定三種群體細胞，包括cd5+正常t細胞、cd5+cd34+t-all細胞及cd5-cd34+t-all細胞。當相較于gfp對照組時，cd5car顯示特異性及強效靶細胞溶解能力，且對于所有cd5+細胞群體而言>93%之cd5陽性細胞溶解。cd5car如cd5正常t細胞般有效殺死白血病細胞。在cd5陰性群體中未觀察到殺傷。

cd5cart細胞基本上消除t細胞群體(cd5+cd34-)。

cd5cart細胞有效消除正常t細胞。

cd5cart細胞證實在共培養(yǎng)分析中在0.25:1、0.5:1及1:1之低比率(效應細胞:靶細胞)下以劑量依賴性方式有效消除正常t細胞(圖23)。將cd5cart細胞或cd123cart(對照組)效應細胞與經(jīng)gfp標記之t細胞一起培養(yǎng)。藉由比較cd5cart共培養(yǎng)中之gfpt細胞存活相對于cd123cart對照組共培養(yǎng)中之gfpt細胞存活測量靶細胞之殺傷百分率。cd5cart細胞以劑量反應方式消除正常gfpt細胞。

cd5cart細胞在1:1效應細胞對靶細胞比率下有效消除所有gfpt細胞(圖23)。由于cd5cart細胞有效消除所有正常t細胞，因此cd5cart療法之可行性應取決于提供暫態(tài)而非永久之能力。cd5cart細胞可用作造血細胞移植之新穎調(diào)節(jié)方案或「過渡治療」。

t細胞在其等與cd5car或錨固cd5scfvt細胞共培養(yǎng)時持續(xù)表達cd5。

cd5的其中一種性質(zhì)是與抗體結(jié)合后內(nèi)化。因此，靶細胞失去靶抗原，此可引起抗原異脫。此現(xiàn)象已報告為使用基于cart細胞之療法之臨床研究失敗之原因。

吾人接著使用共培養(yǎng)分析研究cd5car或錨固cd5scfvt細胞是否影響cd5陽性t或白血病細胞上之cd5表達之問題。用于產(chǎn)生cd5cart細胞或錨固cd5scfvt細胞及cd123cart細胞(對照組)之步驟顯示于圖24a中。在第3天使用lenti-cd5car或錨固cd5scfv及cd123car病毒第二次轉(zhuǎn)導t細胞后，藉由流式細胞術分析經(jīng)轉(zhuǎn)導之t細胞之cd5表大。經(jīng)cd5car或錨固cd5scfv慢病毒轉(zhuǎn)導之t細胞顯示表面cd5蛋白之基本完全下調(diào)(圖24b)。相比之下，經(jīng)cd123car轉(zhuǎn)導之t細胞對照組持續(xù)c表達d5。

然后吾人以1:1(e:t)之比率將經(jīng)轉(zhuǎn)導之cd5car或經(jīng)cd5固定之scfv及cd123cart細胞與經(jīng)gfp標記之t細胞共培養(yǎng)2天或4天，如圖25a及b中所示，cd5cart細胞有效消除所有gfp-t細胞。正如預期，經(jīng)轉(zhuǎn)導之經(jīng)cd5固定之scfv或cd123cart細胞無法溶解gfpt細胞。此外，gfpt細胞在與經(jīng)轉(zhuǎn)導之經(jīng)cd5固定之scfv或cd123cart細胞共培養(yǎng)時仍表達cd5。此等研究指示在采用cd5car進行免疫療法時cd5抗原異脫不可能發(fā)生。

當tall細胞經(jīng)lenti-cd5car或經(jīng)cd5固定之scfv病毒轉(zhuǎn)導時，下調(diào)tall細胞

中之cd5表達。

吾人接著測試cd5car-或錨固cd5car慢病毒于tall細胞上之轉(zhuǎn)導是否導致cd5表達之下調(diào)。用cd5car-或錨固cd5scfv慢病毒轉(zhuǎn)導ccrf-cem及molt-4t-all細胞。cd5car或錨固cd5scfv顯著下調(diào)或減少此等白血病細胞之表面cd5表達之量(圖25c)。相比之下，該等t細胞在此等細胞用以與經(jīng)轉(zhuǎn)導之錨固cd5scfvt細胞共培養(yǎng)時持續(xù)表達cd5(圖24a及b)。

cd5cart細胞顯示深度活體內(nèi)深抗腫瘤活性

為評估cd5cart細胞之活體內(nèi)抗腫瘤活性作為其等于病患中之療效之預示，吾人開發(fā)一種異種移植小鼠模型，其使用經(jīng)亞致死量(2.0gy)照射并靜脈內(nèi)注射1.0x10⁶個表現(xiàn)螢火蟲螢光素酶之ccrfcem細胞(cd5+)以誘導可測量之腫瘤形成之nsg小鼠。在ccrfcem-luc+細胞注射后第3天，對小鼠靜脈內(nèi)注射5x10⁶個cd5cart細胞或載體對照組t細胞。在第4、第6及第7天重復此等注射，總計每只小鼠注射20x10⁶個t細胞。在第5、8、10及13天，對小鼠皮下注射redijectd-螢光素(perkin-elmer)并經(jīng)受ivis成像(caliperlifesciences)以測量腫瘤負擔(圖26a)。將針對注射cd5cart細胞之小鼠之平均光強度與針對注射載體對照組t之小鼠之平均光強度進行比較(圖26b)。成對t檢驗分析顯示在第13天前兩組間之極高顯著性差異且注射cd5cart之組比對照組具有更小光強度及因此更小腫瘤負擔(p<0.0012)。進一步分析顯示在第5天前，相較于對照組小鼠，先前僅用cd5cart細胞治療3天之小鼠具有53%更低腫瘤負擔，且該百分率在第8天前提高至95%(圖26c)。在第13天，經(jīng)治療之小鼠之腫瘤負擔保持在接近背景水平。在第15天，自包括未注射ccrfcem或t細胞(以充當背景對照組)之2只小鼠之各小鼠中抽取少量外周血，并藉由流式細胞術分析經(jīng)移植之ccrf-cem細胞(cd5+)之存在。結(jié)果將該成像完美反映為作為降至接近背景水平之經(jīng)cd5cart細胞處理之小鼠中之腫瘤細胞百分率(<1%)，然而給定對照組t細胞之小鼠具有在28至43%ccrf-cem腫瘤細胞(圖26d)?？偠灾?，此等活體內(nèi)資料指示當相較于載體對照組t細胞時，cd5cart細胞有力減小注射ccrf-cem之nsg小鼠中之腫瘤負擔并延長該nsg小鼠之存活。

抗cd5嵌合抗原受體(cd5car)nk細胞有效消除cd5陽性血液惡性腫瘤。

實例

結(jié)果

cd5nk-car之產(chǎn)生

該抗cd5分子是分子設計，其由結(jié)合cd28及4-1bb域融合至cd3ζ傳訊域以改善訊息轉(zhuǎn)導之單鏈可變片段(scfv)構(gòu)成使得其成為第三代car。強脾臟病灶形成病毒啟動子(sffv)是用于cd5car分子于nk細胞表面上之高效表達并將cd8前導序列并入該構(gòu)筑體中。該抗cd5scfv是經(jīng)由cd8衍生之鉸鏈(h)及跨膜(tm)區(qū)連接至細胞內(nèi)傳訊域。然后將此cd5car構(gòu)筑體轉(zhuǎn)殖至慢病毒質(zhì)體中。

cd5carnk細胞之產(chǎn)生

藉由流式細胞術分析測定cd5car之轉(zhuǎn)導效率。為針對cd5car+nk細胞富集，使用流式細胞術收獲最高表達之nk細胞。分選后，擴增cd5car高nk之表達以用于活體外及活體內(nèi)療效。

cd5carnk細胞有效消除人類t細胞急性淋巴性白血病(tall)細胞系

使用ccrf-cem、molt-4及jurkat細胞系測試cd5carnk細胞之活體外抗t-all活性。所有此等t-all細胞系高度表達cd5。

在共培養(yǎng)實驗期間，cd5carnk細胞在2:1及5:1低效應細胞對靶細胞比率(e:t)下顯示深度殺死ccrf-cem。在此等比率下，cd5carnk細胞幾乎消除ccrf-cem細胞(圖27a)。cd5carnk細胞在0.25:1、0.5:1、1:1、2:1及5:1效應細胞:靶細胞比率下以劑量依賴性方式溶解活體外ccrf-cem白血病細胞(圖27b及27c)。額外之兩種t-all細胞(molt-4及jurkat)系用于測試cd5nk細胞之抗白血病活性。用cd5carnk細胞進行此等兩種細胞系之共培養(yǎng)研究。cd5carnk細胞以2:1之低效應細胞:靶細胞比率基本上消除molt-4及jurkat細胞(圖28a及b)。

cd5carnk細胞有效消除人類樣品的侵略性cd5+t-all細胞。

亦使用病患樣品進行共培養(yǎng)實驗(圖29a、b)。病患1及2兩者是t-all，并對標準化學療法沒有反應。病患1(t-all#1)具有小子集合的cd5陽性t-all細胞。將此病患之白血病細胞與cd5carnk細胞共培養(yǎng)。閘控靶群體并使用細胞cytotracker染料(cmtmr)標記病患之細胞以流式細胞術定量。針對同型對照組閘控靶cd5+cd34+細胞群體。cd5carnk細胞在5:1之e:t比率下溶解約60%之cd34+cd5+白血病細胞。重要地，cd5carnk細胞針對cd5-細胞群體不顯示任何活性，此表明針對靶抗原抗原決定基之特異性及定向活性(對靶抗原抗原決定基具有選擇性)。病患2具有幾乎cd5陽性t-all群體，并與cd5carnk細胞共培養(yǎng)。

cd5carnk細胞顯示以針對低(dim)cd5+cd34+群體之強效活性幾乎完全溶解高度表達cd5+之靶群體(圖29b)。

cd5carnk細胞有效消除人類樣品的侵略性cd5+外周t細胞淋巴瘤(ptcl)細胞。

病患3患有cd4+ptcl(未經(jīng)分類之類型)及病患4患有sézary癥候群(不回應于標準化學療法之ptcl之攻擊性形式)。將病患3之淋巴瘤細胞與cd5carnk細胞共培養(yǎng)24小時。白血病細胞是cd5+cd7-陽性并閘控cd5+cd7-群體及藉由流式細胞術定量。靶cd5+cd7-群體經(jīng)分析，且相對于經(jīng)轉(zhuǎn)導之載體對照組nk細胞展現(xiàn)細胞存活。cd5carnk顯示幾乎完全溶解白血病cd5+cd7-靶群體，及完全溶解包括表達cd5之正常t細胞之全部cd5+群體(圖29c)。

24小時后，將患有sézary癥候群之病患#4之白血病細胞與cd5carnk細胞以2:1及5:1之e:t比率共培養(yǎng)。cd5carnk細胞顯示強效抗白血病酸性且超過90%之sézary癥候群細胞溶解(圖29d)。在其中白血病細胞幾乎消除之2:1之e:t比率下達成飽和。

cd5carnk細胞有效耗盡正常t細胞。

t細胞分離自臍帶血并用于與cd5carnk細胞共培養(yǎng)。如圖30中所示，cd5carnk細胞在2:1之低效應細胞:靶細胞比率下在共培養(yǎng)24小時后完全耗盡t細胞(圖30)。如相較于gfp對照組之t細胞，該t細胞群體保持較大程度之完整。

cd5carnk細胞有效溶解包括被套細胞淋巴瘤(mcl)及慢性淋巴性淋巴瘤(cll)之cd5+b-細胞惡性腫瘤。

對患有(mcl)及cll之病患之cd5+jeko淋巴瘤細胞系及淋巴瘤細胞進行額外共培養(yǎng)研究。該jeko-1mcl細胞是建立自具有mcl之大細胞變體之病患之外周血單核細胞。在以2:1之低e:t下之共培養(yǎng)研究中，cd5carnk細胞有效溶解約80%之jeko細胞(圖31a)。亦將分離自患有mcl之病患樣品之細胞與cd5carnk細胞共培養(yǎng)。閘控靶群體并藉由流式細胞術定量活細胞。cd5carnk細胞幾乎消除cd5+cd19+白血病群體及cd5+cd19-t細胞群體之兩個群體(圖31b)。亦將患有b-細胞cll之病患之細胞與cd5carnk細胞共培養(yǎng)。使用cd19以憑借流式細胞術閘控白血病群體。藉由cd5carnk細胞幾乎消除cd5+cd19+cll細胞(圖31c)。此等研究有力表明cd5carnk細胞包括在白血病細胞系及病患白血病樣品(圖32)(包括針對表達cd5之t-all、ptcl及b-細胞淋巴瘤)之深度抗腫瘤活性之生物性質(zhì)。

cd5carnk細胞證實活體內(nèi)強效抗白血病活性。

用于cd5cart細胞之類似策略，采用動物研究以測定cd5carnk細胞之活體內(nèi)抗腫瘤活性。對經(jīng)亞致死量照射之nsg小鼠靜脈內(nèi)注射1.0x10⁶個表現(xiàn)螢火蟲螢光素酶之ccrf-cem細胞以誘導可測量之腫瘤形成。ccrf-cem-luc+細胞注射后3天，對小鼠靜脈內(nèi)注射5x10⁶個cd5carnk細胞或載體對照組t細胞。在第4天重復此等注射，總計每只小鼠注射10x10⁶個t細胞。在第5天，對小鼠皮下注射redijectd-螢光素并經(jīng)受ivis成像以測量腫瘤負擔(圖33a)。將針對注射cd5carnk細胞之小鼠之平均光強度與針對注射載體對照組nk細胞之小鼠之平均光強度進行比較(圖33b)。在腫瘤注射后第5天，針對經(jīng)處理之小鼠，腫瘤負擔減少三分之二。成對t檢驗分析顯示兩組間極高之顯著性差異(p=0.0302)。此等活體內(nèi)資料指示當相較于載體對照組nk細胞時，cd5carnk細胞顯著以迅速方式減少注射ccrf-cem之nsg小鼠中之腫瘤負擔。

抗cd3嵌合抗原受體(cd3car)nk細胞高效溶解cd3陽性血液惡性腫瘤

實例

結(jié)果

cd3car之產(chǎn)生

該抗cd3分子是分子設計，其由結(jié)合cd28及4-1bb域融合至cd3ζ傳訊域以改善訊息轉(zhuǎn)導之單鏈可變片段(scfv)構(gòu)成使得其成為第三代car。強脾臟病灶形成病毒啟動子(sffv)是用于cd3car分子于nk細胞(nk-92)表面上之表達及并將cd8前導序列并入該構(gòu)筑體中。該抗cd3scfv是經(jīng)由cd8衍生之鉸鏈(h)及跨膜(tm)區(qū)連接至細胞內(nèi)傳訊域(圖34a)。然后將此cd3car構(gòu)筑體轉(zhuǎn)殖至慢病毒質(zhì)體中。cd3car之特征描述對經(jīng)cd3car慢病毒質(zhì)體及載體對照組質(zhì)體轉(zhuǎn)染之hek293-ft細胞進行蛋白印跡法分析。以抗cd3ζ單株抗體進行之免疫印跡法顯示cd3car-cd3ζ融合蛋白具有預期尺寸之條帶(圖34b)，而載體對照組蛋白沒有條帶。

使用nk-92細胞產(chǎn)生cd3carnk細胞

藉由流式細胞術分析測定cd3car之轉(zhuǎn)導效率。為針對cd3carnk細胞富集，使用經(jīng)螢光活化之細胞分選(fac)收獲最高表達之nk細胞。分選后，獲得具有相對高cd3car表達之nk細胞。流式細胞術分選后之cd3car之表表達穩(wěn)定于約30%之car表達以用于后續(xù)nk細胞擴增及冷凍保存中。

cd3carnk細胞有效溶解人類t-all細胞系為測定cd3carnk細胞之療效，吾人使用cd3+t-all細胞系(jurkat及ccrf-cem)進行共培養(yǎng)分析。jurkat及ccrf-cem細胞中之cd3陽性細胞針對cd3分別約80%及10%陽性。然后分選ccrf-cem細胞系之cd3+細胞中高度表達之cd3細胞，及經(jīng)分選之ccrf-cem細胞中之cd3表達為約50%。在與jurkat及ccrfcem細胞共培養(yǎng)期間，cd3carnk細胞顯示深度白血病細胞殺傷力(圖35)。在培養(yǎng)6小時下并在2:1之低e:t比率下，cd3carnk細胞有效溶解超過60%之jurkat細胞(圖35a)。吾人接著將經(jīng)相對較高表達之cd3ccrf-cem細胞(經(jīng)分選)之殺傷力與未經(jīng)分選之ccrf-cem細胞之殺傷力進行比較。該等cd3carnk細胞顯示更有效抵抗經(jīng)分選之ccrf-cem中之高cd3表達之群體而非較低cd3表達之未經(jīng)分選之ccrf-cem(圖35b)群體。

cd3carnk細胞有效消除人類樣品之cd3+白血病細胞

亦使用病患樣品測試cd3carnk細胞之殺傷力。兩個病患樣品之流式細胞術分析顯示強且均勻之cd3表達。如藉由流式細胞術分析，sezary癥候群病患樣品與cd3cart細胞之共培養(yǎng)有效導致在2:1之低e:t比率下約80%之白血病細胞溶解(圖36a)。病患樣品、未經(jīng)分選之ptcl與cd3carnk細胞共培養(yǎng)24小時導致cd3+惡性細胞之實際消除(圖36b)。cd3carnk細胞亦影響廣泛之cd3+群體。

cd3carnk細胞可耗盡正常t細胞。

經(jīng)gfp轉(zhuǎn)導之正常t細胞是用于共培養(yǎng)cd3carnk細胞。如圖37中所示，4或24小時培養(yǎng)后，cd3carnk細胞耗盡大部分正常t細胞。

cd3carnk細胞顯示活體內(nèi)深度抗白血病活性

為測定cd3carnk細胞之活體內(nèi)抗腫瘤療效，對經(jīng)亞致死量照射之nsg小鼠靜脈內(nèi)注射1.0x10⁶個表現(xiàn)螢光蟲螢光素酶之cd3陽性(~80%)jurkat細胞且在第3或第4天前偵測可測量之腫瘤形成。jurkat-luc+細胞注射后三天，向每只小鼠(每組6只)靜脈內(nèi)注射5x10⁶個cd3carnk細胞或載體對照組nk細胞。在第3、6、7及10天重復此等注射，總計每只小鼠注射25x10⁶個t細胞。在第4、7、9及13天，使小鼠經(jīng)受ivis成像以測量腫瘤負擔(圖38a)。兩只經(jīng)處理之小鼠因第13天之注射程序而死亡。將針對注射cd3carnk細胞之小鼠之平均光強度與針對注射載體對照組nk之小鼠之平均光強度進行比較(圖38b)。在初始延遲時間后，經(jīng)9天治療之小鼠之腫瘤負擔然后降至約低于三分之二及在第13天僅13%(圖38c)。成對t檢驗分析顯示兩組間高度顯著性差異(p=0.0137)。吾人斷定此等活體內(nèi)資料證實當與載體對照組nk細胞比較時，cd3carnk細胞顯著減少注射jurkat之nsg小鼠中之腫瘤負擔且延長該等nsg小鼠之存活。

crispr/cas核酸酶靶向表達于t或nk細胞上之cd2、cd3、cd5及cd7。

t或nk細胞顯示與白血病或淋巴瘤共用一些表面抗原諸如cd2、cd3、cd5及cd7。cd2、cd3、cd5及cd7可為t及nk細胞之良好靶，因為其等表達于大部分t細胞白血病/淋巴瘤中。

因此，當選定表面抗原cd2、cd3、cd5及cd7中之一者作為靶時，若用于產(chǎn)生car之t或nk細胞共用此抗原，則此抗原在該用于產(chǎn)生car之t或nk細胞中需要刪除或下調(diào)，以避免在cart或nk細胞群體內(nèi)自殺。

用于產(chǎn)生靶向t細胞淋巴瘤或t細胞白血病之cart或nk細胞之步驟描述于圖39中。用chopchop設計三對sgrna以靶向cd2、cd3、cd5及cd7。然后將基因特異性sgrna(圖40)轉(zhuǎn)殖至表達經(jīng)e2a自裂解連接子連接之人類cas9及嘌呤霉素抗性基因之慢病毒載體(lentiu6-sgrna-sffv-cas9-puro-wpre)中。該u6-sgrna匣位于cas9元件前面。

sgrna及cas9puro之表達是分別藉由u6啟動子及sffv啟動子驅(qū)動。

實例

結(jié)果

crispr/cas核酸酶靶向t細胞系上之cd5。

使用攜載基因特異性sgrna之慢病毒以轉(zhuǎn)導ccrf-cem及molt細胞。最初，在使用兩種不同兩個cdispr/cas9sgrna序列兩者之此等t細胞系中觀察到cd5表達之損失(圖41a及41c)。針對各細胞系選擇就cd5表達之損失而言最成功之群體，及此等細胞經(jīng)分選、正常擴增并發(fā)現(xiàn)具有>99%純度之cd45+及cd5-(圖41b及41d)。

crispr/cas核酸酶靶向t細胞系及nk細胞上之cd7。

使用攜載基因特異性sgrna之慢病毒以轉(zhuǎn)導ccrf-cem、molt細胞及nk細胞(圖42)。流式細胞術分析證實使用兩種不同sgrna之crispr/cas9方法之ccrf-cem及nk-92細胞中之cd7表達損失(圖42a及42b)。該群體(藉由籃圈及箭頭指示)是經(jīng)選擇以用于圖42b中之分選、擴增及分析。藉由流式細胞術分析所揭示之cd5表達損失亦見于使用以crispr/cas核酸酶靶向cd7之上述類似方法之nk-92細胞中(圖42c及42d)。擴增經(jīng)分選之cd7陰性nk-92細胞(圖42d)并用于產(chǎn)生cd7carnk細胞以消除cd7陽性白血病細胞。

cd7carnk^7--92細胞具有強抗白血病活性

cd7是表達于nk及t-all白血病細胞兩者中。為避免在cd7carnk-92群體內(nèi)自殺，首先需使cd7表達不活化。cd7缺乏型nk-92細胞(nk^7--92細胞)如(圖42d)中之描述產(chǎn)生并擴增。該等經(jīng)擴增之nk-92細胞用表達cd7car之慢病毒轉(zhuǎn)導。cd7car包括結(jié)合cd28及4-bb域融合至cd3ζ傳訊域之抗cd7scfv使得其成為第三代car。使用cd7carnk^7--92細胞以測試其等溶解表達cd7之白血病細胞之能力。如圖43中所示，cd7carnk^7--92細胞針對t-all細胞系ccrfcem顯示強效抗白血病活性。如藉由流式細胞術分析，在5:1之e:t比率下ccrf-cem細胞之共培養(yǎng)有效導致約50%之白血病細胞溶解(圖43a及43b)。

cd3多聚體蛋白復合體闡述于圖44中。該復合體包括cd3δ鏈、cd3γ鏈及兩個cd3ε鏈。此等鏈是與由αβ鏈構(gòu)成之t細胞受體(tcr)結(jié)合。

cd3car用于移植物抗宿主疾病(gvhd)。

cd3car是在干細胞移植之前或之后向病患投與。該病患是經(jīng)測試具有高含量的白細胞。

cd3car是在骨髓移植之前或之后向病患投與。該病患是經(jīng)測試具有高含量的白細胞。

cd3car是在組織移植之前或之后向病患投與。該病患是經(jīng)測試具有高含量的白細胞。

器官移植

cd3car是在器官移植外科手術之前向器官移植病患投與。該病患是經(jīng)測試具有器官排斥。測定下列組織學征象：(1)浸潤t細胞，在一些情況下藉由浸潤嗜伊紅白血球、血漿細胞及嗜中性白血球，尤其以計數(shù)比率完成，(2)組織解剖學之結(jié)構(gòu)性折中，其隨經(jīng)移植之組織類型而變化，及(3)對血管之損害。

cd3car是在器官移植外科手術之后向器官移植病患投與。該病患是經(jīng)測試具有器官排斥。測定下列組織學征象：(1)浸潤t細胞，在一些情況下藉由浸潤嗜伊紅白血球、血漿細胞及嗜中性白血球，尤其以計數(shù)比率完成，(2)組織解剖學之結(jié)構(gòu)性折中，其隨經(jīng)移植之組織類型而變化，及(3)對血管之損害。