用于產(chǎn)生CD8+調(diào)節(jié)性T細胞的致耐受性合成納米載體的制作方法
本申請是申請日為2012年4月27日、申請?zhí)枮椤?01280020294.3”、發(fā)明名稱為“用于產(chǎn)生cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的致耐受性合成納米載體”的中國專利申請的分案申請，原申請是國際申請pct/us2012/035405的中國國家階段申請。
相關申請
本申請根據(jù)美國法典第35篇第119條要求2011年4月29日提交的美國臨時申請61/480,946、2011年7月29日提交的美國臨時申請61/513,514、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,147、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,153、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,164、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,168、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,175、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,180、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,194、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,204、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,209、2011年9月6日提交的美國臨時申請61/531,215的權益，這些臨時申請各自的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。
本發(fā)明涉及給予產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的合成納米載體組合物的方法、以及有關組合物，這些合成納米載體組合物具有免疫抑制劑和一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位。這些方法允許通過apc有效攝取來使免疫應答向有利于發(fā)展產(chǎn)生對抗原特異的cd8+調(diào)節(jié)性t細胞免疫應答的方向轉(zhuǎn)變。
背景技術：
用于產(chǎn)生與所不希望的免疫應答相關聯(lián)的免疫抑制的常規(guī)策略是基于廣泛作用的免疫抑制性藥物。另外，為了維持免疫抑制，免疫抑制劑藥物療法通常是一個終生的命題。令人遺憾的是，使用廣泛作用的免疫抑制劑與嚴重副作用(如腫瘤、感染、腎毒性以及代謝紊亂)的風險相關聯(lián)。因此，新的免疫抑制劑療法將是有益的。
技術實現(xiàn)要素：
在一個方面，提供了一種包括向受試者給予一種組合物的方法，該組合物包含：(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)，其中該組合物處于有效在受試者中產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的量。在另一方面，提供了一種包括通過給予一種組合物而在受試者中產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的方法，該組合物包含：(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。在另一方面，提供了一種包括根據(jù)一個治療方案向受試者給予一種組合物的方法，該治療方法先前已經(jīng)顯示在一個或多個測試受試者中產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞；其中該組合物包含：(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。在一個實施例中，該第一群體和該第二群體是相同的群體。在另一個實施例中，該第一群體和該第二群體是不同的群體。
在另一個實施例中，該方法進一步包括提供或鑒定受試者。
在另一個實施例中，該抗原是一種治療性蛋白、一種自身抗原或一種過敏原，或與炎性疾病、自身免疫性疾病、器官或組織排斥或移植物抗宿主病相關聯(lián)。
在另一個實施例中，該方法進一步包括在給予該組合物之前和/或之后評定受試者中的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的產(chǎn)生。
在另一個實施例中，該受試者具有或正處于具有一種炎性疾病、一種自身免疫性疾病、一種過敏癥、器官或組織排斥或移植物抗宿主病的風險中。在另一個實施例中，該受試者已經(jīng)經(jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷移植。在另一個實施例中，該受試者具有或正處于具有針對一種治療性蛋白的一種所不希望的免疫應答的風險中，該治療性蛋白是正被給予或?qū)⒁唤o予該受試者的。
在另一個實施例中，該方法進一步包括給予一種可移植的移植物或治療性蛋白。在另一個實施例中，向該受試者給予一個或多個維持劑量的該組合物，該組合物包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體。
在另一個實施例中，該給予是通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、透粘膜、經(jīng)口、皮下、肺部、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)給予進行的。在另一個實施例中，通過吸入或靜脈內(nèi)、皮下或透粘膜給予來進行給予。在另一個實施例中，當該治療性蛋白被提供作為一個或多個細胞時，該可移植的移植物或治療性蛋白的給予是通過腸胃外、動脈內(nèi)注射、鼻內(nèi)或靜脈內(nèi)給予或通過注射至淋巴結(jié)或眼前房或通過局部給予至感興趣的器官或組織而進行的。
在另一個實施例中，該方法進一步包括收集所產(chǎn)生的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞。
在另一個實施例中，該apc免疫抑制劑包括一種抑制素、一種mtor抑制劑、一種tgf-β信號劑、一種皮質(zhì)類固醇、一種線粒體功能抑制劑、一種p38抑制劑、一種nf-κβ抑制劑、一種腺苷受體激動劑、一種前列腺素e2激動劑、一種磷酸二酯酶4抑制劑、一種hdac抑制劑或一種蛋白酶體抑制劑。在另一個實施例中，該mtor抑制劑是雷帕霉素或一種雷帕霉素類似物。
在另一個實施例中，平均在這些第一和/或第二群體的合成納米載體上的這些免疫抑制劑和/或抗原的負載是在0.0001％與50％之間(重量/重量)。在另一個實施例中，平均在這些第一和/或第二群體的合成納米載體上的這些免疫抑制劑和/或抗原的負載是在0.1％與10％之間。
在另一個實施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包含脂質(zhì)納米顆粒、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹枝狀化合物、巴基球、納米線、病毒樣顆粒或肽或蛋白質(zhì)顆粒。在另一個實施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包含脂質(zhì)納米顆粒。在另一個實施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包含脂質(zhì)體。在另一個實施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包含金屬納米顆粒。在另一個實施例中，這些金屬納米顆粒包含金納米顆粒。在另一個實施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包含聚合物納米顆粒。在另一個實施例中，該聚合物納米顆粒包含聚合物，該聚合物是一種非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在另一個實施例中，這些聚合物納米顆粒包含聚酯、與聚醚偶聯(lián)的聚酯、聚氨基酸、聚碳酸酯、聚縮醛、聚縮酮、多糖、聚乙基噁唑啉或聚乙烯亞胺。在另一個實施例中，該聚酯包含一種聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己酸內(nèi)酯。在另一個實施例中，這些聚合物納米顆粒包括聚酯以及與聚醚偶聯(lián)的聚酯。在另一個實施例中，該聚醚包括聚乙二醇或聚丙二醇。
在另一個實施例中，使用對該第一和/或第二群體的合成納米載體進行的動態(tài)光散射而獲得的粒度分布的平均值是大于100nm的直徑。在另一個實施例中，該直徑大于150nm。在另一個實施例中，該直徑大于200nm。在另一個實施例中，該直徑大于250nm。在另一個實施例中，該直徑大于300nm。在另一個實施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體的長寬比大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10。
在另一個實施例中，該方法進一步包括制造一種劑型，該劑型包含收集的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞。在另一個實施例中，該方法進一步包括制造可供受試者給予的收集的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞或劑型。在另一個實施例中，該方法進一步包括使一種可移植的移植物或治療性蛋白包括有收集的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞或劑型。
在另一方面，提供了一種組合物，該組合物包含根據(jù)所提供的任何方法產(chǎn)生的分離的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞。在另一個實施例中，該組合物進一步包含一種藥學上可接受的賦形劑。在另一個實施例中，該組合物進一步包含一種可移植的移植物或治療性蛋白。
在另一方面，提供了一種方法，該方法包括：(i)產(chǎn)生第一群體的合成納米載體并且(ii)產(chǎn)生第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。
在一個實施例中，該第一群體和第二群體是相同的群體。在另一個實施例中，該第一群體和第二群體是不同的群體。
在另一個實施例中，該方法進一步包括制造一種劑型，該劑型包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體。在另一個實施例中，該方法進一步包括制造一種組合物，該組合物包含可供受試者給予的這些第一群體和第二群體的合成納米載體或該劑型。在另一個實施例中，該方法進一步包括對使用一種組合物的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的產(chǎn)生進行評定，該組合物包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體。在另一個實施例中，該組合物處于有效產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的量。在另一個實施例中，產(chǎn)生的這些第一群體和第二群體的合成納米載體是如在此提供的任何這些組合物和方法中所定義的。
在另一方面，提供了一種用于生產(chǎn)組合物或劑型的工藝，該工藝包括以下步驟：(i)將第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)并且(ii)將第二群體的合成納米載體與一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。在一個實施例中，該工藝包括在此提供的任何方法中所定義的步驟。
在另一方面，提供了在任何這些方法中所定義的組合物和在此提供的多種組合物。
在另一方面，提供了一種具有在此提供的任何這些組合物的劑型。
在另一方面，提供了一種通過在此提供的任何方法或工藝可獲得的組合物或劑型。
在另一方面，在此提供的任何這些組合物或劑型可以用于治療或預防。
在另一方面，在此提供的任何這些組合物或劑型可以用于在受試者中產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的方法、治療或預防過敏癥、自身免疫性疾病、炎性疾病、器官或組織排斥或移植物抗宿主病或在此提供的任何方法中。
在另一方面，提供了一種在此提供的任何這些組合物或劑型用于制造一種藥劑的用途，該藥劑用于在受試者中產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的方法、治療或預防過敏癥、自身免疫性疾病、炎性疾病、器官或組織排斥或移植物抗宿主病或在此提供的任何方法中使用。
在另一方面，提供了一種組合物，該組合物包含用于治療或預防的分離的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞，所述分離的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞通過一種工藝可獲得，該工藝包括以下步驟：(a)通過給予一種組合物而在受試者中產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞，該組合物包含(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一種群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)；并且(b)收集所產(chǎn)生的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞。在另一個實施例中，該組合物是根據(jù)在此提供的任何方法所定義的。
在另一方面，提供了一種供在治療或預防中使用的組合物，該組合物包含：(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。在另一個實施例中，該組合物是根據(jù)在此提供的任何方法所定義的。
在另一方面，在此提供的任何這些組合物或劑型可以用于治療或預防。
在另一方面，在此提供的任何這些組合物或劑型可以用于促進一種致耐受性免疫應答或在受試者中產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞。
在另一方面，提供了一種在此提供的任何這些組合物或劑型用于制造一種藥劑的用途，該藥劑用于在促進一種致耐受性免疫應答或在受試者中產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞中使用。
在此提供的任何這些組合物和方法的一個實施例中，這些組合物基本上不包含b細胞表位。在此提供的任何這些組合物和方法的一個實施例中，這些組合物基本上不包含mhcii類限制性表位。
在此提供的任何這些組合物和方法的一個實施例中，作為包含以上提到的這些表位的蛋白質(zhì)的抗原可以與這些合成納米載體偶聯(lián)。在另一個實施例中，包含以上提到的這些表位、但包含位于這一個或多個表位的一端或兩端側(cè)面的另外氨基酸的多肽或肽可以與這些合成納米載體偶聯(lián)。在另一個實施例中，這些表位本身與這些合成納米載體偶聯(lián)。
附圖說明
圖1顯示了來自treg細胞的流式細胞檢測分析的結(jié)果。
圖2證明了使用本發(fā)明的一種組合物使抗原特異性cd8+treg細胞增加。
具體實施方式
在詳細描述本發(fā)明之前，應當理解本發(fā)明不局限于具體舉例說明的材料或工藝參數(shù)，因為這些當然可以變化。還應當理解在此使用的術語只是為了描述本發(fā)明的具體實施例的目的，并不旨在限制使用可替代的術語來描述本發(fā)明。
無論在前或在后，在此引用的所有公開物、專利以及專利申請，出于所有目的特此通過引用以其全文結(jié)合在此。
如在本說明書和所附權利要求中所使用，單數(shù)形式“一個(種)(a，an)”和“該(the)”包括復數(shù)指代物，除非內(nèi)容另外明確表明。例如，提及的“一種聚合物”包括兩種或更多種此類分子的混合物或單個聚合物種類的不同分子量的混合物；提及的“一種合成納米載體”包括兩種或更多種此類合成納米載體的混合物或多個此類合成納米載體；提及的“一種dna分子”包括兩種或更多種此類dna分子的混合物或多個此類dna分子；提及的“一種免疫抑制劑”包括兩種或更多種此類物質(zhì)的混合物或多個免疫抑制劑分子；諸如此類。
如在此所使用，術語“包括(comprise)”或其變體，如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”意在表明包括任何列舉的整體(例如，一個特點、要素、特征、特性、方法/工藝步驟或限制)或整體的組(例如，多個特點、多個要素、多個特征、多個特性、多種方法/多個工藝步驟或多個限制)，但是不排除任何其他整體或整體的組。因此，如在此所使用，術語“包括”是包含性的但是不排除另外的、未列舉的整體或方法/工藝步驟。
在此處提供的任何這些組合物和方法的多個實施例中，“包括”可用“基本上由......組成(consistingessentiallyof)”或“由......組成(consistingof)”來替代。短語“基本上由......組成”在此用來要求限定的一個或多個整體或步驟以及不實質(zhì)上影響所要求的發(fā)明的特征或功能的那些。如在此所使用，術語“組成(consisting)”用來表明僅存在所列舉的整體(例如，一個特點、要素、特征、特性、方法/工藝步驟或限制)或整體的組(例如，多個特點、多個要素、多個特征、多個特性、多種方法/多個工藝步驟或多個限制)。
a.前言
在此提供了合成納米載體組合物，這些合成納米載體組合物包含免疫抑制劑和一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位。此類組合物可以直接地由于這些表位的識別(如通過產(chǎn)生調(diào)節(jié)性細胞、使cd8+t細胞轉(zhuǎn)換成一種調(diào)節(jié)表型等等)，以及間接地通過細胞因子的產(chǎn)生來提供致耐受性免疫作用，這些細胞因子導致對其他免疫細胞和免疫系統(tǒng)的另外致耐受性作用。如在實例中所示，在此所提供的合成納米載體被成功地用來產(chǎn)生cd8+調(diào)節(jié)性t細胞。此類細胞的產(chǎn)生證明了本發(fā)明的這些組合物產(chǎn)生抗原特異性致耐受性免疫應答的能力，這些抗原特異性致耐受性免疫應答可以用于多種疾病、紊亂或病癥的治療或預防。另外，本發(fā)明的這些組合物可以通過例如允許靶向遞送至感興趣的免疫細胞而允許更具針對性的免疫作用。因此，這些組合物和方法可以以一種更有方向性的方式實現(xiàn)免疫抑制。這可以是有幫助于減少脫靶效應和/或毒性。
本發(fā)明是例如有用于促進受試者中的致耐受性免疫應答(例如，刺激cd8+調(diào)節(jié)性t細胞)，這些受試者具有或正處于具有一種過敏、自身免疫性疾病、一種炎性疾病、器官或組織排斥或移植物抗宿主病的風險中。本發(fā)明還有用于促進受試者中的致耐受性免疫應答，這些受試者已經(jīng)經(jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷移植。本發(fā)明還有用于促進受試者中的致耐受性免疫應答，這些受試者已經(jīng)接受、正在接受或?qū)⒁邮芤环N治療性蛋白，針對該治療性蛋白，會產(chǎn)生或預期會產(chǎn)生所不希望的免疫應答。在一些實施例中，本發(fā)明防止或抑制了所不希望的免疫應答，這些所不希望的免疫應答可以中和掉某些治療性處理的有益作用。
本發(fā)明的諸位發(fā)明人已經(jīng)意外地并且令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過實踐在此披露的本發(fā)明，可以克服以上指出的問題和限制。具體地說，諸位發(fā)明人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，提供誘導一種致耐受性免疫應答(例如，刺激cd8+調(diào)節(jié)性t細胞)的合成納米載體組合物和相關方法是有可能的。在此描述的這些方法包括向受試者給予產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的一種組合物，該組合物包含：(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。優(yōu)選地，該組合物處于有效在受試者中產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的量。在另一方面，提供了一種包括通過給予一種組合物而在受試者中產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的方法，該組合物包含：(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。在另一方面，提供了一種包括根據(jù)一個治療方案向受試者給予一種組合物的方法，該治療方法先前已經(jīng)顯示在一個或多個測試受試者中產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞；其中，該組合物包含：(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。
還可以向在此所提供的這些受試者給予可移植的移植物或治療性蛋白?？梢栽诮o予這些第一和第二群體的合成納米載體之前、與此同時或在此之后向受試者給予此類組合物。在多個實施例中，提供的這些組合物還可以作為一個或多個維持劑量向受試者給予。在此類實施例中，給予提供的這些組合物以使得所希望的免疫應答(例如，產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞)的產(chǎn)生維持一定長度的時間。在此其他地方提供了此類長度的時間的例子。在另一方面，提供了一種組合物，該組合物包含根據(jù)所提供的任何方法產(chǎn)生的分離的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞。在又另一個方面，還提供了包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體的這些組合物。
在另一方面，提供了在此任何這些組合物的多種劑型?？梢韵蚴茉囌呓o予此類劑型，如有抗原特異性致耐受性免疫應答(如抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞產(chǎn)生)需要的受試者。
在又另一個方面，提供了一種(i)產(chǎn)生第一群體的合成納米載體并且(ii)產(chǎn)生第二群體的合成納米載體的方法，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。優(yōu)選地，該組合物有效在受試者中產(chǎn)生cd8+調(diào)節(jié)性t細胞。在一個實施例中，該方法進一步包括產(chǎn)生一種劑型，該劑型包含這些第一和第二群體的合成納米載體。在另一個實施例中，該方法進一步包括確保這些第二群體的合成納米載體包含多個mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位。在一個實施例中，可以通過將一種全長蛋白與這些合成納米載體偶聯(lián)來進行此種確保。在另一個實施例中，可以通過將包含這些表位的一種多肽或肽與這些合成納米載體偶聯(lián)來進行此種確保。在另一個實施例中，該方法進一步包括確保這些第二群體的合成納米載體基本上不包含mhcii類限制性表位。在另一個實施例中，該方法進一步包括確保這些第二群體的合成納米載體基本上不包含b細胞表位。在此其他地方提供了多種用于測試合成納米載體的方法以確定這些免疫應答可以產(chǎn)生。此類方法連同本領域普通技術人員已知的其他方法可以用來確保這些合成納米載體與所希望的表位偶聯(lián)。在再另一個實施例中，該方法進一步包括對使用一種組合物或劑型的cd8+調(diào)節(jié)性t細胞(例如，在受試者中)的產(chǎn)生進行評定，該組合物或劑型包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體。在又另一個實施例中，該方法進一步包括制造一種組合物，該組合物包含可供受試者給予的這些第一群體和第二群體的合成納米載體或該劑型。
在另一方面，還提供了通過在此提供的任何方法產(chǎn)生的這些組合物或劑型。
現(xiàn)在，在以下將更詳細地描述本發(fā)明。
b.定義
“給予(administering)”或“給予(administration)”意指以藥理學上有用的方式向受試者提供一種物質(zhì)。
“過敏原”是在受試者中可以引起一種所不希望的(例如，1型超敏性)免疫應答(即，過敏性應答或反應)的任何物質(zhì)。過敏原包括，但不限于：植物過敏原(例如，花粉、豚草過敏原)、昆蟲過敏原、昆蟲叮咬過敏原(例如，蜜蜂叮咬過敏原)、動物過敏原(例如，寵物過敏原，如動物皮屑或貓feld1抗原)、膠乳過敏原、霉菌過敏原、真菌過敏原、化妝品過敏原、藥物過敏原、食物過敏原、灰塵、昆蟲毒液、病毒、細菌，等等。食物過敏原包括，但不限于：牛奶過敏原、雞蛋過敏原、堅果過敏原(例如，花生或樹堅果過敏原，等等(例如，胡桃、腰果，等等))、魚過敏原、貝類過敏原、大豆過敏原、豆類過敏原、種子過敏原、以及小麥過敏原。昆蟲叮咬過敏原包括作為或與蜜蜂叮咬、胡蜂叮咬、馬蜂叮咬、黃蜂叮咬等等相關聯(lián)的過敏原。昆蟲過敏原還包括屋塵螨過敏原(例如，derp1抗原)以及蟑螂過敏原。藥物過敏原包括作為或與抗生素、nsaid、麻醉劑等等相關聯(lián)的過敏原?；ǚ圻^敏原包括草過敏原、樹過敏原、雜草過敏原、花過敏原，等等?？梢杂迷诖颂峁┑娜魏芜@些組合物和方法對發(fā)展或正處于發(fā)展針對在此提供的任何這些過敏原的一種所不希望的免疫應答的風險的受試者進行治療?？梢杂锰峁┑娜魏芜@些組合物和方法治療的受試者還包括具有或正處于具有對提供的任何這些過敏原過敏的風險的那些受試者。
在此又稱為“過敏性病癥”的“過敏”是其中針對一種物質(zhì)存在所不希望的(例如，1型超敏性)免疫應答(即，過敏性應答或反應)的任何病癥。此類物質(zhì)在此被稱為過敏原。過敏或過敏性病癥包括但不限于：過敏性哮喘、枯草熱、蕁麻疹、濕疹、植物過敏、蜜蜂叮咬過敏、寵物過敏、乳膠過敏、霉菌過敏、化妝品過敏、食物過敏、過敏性鼻炎或鼻傷風、局部過敏反應、過敏性反應、特應性皮炎、超敏反應、以及其他過敏性病癥。過敏性反應可以是針對任何過敏原的一種免疫反應的結(jié)果。在一些實施例中，過敏癥是一種食物過敏。食物過敏包括但不限于：牛奶過敏、雞蛋過敏、堅果過敏、魚過敏、貝類過敏、大豆過敏、或小麥過敏。
在用于向受試者給予的一種組合物或劑型的背景下的“有效的量”是指在該受試者中產(chǎn)生一個或多個所希望的免疫應答(例如，產(chǎn)生cd8+調(diào)節(jié)性t細胞)的該組合物或劑型的量。因此，在一些實施例中，有效的量是產(chǎn)生這樣一種所希望的免疫應答的在此提供的一種組合物的任何量。此量可以出于體外或體內(nèi)目的。對于體內(nèi)目的而言，該量可以是臨床醫(yī)師將認為對有抗原特異性耐受需要的受試者可以具有臨床益處的量。此類受試者包括已經(jīng)具有或正處于具有一種炎性疾病、一種自身免疫性疾病、一種過敏癥、器官或組織排斥、或移植物抗宿主病的風險的那些受試者。此類受試者還包括已經(jīng)經(jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷移植的那些受試者。此類受試者進一步包括針對一種治療性蛋白已經(jīng)經(jīng)歷、正在經(jīng)歷或預期會經(jīng)歷一種致耐受性免疫應答的那些受試者。其他受試者包括在此其他地方描述的那些受試者。
有效的量可以僅涉及降低所不希望的免疫應答的水平，雖然在一些實施例中，它涉及完全防止所不希望的免疫應答。有效的量還可以涉及延遲所不希望的免疫應答的發(fā)生。有效的量還可以涉及產(chǎn)生一種希望的免疫應答。有效的量還可以是產(chǎn)生希望的治療終點或希望的治療結(jié)果的在此提供的一種組合物的量。有效的量優(yōu)選在受試者中導致針對抗原的一種致耐受性免疫應答?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法來監(jiān)測任何上述免疫應答的實現(xiàn)。
在提供的任何這些組合物和方法的一些實施例中，該有效的量是其中使所希望的免疫應答在該受試者中持續(xù)至少1周、至少2周、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少9個月、至少1年、至少2年、至少5年、或更長時間的量。在提供的任何這些組合物和方法的其他實施例中，該有效的量是產(chǎn)生一種可測量的所希望的免疫應答(例如，可測量的免疫應答(例如，針對一種特異性抗原)降低)持續(xù)至少1周、至少2周、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少9個月、至少1年、至少2年、至少5年、或更長時間的量。
當然，有效的量將取決于正被治療的具體受試者；病癥、疾病或紊亂的嚴重性；個體患者的參數(shù)，包括年齡、身體狀況、體型以及體重；治療持續(xù)時間；同步療法(如果有)的性質(zhì)；特定的給藥途徑、以及健康執(zhí)業(yè)醫(yī)師的知識和專業(yè)技能內(nèi)的類似因素。這些因素對于本領域的普通技術人員是熟知的，并且可以僅用常規(guī)實驗方法解決。通常優(yōu)選的是使用最大劑量，即根據(jù)正確醫(yī)學判斷的最高安全劑量。然而，本領域普通技術人員應當理解，出于醫(yī)學原因、心理原因或幾乎任何其他原因，患者可以堅持較低劑量或耐受劑量。
通常，本發(fā)明的這些組合物中的免疫抑制劑和/或抗原的劑量可以在從約10μg/kg至約100,000μg/kg的范圍內(nèi)。在一些實施例中，這些劑量可以在從約0.1mg/kg至約100mg/kg的范圍內(nèi)。在再其他的實施例中，這些劑量可以在從約0.1mg/kg至約25mg/kg、約25mg/kg至約50mg/kg、約50mg/kg至約75mg/kg、或約75mg/kg至約100mg/kg的范圍內(nèi)。可替代地，可以基于提供所希望的量的免疫抑制劑和/或抗原的合成納米載體的數(shù)目給予該劑量。例如，有用的劑量包括每劑量大于106個、107個、108個、109個或1010個合成納米載體。有用的劑量的其他例子包括每劑量從約1×106至約1×1010個、約1×107至約1×109個、或約1×108至約1×109個合成納米載體。
“抗原”意指b細胞抗原或t細胞抗原?！翱乖囊环N或多種類型”意指共享相同的、或基本上相同的抗原特性的分子。在一些實施例中，抗原可以是蛋白質(zhì)類、多肽類、肽類、脂蛋白類、糖脂類、多核苷酸類、多糖類，或被包含或表達在細胞中。在一些實施例中，例如當沒有很好定義或表征這些抗原時，這些抗原可以被包含在細胞或組織制品、細胞碎片、細胞外來體、條件培養(yǎng)基等等之內(nèi)?？梢栽谂c受試者暴露于引起所不希望的免疫應答者相同的形式中將一種抗原與這些合成納米載體組合，但該抗原還可以是其片段或衍生物。然而，當為一個片段或衍生物時，針對這一受試者所遭遇的這種形式的所希望的免疫應答是使用所提供的這些組合物和方法的優(yōu)選結(jié)果。
“抗原特異性”是指由該抗原或其部分的存在引起的、或產(chǎn)生特異性地識別或結(jié)合該抗原的多種分子的任何免疫應答。例如，在該免疫應答是抗原特異性抗體產(chǎn)生的情況下，產(chǎn)生了特異性地結(jié)合該抗原的多種抗體。作為另一個實例，在該免疫應答是抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞增殖和/或活性的情況下，該增殖和/或活性可以由單獨地或與mhc分子復合的該抗原或其部分的識別引起。
與在此提供的一種疾病、紊亂或病癥“相關的抗原”是可以針對該疾病、紊亂或病癥、作為其結(jié)果、或與其結(jié)合而產(chǎn)生所不希望的免疫應答的抗原；可以產(chǎn)生該疾病、紊亂或病癥(或其癥狀或影響)的病因的抗原；和/或可以產(chǎn)生作為該疾病、紊亂或病癥的癥狀、結(jié)果或影響的所不希望的免疫應答的抗原。優(yōu)選地，在一些實施例中，在此提供的這些組合物和方法中使用與疾病、紊亂或病癥等等相關聯(lián)的抗原將導致針對該抗原和/或通過其或在其中或其上表達該抗原的細胞的一種致耐受性免疫應答。這些抗原可以處于與具有該疾病、紊亂或病癥的受試者中所表達的相同形式，但還可以是其片段或衍生物。然而，當為一個片段或衍生物時，針對這一受試者中表達的這種形式的一種希望的免疫應答是使用提供的這些組合物和方法的優(yōu)選結(jié)果。
在一個實施例中，該抗原是與一種炎性疾病、自身免疫疾病、器官或組織排斥或移植物抗宿主病相關聯(lián)的抗原。此類抗原包括：自身抗原，如髓磷脂堿性蛋白、膠原(例如，11型膠原)、人軟骨gp39、嗜鉻粒蛋白a、gp130-raps、蛋白脂質(zhì)蛋白、纖維蛋白、核蛋白、核仁蛋白(例如，小核仁蛋白)、甲狀腺刺激因子受體、組蛋白、糖蛋白gp70、核糖體蛋白、丙酮酸脫氫酶、脫氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶、毛囊抗原、人原肌球蛋白同工型5、線粒體蛋白、胰腺β-細胞蛋白、髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白、胰島素、谷氨酸脫羧酶(gad)、谷蛋白、以及其片段或衍生物。以下在表1中提供了其他的自身抗原。
抗原還可以包括與器官或組織排斥相關聯(lián)的那些抗原。此類抗原的實例包括，但不限于：來自同種異體細胞的抗原，例如來自一種同種異體細胞提取物的抗原；和來自其他細胞的抗原，如內(nèi)皮細胞抗原。
抗原還包括與一種過敏相關聯(lián)的那些抗原。此類抗原包括在此其他地方描述的這些過敏原。
抗原還包括與一種可移植的移植物相關聯(lián)的那些抗原。此類抗原與一種可移植的移植物、或具有一種可移植的移植物的接受者中的一種所不希望的免疫應答相關聯(lián)，該所不希望的免疫應答由于將該可移植的移植物引入到該接受者中而產(chǎn)生，該可移植的移植物可以被呈遞用于由免疫系統(tǒng)的細胞識別并且該可移植的移植物可以產(chǎn)生一種所不希望的免疫應答。移植抗原包括與器官或組織排斥或移植物抗宿主病相關聯(lián)的那些抗原。可以從一種生物材料的細胞中或從與一種可移植的移植物相關的信息中獲得或衍生出移植抗原。移植抗原通常包括蛋白質(zhì)類、多肽類、肽類、脂蛋白類、糖脂類、多核苷酸類，或被包含或表達在細胞中。與一種可移植的移植物相關的信息是關于可以用來獲得或衍生出移植抗原的一種可移植的移植物的任何信息。此類信息包括關于將要預期會存在于一種可移植的移植物的細胞之中或之上的抗原的信息，例如像序列信息；抗原和/或它們的mhci、mhcii或b細胞呈遞限制的類型或種類。此類信息還包括關于以下各項的信息：可移植的移植物的類型(例如，自身移植物、同種移植物、異種移植物)、該移植物的分子組成和細胞組成、該移植物衍生自其中或該移植物有待被移植至其上的身體位置(例如，全部或部分的器官、皮膚、骨骼、神經(jīng)、腱、神經(jīng)元、血管、脂肪、角膜等等)。
抗原還包括與一種治療性蛋白相關聯(lián)的抗原，這些抗原可以被呈遞用于由免疫系統(tǒng)的細胞識別并且這些抗原可以產(chǎn)生針對該治療性蛋白的一3所不希望的免疫應答。治療性蛋白抗原通常包括蛋白質(zhì)類、多肽類、肽類、脂蛋白類，或被包含在或表達在細胞之中、通過細胞表達或表達在細胞之上。
抗原可以是完全定義或表征的抗原。然而，在一些實施例中，抗原不是完全定義或表征的。因此，抗原還包括被包含在細胞或組織制品、細胞碎片、細胞外來體或條件培養(yǎng)基內(nèi)的那些抗原，并且在一些實施例中可以處于此種形式遞送。
“評定一種免疫應答”是指對體外或體內(nèi)一種免疫應答的水平、存在或不存在、降低、增加等等進行的任何測量或測定?？梢栽趶氖茉囌咧蝎@得的一個或多個樣品上進行此類測量或測定。可以用在此提供的任何方法或本領域中已知的其他方法來進行此類評定。
“處于風險中”的受試者是健康執(zhí)業(yè)醫(yī)師認為其具有患上在此所提供的疾病、紊亂或病癥的機會的受試者、或健康執(zhí)業(yè)醫(yī)師認為其具有經(jīng)歷在此所提供的所不希望的免疫應答的機會的受試者。
“自身免疫性疾病”是其中免疫系統(tǒng)針對自身(例如，一個或多個自身抗原)發(fā)動一種所不希望的免疫應答的任何疾病。在一些實施例中，自身免疫性疾病包含作為自身靶向免疫應答的一部分的對身體細胞的異常破壞。在一些實施例中，自身破壞表現(xiàn)為一個器官(例如，結(jié)腸或胰腺)的功能失常。在此其他地方描述了自身免疫性疾病的實例。本領域普通技術人員將已知另外的自身免疫性疾病，并且本發(fā)明在此方面不受限制。
如在此所使用的“平均值”是指算術平均值，除非另外指出。
“b細胞抗原”意指觸發(fā)b細胞中的免疫應答的任何抗原(例如，由b細胞或其上的受體特異性地識別的抗原)。在一些實施例中，作為t細胞抗原的抗原也是一種b細胞抗原。在其他實施例中，該t細胞抗原并不也是一種b細胞抗原。b細胞抗原包括但不限于蛋白質(zhì)類、肽類、小分子、以及碳水化合物。在一些實施例中，該b細胞抗原包含一種非蛋白質(zhì)抗原(即，不是一種蛋白質(zhì)或肽抗原)。在一些實施例中，該b細胞抗原包含一種自身抗原。在其他實施例中，該b細胞抗原從一種過敏原、自身抗原、治療性蛋白、或可移植的移植物中獲得或衍生出。
“同時”意指以時間相關的、優(yōu)選地時間充分相關的方式向受試者給予兩種或更多種物質(zhì)，以便提供對免疫應答的調(diào)節(jié)。在多個實施例中，可以通過以相同劑型給予兩種或更多種物質(zhì)而發(fā)生同時給予。在其他實施例中，同時給予可以涵蓋以不同劑型、但在指定時間段內(nèi)、優(yōu)選在1個月內(nèi)、更優(yōu)選在1周內(nèi)、再更優(yōu)選在1天內(nèi)并且甚至更優(yōu)選在1小時內(nèi)給予兩種或更多種物質(zhì)。
“偶聯(lián)(couple)”或“偶聯(lián)(coupled)”或“偶聯(lián)(couples)”(諸如此類)意指使一個實體(例如一個部分)與另一個實體在化學上結(jié)合。在一些實施例中，偶聯(lián)是共價的，這意味著該偶聯(lián)是在兩個實體之間存在共價鍵的背景下發(fā)生的。在非共價的實施例中，通過非共價相互作用介導非共價偶聯(lián)，這些非共價相互作用包括但不限于：電荷相互作用、親和相互作用、金屬配位、物理吸附、主-客體相互作用、疏水相互作用、tt堆積相互作用、氫鍵相互作用、范德華相互作用、磁相互作用、靜電相互作用、偶極-偶極相互作用、和/或其組合。在多個實施例中，封裝是偶聯(lián)的一種形式。
“衍生的”意指由一種材料或與一種材料相關的信息制備的，而不是從該材料“獲得的”。此類材料可以是直接取自一種生物材料的多種材料的實質(zhì)性地改變或加工的形式。此類材料還包括從與一種生物材料相關的信息所產(chǎn)生的材料。
“劑型”意指在一種適用于向受試者給予的介質(zhì)、載體、媒介物或裝置中的藥理學和/或免疫學活性材料。
“封裝”意指將物質(zhì)的至少一個部分封閉在合成納米載體內(nèi)。在一些實施例中，一種物質(zhì)被完全封閉在合成納米載體內(nèi)。在其他實施例中，被封裝的物質(zhì)的大部分或全部不暴露于該合成納米載體外的局部環(huán)境。在其他實施例中，不超過50％、40％、30％、20％、10％或5％(重量/重量)暴露于該局部環(huán)境。封裝不同于吸附，吸附是將物質(zhì)的大部分或全部置于合成納米載體的表面上，并且使得該物質(zhì)暴露于該合成納米載體外的局部環(huán)境。
“表位”，又稱為抗原決定簇，是由免疫系統(tǒng)，確切地由例如抗體、b細胞、或t細胞識別的抗原部分。如在此所使用，“mhci類限制性表位”是通過在有核細胞上發(fā)現(xiàn)的mhci類分子呈遞給免疫細胞的表位?！癿hcii類限制性表位”是通過在抗原呈遞細胞(apc)上(例如，在專職性抗原呈遞免疫細胞上，如在巨噬細胞、b細胞以及樹突狀細胞上，或在非造血細胞如肝細胞上)發(fā)現(xiàn)的mhcii類分子呈遞給免疫細胞的表位?！癰細胞表位”是由抗體或b細胞識別的分子結(jié)構。在一些實施例中，該表位本身是一種抗原。
許多表位是本領域普通技術人員已知的，并且根據(jù)本發(fā)明的一些方面適合的示例性表位包括但不限于列在免疫表位數(shù)據(jù)庫(www.immuneepitope.org，維塔·r(vitar)、札瑞布斯基·l(zarebskil)、格林鮑姆·ja(greenbaumja)、埃馬米·h(emamih)、霍夫·i(hoofi)、薩利姆·n(salimin)、達美樂·r(damler)、賽特·a(settea)、彼得斯·b(petersb)，免疫表位數(shù)據(jù)庫2.0(theimmuneepitopedatabase2.0)，核酸研究(nucleicacidsres)，2010年1月；38(數(shù)據(jù)庫發(fā)行號)：d854-62；該免疫表位數(shù)據(jù)庫的全部內(nèi)容以及2011年8月的iedb2.4版本的所有數(shù)據(jù)庫條目，并且具體地說在其中披露的所有表位通過引用結(jié)合在此)中的那些。還可以使用公開可獲得的算法來鑒定表位，這些算法例如在以下文獻中描述的算法：王平(wangp)、西德尼·j(sidneyj)、金姆·y(kimy)、賽特·a(settea)、倫德·o(lundo)、尼耳森·m(nielsenm)、彼得斯·b(petersb)，2010，用于hladr、dp以及dq分子的肽結(jié)合預測(peptidebindingpredictionsforhladr，dpanddqmolecules)，bmc生物信息學(bmcbioinformatics)2010，11：568；王平(wangp)、西德尼·j(sidneyj)、道·c(dowc)、莫斯·b(mothéb)、賽特·a(settea)、彼得斯·b(petersb)，2008，mhcii類肽結(jié)合預測的系統(tǒng)性評定和一致方法的評估(asystematicassessmentofmhcclassiipeptidebindingpredictionsandevaluationofaconsensusapproach)，plos計算生物學(ploscomputbiol.)4(4)：e1000048；尼耳森·m(nielsenm)、倫德·o(lundo)，2009，nn-比對.用于mhcii類肽結(jié)合預測的基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡的比對算法(nn-align.anartificialneuralnetwork-basedalignmentalgorithmformhcclassiipeptidebindingprediction)，bmc生物信息學(bmcbioinformatics)，10：296；尼耳森·m(nielsenm)、倫德高·c(lundegaardc)、倫德·o(lundo)，2007，使用新穎的穩(wěn)定化矩陣比對方法smm-比對預測mhcii類結(jié)合親和性(predictionofmhcclassiibindingaffinityusingsmm-align，anovelstabilizationmatrixalignmentmethod)，bmc生物信息學(bmcbioinformatics)，8：238；裴·hh(buihh)、西德尼·j(sidneyj)、彼得斯·b(petersb)、薩塞默塞·m(sathiamurthym)、真一·a(sinichia)、潘頓·ka(purtonka)、莫斯·br(mothébr)、奇薩利·fv(chisarifv)、沃特金斯·di(watkinsdi)、賽特·a(settea)，2005，免疫遺傳學(immunogenetics)，57：304-314；斯圖爾尼奧洛·t(sturniolot)、博諾·e(bonoe)、丁·j(dingj)、拉德里查尼·l(raddrizzanil)、圖雷西·o(tuerecio)、薩因·u(sahinu)、布雷桑勒·m(braxenthalerm)、加利亞西·f(gallazzif)、普羅狄·mp(prottimp)、西尼加利亞·f(sinigagliaf)、漢姆莫·j(hammerj)，1999，使用dna微陣列和虛擬的hlaii類矩陣產(chǎn)生組織特異性的和混雜的hla配體數(shù)據(jù)庫(generationoftissue-specificandpromiscuoushlaliganddatabasesusingdnamicroarraysandvirtualhlaclassiimatrices)，自然生物技術(natbiotechnol)，17(6)：555-561；尼耳森·m(nielsenm)、倫德高·c(lundegaardc)、沃林·p(worningp)、拉爾莫勒·sl(lauemollersl)、拉姆博特·k(lamberthk)、布斯·s(buuss)、布魯納克·s(brunaks)、倫德·o(lundo).2003.使用具有新穎序列表示的神經(jīng)網(wǎng)絡可靠預測t細胞表位(reliablepredictionoft-cellepitopesusingneuralnetworkswithnovelsequencerepresentations)，蛋白質(zhì)科學(proteinsci)12：1007-1017；裴·hh(buihh)、西德尼·j(sidneyj)、彼得斯·b(petersb)、薩塞默塞·m(sathiamurthym)、真一·a(sinichia)、潘頓·ka(purtonka)、莫斯·br(mothebr)、奇薩利·fv(chisarifv)、沃特金斯·di(watkinsdi)、賽特·a(settea)，2005，特異性mhc結(jié)合預測工具的自動產(chǎn)生和評估：arb矩陣應用(automatedgenerationandevaluationofspecificmhcbindingpredictivetools：arbmatrixapplications)，免疫遺傳學(immunogenetics)57：304-314；彼得斯·b(petersb)、賽特·a(settea)，2005，使用穩(wěn)定化的矩陣方法產(chǎn)生描述生物過程的序列特異性的定量模型(generatingquantitativemodelsdescribingthesequencespecificityofbiologicalprocesseswiththestabilizedmatrixmethod)，bmc生物信息學(bmcbioinformatics)6：132；周·py(choupy)、法斯曼·gd(fasmangd)，1978，由氨基酸序列預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(predictionofthesecondarystructureofproteinsfromtheiraminoacidsequence)，酶學相關領域分子生物學進展(advenzymolrelatareasmolbiol)47：45-148；伊米妮·ea(eminiea)、休斯·jv(hughesjv)、珀洛·ds(perlowds)、博格·j(bogerj)，1985，由病毒特異性的合成肽誘導中和甲型肝炎病毒的抗體(inductionofhepatitisavirus-neutralizingantibodybyavirus-specificsyntheticpeptide)，病毒學期刊(jvirol)55：836-839；卡普拉斯·pa(karpluspa)、舒爾茲·ge(schulzge)，1985，預測蛋白質(zhì)中的鏈柔性(predictionofchainflexibilityinproteins)，自然科學(naturwissenschaften)72：212-213；科拉斯卡·as(kolaskaras)、頓考恩卡·pc(tongaonkarpc)，1990，用于預測蛋白質(zhì)抗原上的抗原決定簇的半經(jīng)驗方法(asemi-empiricalmethodforpredictionofantigenicdeterminantsonproteinantigens)，febs快報(febslett)276：172-174；帕克·jm(parkerjm)、郭·d(guod)、霍奇斯·rs(hodgesrs)，1986，來源于高效液相色譜法肽保留數(shù)據(jù)的新型親水性標度：預測的表面殘基與抗原性和源自x射線的可接近位點的相關性(newhydrophilicityscalederivedfromhigh-performanceliquidchromatographypeptideretentiondata：correlationofpredictedsurfaceresidueswithantigenicityandx-ray-derivedaccessiblesites)，生物化學(biochemistry)25：5425-5432；拉森·je(larsenje)、倫德·o(lundo)、尼耳森·m(nielsenm)，2006，用于預測線性b細胞表位的改進方法(improvedmethodforpredictinglinearb-cellepitopes)，免疫研究(immunomeres)2：2；波諾馬連科·jv(ponomarenkojv)、伯恩·pe(bournepe).2007.抗體-蛋白質(zhì)相互作用：基準數(shù)據(jù)集和預測工具評估(antibody-proteininteractions：benchmarkdatasetsandpredictiontoolsevaluation)，bmc結(jié)構生物學(bmcstructbiol)7：64；哈斯特安德森·p(hasteandersenp)、尼耳森·m(nielsenm)、倫德·o(lundo)，2006，使用蛋白質(zhì)3d結(jié)構預測不連續(xù)b細胞表位中的殘基(predictionofresiduesindiscontinuousb-cellepitopesusingprotein3dstructures)，蛋白質(zhì)科學(proteinsci)15：2558-2567；波諾馬連科·jv(ponomarenkojv)、裴·h(buih)、李·w(liw)、福斯德·n(fussedern)、伯恩·pe(bournepe)、賽特settea、彼得斯·b(petersb)，2008，ellipro：用于預測抗體表位的新型基于結(jié)構的工具(ellipro：anewstructure-basedtoolforthepredictionofantibodyepitopes)，bmc生物信息學(bmcbioinformatics)9：514；尼耳森·m(nielsenm)、倫德高·c(lundegaardc)、布里加·t(blichert)、彼得斯·b(petersb)、賽特·a(settea)、賈斯特遜·s(justesens)、布斯·s(buuss)以及倫德·o(lundo)，2008，plos計算生物學(ploscomputbiol.)4(7)e1000107，肽結(jié)合具有已知序列的任何hla-dr分子的定量預測：netmhciipan(quantitativepredictionsofpeptidebindingtoanyhla-drmoleculeofknownsequence：netmhciipan)；這些文獻各自的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此以用于披露用于鑒定表位的方法和算法。
在此提供的表位的其他實例包括如seqidnos：1-943所提供的mhci類限制性表位、mhcii類限制性表位以及b細胞表位中的任何一種。不希望受任何具體理論束縛，mhci類限制性表位包括在seqidnos：1-186中列出的那些，mhcii類限制性表位包括在seqidnos：187-537中列出的那些，并且b細胞表位包括在seqidnos：538-943中列出的那些。這些表位包括mhci類限制性自身抗原、過敏原的mhcii類限制性表位以及自身抗原和過敏原的b細胞表位。
“產(chǎn)生”意指本身直接地或間接地(如但不限于，通過依賴某人的語言或行為采取行動的不相關的第三方)引起一種行為(如一種免疫應答(例如，一種致耐受性免疫應答))發(fā)生。
“鑒定”是允許臨床醫(yī)師將受試者識別為可能從在此提供的這些方法和組合物中獲益者的任何行為或一系列行為。優(yōu)選地，鑒定的受試者是對如在此所提供的一種致耐受性免疫應答有需要者。該行為或一系列行為可以是本身直接地或間接地，如但不限于，通過依賴某人的語言或行為采取行動的不相關的第三方。
“免疫抑制劑”意指引起apc具有免疫抑制(例如，致耐受性作用)的一種化合物。免疫抑制性作用通常是指由apc產(chǎn)生或表達細胞因子或其他因子，該產(chǎn)生或表達降低、抑制或防止所不希望的免疫應答、或促進所希望的免疫應答。當該apc對識別由該apc呈遞的抗原的免疫細胞產(chǎn)生一種免疫抑制性作用時，該免疫抑制性作用被稱為是對呈遞的抗原特異的。此種作用在此還稱為一種致耐受性作用。不受任何具體理論束縛，認為該免疫抑制性或致耐受性作用是該免疫抑制劑被遞送至該apc上的結(jié)果，優(yōu)選在一種抗原(例如，一種給予的抗原或已經(jīng)存在于體內(nèi)的抗原)存在的情況下。因此，該免疫抑制劑包括針對一種抗原提供致耐受性免疫應答的多種化合物，這些化合物可以或不可以被提供在相同的組合物或不同的組合物中。在一個實施例中，該免疫抑制劑是引起apc促進一個或多個免疫效應細胞中的調(diào)節(jié)表型的免疫抑制劑。例如，可以通過產(chǎn)生、誘導、刺激或募集treg細胞等等，對該調(diào)節(jié)表型進行表征。這可以是cd8+t細胞或b細胞轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)表型的結(jié)果。這還可以是在其他免疫細胞(如cd4+t細胞、巨噬細胞以及inkt細胞)中誘導foxp3的結(jié)果。在一個實施例中，該免疫抑制劑是在apc加工抗原之后影響該apc的應答的免疫抑制劑。在另一個實施例中，該免疫抑制劑不是干擾抗原加工的免疫抑制劑。在一個另外的實施例中，該免疫抑制劑不是一種細胞凋亡信號傳導分子。在另一個實施例中，該免疫抑制劑不是一種磷脂。
免疫抑制劑包括但不限于：抑制素；mtor抑制劑，如雷帕霉素或一種雷帕霉素類似物；tgf-β信號劑；tgf-β受體激動劑；組蛋白去乙酰化酶抑制劑，如曲古抑菌素a(trichostatina)；皮質(zhì)類固醇類；線粒體功能抑制劑，如魚藤酮(rotenone)；p38抑制劑；nf-κβ抑制劑，如6bio、地塞米松(dexamethasone)、tcpa-1、ikkvii；腺苷受體激動劑；前列腺素e2激動劑(pge2)，如米索前列醇(misoprostol)；磷酸二酯酶抑制劑，如磷酸二酯酶4抑制劑(pde4)，如咯利普蘭(rolipram)；蛋白酶體抑制劑；激酶抑制劑；g-蛋白偶聯(lián)受體激動劑；g-蛋白偶聯(lián)受體拮抗劑；糖皮質(zhì)激素類；類視黃醇類；細胞因子抑制劑；細胞因子受體抑制劑；細胞因子受體活化劑；過氧化物酶體增殖物激活受體拮抗劑；過氧化物酶體增殖物激活受體激動劑；組蛋白去乙?；敢种苿?；鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)抑制劑；磷酸酶抑制劑；pi3kb抑制劑，如tgx-221；自噬(autophagy)抑制劑，如3-甲基腺嘌呤；芳香烴受體抑制劑；蛋白酶體抑制劑i(psi)；以及氧化的atp，如p2x受體阻斷劑。免疫抑制劑還包括ido、維生素d3、環(huán)孢霉素類(如環(huán)孢霉素a)、芳香烴受體抑制劑、白藜蘆醇、硫唑嘌呤(aza)、6-巰基嘌呤(6-mp)、6-硫鳥嘌呤(6-tg)、fk506、薩菲菌素a(sanglifehrina)、沙美特羅(salmeterol)、嗎替麥考酚酯(mycophenolatemofetil)(mmf)、阿司匹林以及其他cox抑制劑、尼氟酸、雌三醇以及雷公藤甲素(triptolide)。在多個實施例中，該免疫抑制劑可以包含在此提供的任何藥劑(agent)。
該免疫抑制劑可以是對apc直接提供免疫抑制(例如，致耐受性)作用的一種化合物，或該免疫抑制劑可以是間接(即，在給予之后以某種方式被加工之后)提供免疫抑制(例如，致耐受性)作用的一種化合物。因此，免疫抑制劑包括在此提供的任何化合物的前藥形式。
免疫抑制劑還可以包括編碼在此提供的產(chǎn)生免疫抑制(例如，致耐受性)免疫應答的這些肽、多肽或蛋白質(zhì)的核酸。因此，在多個實施例中，該免疫抑制劑是編碼一種產(chǎn)生免疫抑制(例如，致耐受性)免疫應答的肽、多肽或蛋白質(zhì)的核酸，并且該免疫抑制劑是與合成納米載體偶聯(lián)的核酸。
該核酸可以是dna或rna，如mrna。在多個實施例中，這些發(fā)明的組合物包含一種互補物，如一種全長互補物，或在此提供的任何這些核酸的一種簡并物(由于遺傳密碼的簡并性)。在多個實施例中，該核酸是一種表達載體，當轉(zhuǎn)染至細胞系中時，該表達載體可以被轉(zhuǎn)錄。在多個實施例中，該表達載體可以包含除其他之外的質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、或腺病毒?？梢允褂脴藴实姆肿由飳W方法來分離或合成核酸，例如通過使用聚合酶鏈反應來產(chǎn)生核酸片段，然后對該核酸片段進行純化并且克隆至表達載體中。對本發(fā)明的實踐有用的另外技術可以在2007年約翰威立國際出版公司(johnwileyandsons，inc.)的現(xiàn)代分子生物學實驗方案(currentprotocolsinmolecularbiology)；分子克?。簩嶒炇沂謨?第三版)薩姆布魯克(molecularcloning：alaboratorymanual(thirdedition)josephsambrook)，彼得麥卡勒姆癌癥研究所(petermaccallumcancerinstitute)，墨爾本(melbourne)，澳大利亞(australia)；大衛(wèi)羅素(davidrussell)，德克薩斯大學西南醫(yī)學中心(universityoftexassouthwesternmedicalcenter)，達拉斯(dallas)，冷泉港(coldspringharbor)中找到。
在多個實施例中，在此提供的這些免疫抑制劑與合成納米載體偶聯(lián)。在多個優(yōu)選的實施例中，該免疫抑制劑是除了構成該合成納米載體的結(jié)構的材料之外的一種成分。例如，在一個實施例中，在該合成納米載體由一種或多種聚合物構成的情況下，該免疫抑制劑是除了這一種或多種聚合物之外的并且與其偶聯(lián)的一種化合物。作為另一個實例，在一個實施例中，在該合成納米載體由一種或多種脂質(zhì)構成的情況下，該免疫抑制劑又是除了這一種或多種脂質(zhì)之外的并且與其偶聯(lián)的。在多個實施例中，例如在該合成納米載體的材料也產(chǎn)生一種免疫抑制(例如，致耐受性)作用的情況下，該免疫抑制劑是產(chǎn)生一種免疫抑制(例如，致耐受性)作用的、除了該合成納米載體材料之外而存在的一種成分。
其他示例性的免疫抑制劑包括但不限于：小分子藥物、天然產(chǎn)物、抗體(例如，對抗cd20、cd3、cd4的抗體)、基于生物制劑的藥物、基于碳水化合物的藥物、納米顆粒、脂質(zhì)體、rnai、反義核酸、適體、氨甲蝶呤、nsaid；芬戈莫德(fingolimod)；那他珠單抗(natalizumab)；阿侖單抗(alemtuzumab)；抗cd3；他克莫司(tacrolimus)(fk506)等等。另外的免疫抑制劑對于本領域的技術人員是已知的，并且本發(fā)明在此方面不受限制。
“炎性疾病”意指其中發(fā)生所不希望的炎癥的任何疾病、紊亂或病癥。
免疫抑制劑或抗原的“負載”是基于整個合成納米載體中的材料的總重量，與合成納米載體偶聯(lián)的該免疫抑制劑或抗原的量(重量/重量)。通常，該負載被計算為在一個群體的合成納米載體上的平均值。在一個實施例中，平均在這些第一群體的合成納米載體上的該免疫抑制劑的負載是在0.0001％與50％之間。在另一個實施例中，平均在這些第一和/或第二群體的合成納米載體上的該抗原的負載是在0.0001％與50％之間。在又另一個實施例中，該免疫抑制劑和/或抗原的負載是在0.01％與20％之間。在一個另外的實施例中，該免疫抑制劑和/或抗原的負載是在0.1％與10％之間。在再一個另外的實施例中，該免疫抑制劑和/或抗原的負載是在1％與10％之間。在又另一個實施例中，平均在一個群體的合成納米載體上的該免疫抑制劑和/或該抗原的負載是至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、或至少20％。在又一個另外的實施例中，平均在一個群體的合成納米載體上的該免疫抑制劑和/或該抗原的負載是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％。在以上這些實施例中的一些實施例中，平均在一個群體的合成納米載體上的該免疫抑制劑和/或該抗原的負載是不大于25％。在多個實施例中，如實例中所描述對該負載進行計算。
在提供的任何這些組合物和方法的多個實施例中，可以如下計算該負載：收集近似3mg的合成納米載體，并且離心以使上清液與合成納米載體沉淀分離。向該沉淀添加乙腈，并且對樣品進行超聲處理并離心以去除任何不溶的材料。在rp-hplc上注射該上清液和沉淀，并且在278nm處讀取吸光度。該沉淀中的μg用來計算％包載(負載)，在上清液和沉淀中的μg用來計算回收的總μg。
“維持劑量”是指在初始劑量已經(jīng)在受試者中產(chǎn)生一種免疫抑制(例如，致耐受性)應答之后，為了持續(xù)所希望的免疫抑制(例如，致耐受性)應答而向受試者給予的劑量。維持劑量例如可以是維持在該初始劑量之后所實現(xiàn)的致耐受性作用、防止該受試者中的所不希望的免疫應答、或防止該受試者變?yōu)樘幱诮?jīng)歷所不希望的免疫應答(包括所不希望的水平的免疫應答)風險的受試者的劑量。在一些實施例中，該維持劑量是足以持續(xù)適當水平的所希望的免疫應答的劑量。在一些實施例中，該維持劑量是足以維持適當水平的cd8+調(diào)節(jié)性t細胞數(shù)目和/或活性或抵抗用導致所不希望的免疫應答的一種藥劑(agent)的激發(fā)的量。
“合成納米載體的最大尺寸”意指沿著該合成納米載體的任何軸線測量的納米載體的最大尺寸?！昂铣杉{米載體的最小尺寸”意指沿著該合成納米載體的任何軸線測量的合成納米載體的最小尺寸。例如，對于球形合成納米載體而言，合成納米載體的最大和最小尺寸將是基本上相同的，并且將是該合成納米載體的直徑的大小。類似地，針對立方形合成納米載體，合成納米載體的最小尺寸將是它的高度、寬度或長度中最小的，而合成納米載體的最大尺寸將是它的高度、寬度或長度中最大的。在一個實施例中，基于樣品中的合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少90％的這些合成納米載體的最小尺寸等于或大于100nm。在一個實施例中，基于樣品中的合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少90％的這些合成納米載體的最大尺寸等于或小于5μm。優(yōu)選地，基于樣品中的合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少90％的這些合成納米載體的最小尺寸大于110nm、更優(yōu)選地大于120nm、更優(yōu)選地大于130nm、并且還更優(yōu)選地大于150nm。發(fā)明的合成納米載體的最大尺寸與最小尺寸的長寬比可以取決于實施例而變化。例如，這些合成納米載體的最大尺寸與最小尺寸的長寬比可以從1∶1至1,000,000∶1、優(yōu)選地從1∶1至100,000∶1、更優(yōu)選地從1∶1至10,000∶1、更優(yōu)選地從1∶1至1000∶1、再更優(yōu)選地從1∶1至100∶1、并且又更優(yōu)選地從1∶1至10∶1變化。優(yōu)選地，基于樣品中的合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少90％的這些合成納米載體的最大尺寸等于或小于3μm、更優(yōu)選地等于或小于2μm、更優(yōu)選地等于或小于1μm、更優(yōu)選地等于或小于800nm、更優(yōu)選地等于或小于600nm、并且還更優(yōu)選地等于或小于500nm。在多個優(yōu)選的實施例中，基于樣品中的合成納米載體的總數(shù)，樣品中的至少75％、優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少90％的這些合成納米載體的最小尺寸等于或大于100nm、更優(yōu)選地等于或大于120nm、更優(yōu)選地等于或大于130nm、更優(yōu)選地等于或大于140nm、并且還更優(yōu)選地等于或大于150nm。通過將這些合成納米載體懸浮在一種液體(通常是水性)介質(zhì)中，并且使用動態(tài)光散射(dls)(例如使用一臺brookhavenzetapals儀器)，獲得合成納米載體尺寸(例如，直徑)的測量值。例如，可以將具有合成納米載體的懸浮液從水性緩沖劑中稀釋到純化水中以達到近似0.01至0.1mg/ml的最終的合成納米載體懸浮液濃度?？梢栽谝粋€適合的比色皿中直接制備稀釋的懸浮液，或轉(zhuǎn)移至該比色皿中以用于dls分析。然后可以將該比色皿置于dls中，允許其平衡至受控的溫度，并且然后掃描充分的時間以在介質(zhì)的粘度和樣品的折射率的適當輸入的基礎上獲得穩(wěn)定且可再現(xiàn)的分布。然后報告有效直徑，或該分布的平均值。合成納米載體的“尺寸”或“大小”或“直徑”意指使用動態(tài)光散射獲得的粒度分布的平均值。
“mhc”是指主要組織相容性復合體，即在大多數(shù)脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的編碼mhc分子的一個大的基因組區(qū)或基因家族，這些mhc分子將被加工的蛋白質(zhì)的片段或表位展示在細胞表面上。細胞表面上的mhc：肽的呈遞允許通過免疫細胞(通常是t細胞)來監(jiān)視。存在兩大類mhc分子：i類和ii類。通常，i類mhc分子被發(fā)現(xiàn)在有核細胞上并且將肽呈遞給細胞毒性t細胞。ii類mhc分子被發(fā)現(xiàn)在某些免疫細胞(主要是巨噬細胞、b細胞以及樹突狀細胞)上，這些免疫細胞共同稱為專職性apc。mhc區(qū)中最有名的基因是編碼細胞表面上的抗原呈遞蛋白的亞型。在人類中，這些基因被稱為人白細胞抗原(hla)基因。
“非甲氧基封端的聚合物”意指具有以除了甲氧基之外的部分結(jié)束的至少一個末端的聚合物。在一些實施例中，該聚合物具有以除了甲氧基之外的部分結(jié)束的至少兩個末端。在其他實施例中，該聚合物不具有以甲氧基結(jié)束的末端?！胺羌籽趸舛说钠绽誓峥司酆衔铩币庵赋嗽趦蓚€末端處具有甲氧基的線性普朗尼克聚合物之外的一種聚合物。如在此所提供的聚合物納米顆?？梢园羌籽趸舛说木酆衔锘蚍羌籽趸舛说钠绽誓峥司酆衔?。
“獲得”意指直接從一種材料中取得并且基本上不用改變和/或加工而使用。
“藥學上可接受的賦形劑”意指與列舉的這些合成納米載體一起使用以配制本發(fā)明的組合物的藥理學上非活性的材料。藥物學上可接受的賦形劑包含本領域中已知的各種材料，包括但不限于糖類(如葡萄糖、乳糖，等)、防腐劑(如抗微生物劑)、復原助劑、著色劑、鹽水(如磷酸鹽緩沖鹽水)、以及緩沖劑。
“治療方案”是指針對受試者的一種或多種物質(zhì)的任何給藥方案。給藥方案可以包括給藥的量、頻率和/或方式。在一些實施例中，此種治療方案可以用來向一個或多個測試受試者給予本發(fā)明的一種或多種組合物。然后可以對這些測試受試者中的免疫應答進行評定，以便確定該治療方案是否對降低所不希望的免疫應答或產(chǎn)生所希望的免疫應答(例如，促進一種致耐受性作用)有效。還可以代替或除了前面提到的這些免疫應答之外，對任何其他治療性和/或預防性作用進行評定。可以使用在此提供的任何方法或本領域中已知的其他方法確定一個治療方案是否具有所希望的作用。例如，可以從已經(jīng)根據(jù)一個具體的治療方案而被給予了在此提供的一種組合物的受試者中獲得一群細胞，以便確定特異性免疫細胞、細胞因子、抗體等等是否被減少、產(chǎn)生、活化等等。用于檢測免疫細胞的存在和/或數(shù)目的有用方法包括但不限于流式細胞檢測方法(例如，facs)和免疫組織化學方法。用于免疫細胞標記的特異性染色的抗體和其他結(jié)合劑是商業(yè)上可獲得的。此類試劑盒典型地包括用于多種抗原的染色試劑，這些染色試劑允許來自異質(zhì)細胞群體的所希望的細胞群的基于facs的檢測、分離和/或定量。
“提供受試者”是引起臨床醫(yī)師與受試者接觸并且向其給予在此提供的一種組合物或在其上進行在此提供的一種方法的任何行為或一系列行為。優(yōu)選地，該受試者是對如在此所提供的一種致耐受性免疫應答有需要者。該行為或一系列行為可以是本身直接地或間接地，如但不限于，通過依賴某人的語言或行為采取行動的不相關的第三方。
“受試者”意指動物，包括溫血哺乳動物，如人類和靈長類；鳥類；家庭飼養(yǎng)或農(nóng)場動物，如貓、狗、綿羊、山羊、牛、馬以及豬；實驗動物，如小鼠、大鼠以及豚鼠；魚類；爬行動物；動物園和野生動物；等等。
“基本上沒有b細胞表位”是指不存在處于刺激b細胞應答的基本上活化的量的b細胞表位(在抗原的背景下是其本身、與一種載體結(jié)合、或與一種發(fā)明的組合物結(jié)合)。在多個實施例中，基本上沒有b細胞表位的一種組合物不會含有可測量的量的抗原的b細胞表位。在其他實施例中，此種組合物可以包含可測量的量的抗原的b細胞表位，但所述量并不有效產(chǎn)生一種可測量的b細胞免疫應答(在抗原的背景下是其本身、與一種載體結(jié)合、或與一種發(fā)明的組合物結(jié)合)，如抗原特異性的抗體產(chǎn)生或抗原特異性的b細胞增殖和/或活性，或并不有效產(chǎn)生一種顯著可測量的b細胞免疫應答(在抗原的背景下是其本身、與一種載體結(jié)合、或與一種發(fā)明的組合物結(jié)合)。在一些實施例中，一種顯著可測量的b細胞免疫應答是在受試者中產(chǎn)生或?qū)㈩A期會產(chǎn)生不利的臨床結(jié)果的b細胞免疫應答。在其他實施例中，一種顯著可測量的b細胞免疫應答是大于由對照抗原(例如，已知不包含該抗原的b細胞表位或不刺激b細胞免疫應答的抗原)產(chǎn)生的相同類型免疫應答(例如，抗原特異性的抗體產(chǎn)生或抗原特異性的b細胞增殖和/或活性)的水平的b細胞免疫應答。在一些實施例中，一種顯著可測量的b細胞免疫應答(如抗體滴度的測量值(例如，通過elisa))比由一種對照物(例如，對照抗原)產(chǎn)生的相同類型應答大2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍或更多倍。在其他實施例中，基本上沒有b細胞表位的一種組合物是產(chǎn)生很少至不產(chǎn)生抗原特異性抗體滴度的組合物(在抗原的背景下是其本身、與一種載體結(jié)合、或與一種發(fā)明的組合物結(jié)合)。此類組合物包括產(chǎn)生的抗體滴度(如ec50值)為小于500、400、300、200、100、50、40、30、20或10的那些。在一些實施例中，一種顯著可測量的b細胞免疫應答是比由一種對照物產(chǎn)生的相同類型應答大10％、25％、50％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍或更多倍的b細胞數(shù)目或增殖的測量值。用于測量b細胞應答的其他方法是本領域普通技術人員已知的。
在多個實施例中，為了確保一種組合物基本上不包含b細胞表位，對抗原進行選擇，使得這些抗原不包含用于與如在此所提供的這些合成納米載體偶聯(lián)的b細胞表位。在其他實施例中，為了確保一種組合物基本上不包含抗原的b細胞表位，產(chǎn)生與該抗原偶聯(lián)的合成納米載體并且測試其b細胞免疫應答(例如，抗原特異性的抗體產(chǎn)生、b細胞增殖和/或活性)。然后可以選擇展現(xiàn)出所希望的特性的組合物。在多個實施例中，在希望具有b細胞表位的一種組合物的情況下，可以以相似的方式對該組合物進行測試并且可以代替選擇展現(xiàn)出b細胞刺激或抗原特異性抗體產(chǎn)生的那些組合物。可替代地，可以選擇包含b細胞表位的全長蛋白用于與這些合成納米載體偶聯(lián)。
“基本上沒有mhcii類限制性表位”是指不存在處于刺激對抗原特異的cd4+t細胞免疫應答的基本上活化的量的mhcii類限制性表位(在抗原的背景下是其本身、與一種載體結(jié)合、或與一種發(fā)明的組合物結(jié)合)。在多個實施例中，基本上沒有mhcii類限制性表位的一種組合物不會含有可測量的量的抗原的mhcii類限制性表位。在其他實施例中，此種組合物可以包含可測量的量的抗原的mhcii類限制性表位，但所述量并不有效產(chǎn)生一種可測量的cd4+t細胞免疫應答(在抗原的背景下是其本身、與一種載體結(jié)合、或與一種發(fā)明的組合物結(jié)合)，或并不有效產(chǎn)生一種顯著可測量的cd4+t細胞免疫應答(在抗原的背景下是其本身、與一種載體結(jié)合、或與一種發(fā)明的組合物結(jié)合)。在一些實施例中，一種顯著可測量的cd4+t細胞免疫應答是在受試者中產(chǎn)生或?qū)㈩A期會產(chǎn)生不利的臨床結(jié)果的cd4+t細胞免疫應答。在其他實施例中，一種顯著可測量的cd4+t細胞免疫應答是大于由對照抗原(例如，已知不包含該抗原的mhcii類限制性表位或不刺激cd4+t細胞免疫應答的抗原)產(chǎn)生的相同類型的免疫應答的水平的cd4+t細胞免疫應答。在多個實施例中，這些組合物不包含mhcii類限制性表位(在抗原的背景下是其本身、與一種載體結(jié)合、或與一種發(fā)明的組合物結(jié)合)，這些mhcii類限制性表位產(chǎn)生抗原特異性cd4+t細胞免疫應答或其一種所不希望的水平。
在多個實施例中，如在此所提供，為了確保一種組合物基本上不包含mhcii類限制性表位，抗原被選擇為使得它們不包含用于負載在itdc、或其前體上的mhcii類限制性表位。在其他實施例中，為了確保一種組合物基本上不包含一種抗原的mhcii類限制性表位，產(chǎn)生這些itdc、或其前體并且測試cd4+t細胞免疫應答(例如，抗原特異性cd4+t細胞增殖和/或活性)。然后可以選擇展現(xiàn)出所希望的特性的組合物。在多個實施例中，在希望具有mhcii類限制性細胞表位的一種組合物的情況下，可以以相似的方式對該組合物進行測試并且可以代替選擇展現(xiàn)出cd4+t細胞刺激等等的那些組合物?？商娲?，可以選擇包含mhcii類限制性表位的全長蛋白用于與這些合成納米載體偶聯(lián)。
“一種或合成納米載體”意指在自然中未發(fā)現(xiàn)的、并且在大小上具有小于或等于5微米的至少一個尺寸的離散物體。白蛋白納米顆粒通常被包括為合成納米載體，然而在某些實施例中，這些合成納米載體并不包括白蛋白納米顆粒。在多個實施例中，發(fā)明的合成納米載體不包含殼聚糖。在其他實施例中，發(fā)明的合成納米載體不是基于脂質(zhì)的納米顆粒。在另外多個實施例中，發(fā)明的合成納米載體不包含磷脂。
一種合成納米載體可以是但不限于以下各項中的一種或多種：基于脂質(zhì)的納米顆粒(在此又稱為脂質(zhì)納米顆粒，即構成它們結(jié)構的大多數(shù)材料是脂質(zhì)的納米顆粒)、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹枝狀化合物、巴基球、納米線、病毒樣顆粒(即，主要由病毒結(jié)構蛋白構成、但不是感染性的或具有低感染性的顆粒)、基于肽或蛋白質(zhì)的顆粒(在此又稱為蛋白質(zhì)顆粒，即構成它們結(jié)構的大多數(shù)材料是肽或蛋白質(zhì)的顆粒)(如白蛋白納米顆粒)、和/或使用納米材料的組合而發(fā)展的納米顆粒(如脂質(zhì)-聚合物納米顆粒)。合成納米載體可以具有各種不同的形狀，包括但不局限于：球形、立方形、錐形、長方形、圓柱形、螺旋管形，等等。根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體包含一個或多個表面。可以適合用于實踐本發(fā)明的示例性的合成納米載體包括：(1)披露在格列夫(gref)等人的美國專利5,543,158中的可生物降解的納米顆粒、(2)薩爾茲曼(saltzman)等人的公開美國專利申請20060002852的聚合物納米顆粒、(3)戴斯蒙(desimone)等人的公開美國專利申請20090028910的光刻法構建(lithographicallyconstructed)的納米顆粒、(4)馮·安德里亞(vonandrian)等人的wo2009/051837的披露內(nèi)容、或(5)披露在佩納德斯(penades)等人的公開美國專利申請2008/0145441中的納米顆粒、(6)披露在德洛斯里奧斯(delosrios)等人的公開美國專利申請20090226525中的蛋白質(zhì)納米顆粒、(7)披露在西貝爾(sebbel)等人的公開美國專利申請20060222652中的病毒樣顆粒、(8)披露在巴赫曼(bachmann)等人的公開美國專利申請20060251677中的偶聯(lián)核酸的病毒樣顆粒、(9)披露在wo2010047839a1或wo2009106999a2中的病毒樣顆粒、(10)披露在p·保利賽利(p.paolicelli)等人的“可以高效結(jié)合并遞送病毒樣顆粒的表面修飾的基于plga的納米顆粒(surface-modifiedplga-basednanoparticlesthatcanefficientlyassociateanddelivervirus-likeparticles)”納米醫(yī)學(nanomedicine)，5(6)：843-853(2010)中的納米沉淀的納米顆粒、或(11)披露在美國公開號2002/0086049中的凋亡細胞、凋亡小體、或合成或半合成的模擬物。在多個實施例中，合成納米載體可以具有大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、或大于1∶10的長寬比。
具有等于或小于約100nm、優(yōu)選地等于或小于100nm的最小尺寸的根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體不包含具有使補體活化的羥基的表面，或可替代地包含主要由不是使補體活化的羥基的部分組成的表面。在一個優(yōu)選的實施例中，具有等于或小于約100nm、優(yōu)選地等于或小于100nm的最小尺寸的根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體不包含基本上使補體活化的表面，或可替代地包含主要由不是基本上使活化補體的部分組成的表面。在一個更優(yōu)選的實施例中，具有等于或小于約100nm、優(yōu)選地等于或小于100nm的最小尺寸的根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體不包含使補體活化的表面，或可替代地包含主要由不使補體活化的部分組成的表面。在多個實施例中，合成納米載體排除病毒樣顆粒。在多個實施例中，合成納米載體可以具有大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、或大于1∶10的長寬比。
“t細胞抗原”意指cd4+t細胞抗原或cd8+細胞抗原?！癱d4+t細胞抗原”意指由cd4+t細胞識別并且觸發(fā)cd4+t細胞中的免疫應答的任何抗原，例如經(jīng)由結(jié)合到ii類主要組織相容性復合體分子(mhc)上的抗原或其一部分的呈遞而被cd4+t細胞上的t細胞受體特異性地識別的抗原?！癱d8+t細胞抗原”意指由cd8+t細胞識別并且觸發(fā)cd8+t細胞中的免疫應答的任何抗原，例如經(jīng)由結(jié)合到i類主要組織相容性復合體分子(mhc)上的抗原或其一部分的呈遞而被cd8+t細胞上的t細胞受體特異性地識別的抗原。在一些實施例中，作為t細胞抗原的抗原也是一種b細胞抗原。在其他實施例中，該t細胞抗原并不也是一種b細胞抗原。t細胞抗原通常是蛋白類或肽類。
“治療性蛋白”是指可以向受試者給予并且具有一種治療性作用的任何蛋白質(zhì)或基于蛋白質(zhì)的療法。此類療法包括蛋白質(zhì)替代和蛋白質(zhì)補充療法。此類療法還包括給予外源或外來的蛋白質(zhì)、抗體療法、以及細胞或基于細胞的療法。治療性蛋白包括酶、酶輔助因子、激素、凝血因子、細胞因子、生長因子、單克隆抗體、以及多克隆抗體。在此在其他地方提供了其他治療性蛋白的實例?？梢栽诩毎?、之上或由細胞產(chǎn)生治療性蛋白，并且可以從此類細胞中獲得治療性蛋白、或以此類細胞的形式給予這些治療性蛋白。在多個實施例中，在以下細胞之中、之上或由以下細胞產(chǎn)生該治療性蛋白：哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞、細菌細胞、植物細胞、轉(zhuǎn)基因動物細胞、轉(zhuǎn)基因植物細胞等等。可以在此類細胞中重組地產(chǎn)生該治療性蛋白?？梢栽诓《巨D(zhuǎn)化的細胞之中、之上或由病毒轉(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生該治療性蛋白。還可以在自體細胞之中、之上或由自體細胞產(chǎn)生該治療性蛋白，這些自體細胞已經(jīng)被轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導或以另外的方式操縱以表達該治療性蛋白?？商娲?，可以作為一種核酸或通過將一種核酸引入到病毒、vlp、脂質(zhì)體等等中來給予該治療性蛋白?？商娲?，可以從此類形式中獲得該治療性蛋白并且作為該治療性蛋白本身而給予。因此，受試者包括已經(jīng)接受、正接受或?qū)⒁邮苌鲜鋈魏挝镔|(zhì)的任何受試者。此類受試者包括已經(jīng)接受、正接受或?qū)⒁邮芤韵赂黜椀氖茉囌撸夯蛑委?；已?jīng)被轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導或以另外的方式操縱以表達一種治療性蛋白、多肽或肽的自體細胞；或表達一種治療性蛋白、多肽或肽的細胞。
“治療性蛋白抗原”意指與一種治療性蛋白相關聯(lián)的抗原，該治療性蛋白可以是、或該治療性蛋白的一部分可以是被呈遞用于由免疫系統(tǒng)的細胞識別并且可以產(chǎn)生針對該治療性蛋白的一種所不希望的免疫應答(例如，產(chǎn)生治療性蛋白特異性的抗體)。治療性蛋白抗原通常包括蛋白質(zhì)類、多肽類、肽類、脂蛋白類，或被包含在或表達在細胞之中、之上或由細胞表達。
“致耐受性免疫應答”意指可以導致對一種抗原或表達此種抗原的一種細胞、組織、器官等等特異的免疫抑制的任何免疫應答。此類免疫應答包括對該抗原或表達此抗原的細胞、組織、器官等等特異的所不希望的免疫應答的任何降低、延遲或抑制。此類免疫應答還包括對該抗原或表達此抗原的細胞、組織、器官等等特異的所希望的免疫應答的任何刺激、產(chǎn)生、誘導、促進或募集。因此，致耐受性免疫應答包括不存在或降低針對抗原的所不希望的免疫應答，這可以通過抗原反應性細胞以及存在或促進抑制性細胞來介導。在此所提供的致耐受性免疫應答包括免疫耐受性。“產(chǎn)生致耐受性免疫應答”意指產(chǎn)生對一種抗原或表達此抗原的細胞、組織、器官等等特異的任何上述免疫應答。該致耐受性免疫應答可以是mhci類限制性呈遞和/或mhcii類限制性呈遞和/或b細胞呈遞和/或由cd1d進行的呈遞等等的結(jié)果。
致耐受性免疫應答包括cd4+t細胞、cd8+t細胞或b細胞增殖和/或活性的任何降低、延遲或抑制。致耐受性免疫應答還包括抗原特異性抗體產(chǎn)生的降低。致耐受性免疫應答還可以包括導致調(diào)節(jié)性細胞的刺激、誘導、產(chǎn)生或募集的任何應答，這些調(diào)節(jié)性細胞如cd4+treg細胞、cd8+treg細胞、breg細胞等等。在一些實施例中，該致耐受性免疫應答是導致轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N調(diào)節(jié)表型的致耐受性免疫應答，通過產(chǎn)生、誘導、刺激或募集調(diào)節(jié)性細胞對該調(diào)節(jié)表型進行表征。
致耐受性免疫應答還包括導致cd4+treg細胞和/或cd8+treg細胞的刺激、產(chǎn)生或募集的任何應答。cd4+treg細胞可以表達轉(zhuǎn)錄因子foxp3并且抑制炎性應答和自身免疫性炎性疾病(自身免疫性疾病中的人調(diào)節(jié)性t細胞(humanregulatorytcellsinautoimmunediseases)，科夫塔諾維奇·gl(cvetanovichgl)、哈弗·da(haflerda)，免疫學當前觀點(curropinimmunol.)2010年12月；22(6)：753-60，調(diào)節(jié)性t細胞和自身免疫性(regulatorytcellsandautoimmunity)，維拉·j(vilaj)、艾薩克·jd(isaacsjd)、安德森·ae(andersonae)，血液學當前觀點(curropinhematol.)2009年7月；16(4)：274-9)。此類細胞還抑制t細胞對b細胞的幫助并且誘導對自身和外來抗原的耐受性(基于foxp3+調(diào)節(jié)性t細胞活化和擴增的過敏和自身免疫性的治療性方法(therapeuticapproachestoallergyandautoimmunitybasedonfoxp3+regulatoryt-cellactivationandexpansion)，宮良·m(miyaram)、永·k(wingk)、板口·(sakaguchis)，過敏臨床免疫學期刊(jallergyclinimmunol)，2009年4月；123(4)：749-55)。當抗原由apc上的ii類蛋白質(zhì)呈遞時，cd4+treg細胞識別這種抗原。識別由i類(和qa-1)呈遞的抗原的cd8+treg細胞還可以抑制t細胞對b細胞的幫助，并且導致誘導對自身和外來抗原二者的耐受性的抗原特異性抑制的活化。已經(jīng)顯示，qa-1與cd8+treg細胞的相互作用的破壞可使免疫應答失調(diào)，并且導致自身抗體形成和自身免疫性致命性系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)展(金(kim)等人，自然(nature)，2010年9月16日，467(7313)：328-32)。還已經(jīng)顯示，cd8+treg細胞可抑制包括類風濕性關節(jié)炎和結(jié)腸炎的自身免疫性炎性疾病的模型(自身免疫性關節(jié)炎中的cd4+cd25+調(diào)節(jié)性t細胞(cd4+cd25+regulatorytcellsinautoimmunearthritis)，歐·s(ohs)、蘭金·al(rankinal)、卡頓·aj(catonaj)，免疫性評論(immunolrev)，2010年1月；233(1)：97-111，炎性腸病中的調(diào)節(jié)性t細胞(regulatorytcellsininflammatoryboweldisease)，博登·ek(bodenek)、斯奈普·sb(snappersb)，腸胃病學當前觀點(curropingastroenterol)，2008年11月；24(6)：733-41)。在一些實施例中，提供的這些組合物可以有效地產(chǎn)生兩種類型的應答(cd4+treg和cd8+treg)。在其他實施例中，可以在其他免疫細胞(如巨噬細胞、inkt細胞等等)中誘導foxp3，并且在此提供的這些組合物同樣可以產(chǎn)生這些應答中的一種或多種。
致耐受性免疫應答還包括但不限于：誘導調(diào)節(jié)性細胞因子，如treg細胞因子；誘導抑制性細胞因子；抑制炎性細胞因子(例如，il-4、il-1b、il-5、tnf-α、il-6、gm-csf、ifn-γ、il-2、il-9、il-12、il-17、il-18、il-21、il-22、il-23、m-csf、c反應性蛋白、急性期蛋白、趨化因子(例如，mcp-1、rantes、mip-1α、mip-1β、mig、itac或ip-10)；產(chǎn)生抗炎性細胞因子(例如，il-4、il-13、il-10等等)、趨化因子(例如，ccl-2、cxcl8)、蛋白酶(例如，mmp-3、mmp-9)、白三烯(例如，cyslt-1、cyslt-2)、前列腺素(例如，pge2)或組胺；抑制向th17、th1或th2免疫應答的極化；抑制效應細胞特異性的細胞因子：th17(例如，il-17、il-25)、th1(ifn-γ)、th2(例如，il-4、il-13)；抑制th1特異性、th2特異性或th17特異性的轉(zhuǎn)錄因子；抑制效應t細胞的增殖；誘導效應t細胞的凋亡；誘導致耐受性的樹突狀細胞特異性的基因；誘導foxp3表達；抑制ige誘導或ige介導的免疫應答；抑制抗體應答(例如，抗原特異性抗體的產(chǎn)生)；抑制t輔助細胞應答；產(chǎn)生tgf-β和/或il-10；抑制自身抗體的效應子功能(例如，細胞耗盡、細胞或組織損傷、或補體活化的抑制)；等等。
任何上述的免疫應答可以在一個或多個動物模型中體內(nèi)測量或可以在體外測量。本領域普通技術人員熟悉此類體內(nèi)或體外測量。所不希望的免疫應答或致耐受性免疫應答可以使用例如評定免疫細胞數(shù)目和/或功能的方法、四聚物分析、elispot、基于流式細胞檢測的細胞因子表達、細胞因子分泌的分析、細胞因子表達譜繪制、基因表達譜繪制、蛋白質(zhì)表達譜繪制、細胞表面標記的分析、基于pcr的免疫細胞受體基因用法的檢測(參見t·克雷(t.clay)等人，“用于監(jiān)測針對癌癥的主動免疫治療的細胞免疫應答的測定(assaysformonitoringcellularimmuneresponsetoactiveimmunotherapyofcancer)”臨床癌癥研究(clinicalcancerresearch)7：1127-1135(2001))等等來監(jiān)測。所不希望的免疫應答或致耐受性免疫應答還可以使用例如評定血漿或血清中的蛋白質(zhì)水平的方法、免疫細胞增殖和/或功能測定等等來監(jiān)測。在一些實施例中，致耐受性免疫應答可以通過評定foxp3的誘導來監(jiān)測。另外，在實例中更詳細地描述了具體方法。
優(yōu)選地，致耐受性免疫應答導致對在此描述的疾病、紊亂或病癥的發(fā)展、進展或病理的抑制?？梢杂镁哂写祟惣膊 ⑽蓙y或病癥的動物模型來測量這些發(fā)明的組合物是否可以導致對在此描述的疾病、紊亂或病癥的發(fā)展、進展或病理的抑制。在一些實施例中，可以通過確定臨床終點、臨床功效、臨床癥狀、疾病生物標記和/或臨床得分來評定所不希望的免疫應答的降低或致耐受性免疫應答的產(chǎn)生。還可以用診斷性測試評定所不希望的免疫應答或致耐受性免疫應答，以便評定在此所提供的疾病、紊亂或病癥的存在或不存在?？梢赃M一步通過測量受試者中的治療性蛋白水平和/或功能的方法來評定所不希望或所希望的免疫應答。在多個實施例中，用于監(jiān)測或評定所不希望的過敏性應答的方法包括通過皮膚反應性和/或過敏原特異性的抗體產(chǎn)生評定受試者中的一種過敏性應答。
在一些實施例中，可以在給予在此提供的合成納米載體的一種組合物之前和/或在給予一種可移植的移植物或治療性蛋白或暴露于一種過敏原之前監(jiān)測或評定受試者中的一種所不希望的免疫應答或一種致耐受性免疫應答的產(chǎn)生。在其他實施例中，可以在給予在此提供的合成納米載體的一種組合物之后和/或在給予一種可移植的移植物或治療性蛋白或暴露于一種過敏原之后評定一種所不希望的免疫應答或致耐受性免疫應答的產(chǎn)生。在一些實施例中，在給予合成納米載體的該組合物之后、但在給予一種可移植的移植物或治療性蛋白或暴露于一種過敏原之前完成該評定。在其他實施例中，在給予一種可移植的移植物或治療性蛋白或暴露于一種過敏原之后、但在給予該組合物之前完成該評定。在再其他的實施例中，在給予這些合成納米載體和給予一種可移植的移植物或治療性蛋白或暴露于一種過敏原二者之前進行該評定，而在又其他的實施例中，在給予合成納米載體和給予一種可移植的移植物或治療性蛋白或暴露于一種過敏原二者之后進行該評定。在另外的多個實施例中，在給予這些合成納米載體和/或給予一種可移植的移植物或治療性蛋白或暴露于一種過敏原之前和之后都進行該評定。在再其他的實施例中，在受試者上進行多于一次的該評定，以便確定令人希望的免疫狀態(tài)被維持在該受試者中，該受試者如具有或正處于具有一種炎性疾病、一種自身免疫疾病、一種過敏癥、器官或組織排斥或移植物抗宿主病的風險的受試者。其他受試者包括已經(jīng)經(jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷移植的那些受試者以及已經(jīng)接受、正在接受或?qū)⒁邮芤环N治療性蛋白的那些受試者，這些受試者已經(jīng)經(jīng)歷、正在經(jīng)歷或預期會經(jīng)歷一種針對該治療性蛋白的所不希望的免疫應答。
可以通過測定一個或多個抗體滴度來評定抗體應答。“抗體滴度”意指一種可測量水平的抗體產(chǎn)生。用于測量抗體滴度的方法是本領域中已知的并且包括酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)。在多個實施例中，該抗體應答可以被定量為例如抗體的數(shù)目、抗體的濃度、或滴度。這些值可以是絕對的或它們可以是相對的。用于定量抗體應答的測定包括抗體捕獲測定、酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、抑制液相吸附測定(inhibitionliquidphaseabsorptionassay，ilpaa)、火箭免疫電泳(rocketimmunoelectrophoresis，rie)測定、以及線狀免疫電泳(lineimmunoelectrophoresis，lie)測定。當比較一種抗體應答與另一種抗體應答時，優(yōu)選地使用相同類型的定量值(例如，滴度)和測量方法(例如，elisa)進行該比較。
用于測量抗體滴度的elisa方法(例如，一種典型的夾心elisa)可以由以下步驟組成：(i)制備一種elisa-板包被材料，使得感興趣的抗體靶標與一種底物聚合物或其他適合的材料偶聯(lián)；(ii)在一種水溶液(如pbs)中制備該包被材料，并且將該包被材料溶液遞送至一個多孔板的孔中用于使該包被層過夜沉積在該多孔板上；(iii)用洗滌緩沖液(如含0.05％吐溫-20的pbs)徹底洗滌該多孔板以去除過量的包被材料；(iv)通過施加一種稀釋劑溶液(如含10％胎牛血清的pbs)來封閉該板的非特異性結(jié)合；(v)用洗滌緩沖液將該封閉/稀釋劑溶液從該板上洗滌下來；(vi)根據(jù)需要用稀釋劑對含有抗體和適當標準品(陽性對照)的一種或多種血清樣品進行稀釋，以獲得適當?shù)厥筫lisa應答飽和的濃度；(vii)在該多孔板上對這些血漿樣品進行連續(xù)稀釋，這樣以涵蓋適用于產(chǎn)生elisa應答曲線的濃度范圍；(viii)孵育該板以提供抗體-靶標結(jié)合；(ix)用洗滌緩沖液洗滌該板以去除未結(jié)合抗原的抗體；(x)添加適當濃度的處于相同稀釋劑中的一種第二檢測抗體，如能夠結(jié)合第一抗體的一種偶聯(lián)生物素的檢測抗體；(xi)用所施加的該檢測抗體孵育該板，隨后用洗滌緩沖液進行洗滌；(xii)添加將與生物素化的抗體上發(fā)現(xiàn)的結(jié)合生物素的酶(如鏈霉親和素-hrp(辣根過氧化物酶))并且進行孵育；(xiii)洗滌該多孔板；(xiv)將一種或多種底物(如tmb溶液)添加至該板上；(xv)當顯色完全時施加一種終止溶液(如2n硫酸)；(xvi)在針對該底物的特定波長下讀取這些板孔的光密度(450nm減去570nm處的讀數(shù))；(xvi)對數(shù)據(jù)應用一個適合的多參數(shù)曲線擬合，并且將半最大有效濃度(ec50)定義為達到這些板標準品的半最大值od值時的曲線上的濃度。
“可移植的移植物”是指可以給予受試者的一種生物材料，如細胞、組織以及器官(全部或部分地)?？梢浦驳囊浦参锟梢允抢缫环N生物材料(如器官、組織、皮膚、骨骼、神經(jīng)、腱、神經(jīng)元、血管、脂肪、角膜、多能細胞、分化細胞(在體內(nèi)或體外獲得或衍生的)等等的自身移植物、同種異體移植物、或異種移植物。在一些實施例中，可移植的移植物例如由軟骨、骨骼、細胞外基質(zhì)、或膠原基質(zhì)形成?？梢浦驳囊浦参镞€可以是單細胞、細胞懸浮液以及可以被移植的組織和器官中的細胞?？梢浦驳募毎湫偷鼐哂幸环N治療功能，例如在受體受試者中缺乏或減退的功能?？梢浦驳募毎囊恍┓窍拗菩詫嵗铅录毎⒏渭毎?、造血干細胞、神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞、或髓鞘細胞?？梢浦驳募毎梢允俏葱揎椀募毎?，例如從供體受試者獲得的并且可用于移植而無需任何遺傳修飾或表觀遺傳修飾的細胞。在其他實施例中，可移植的細胞可以是被修飾的細胞，例如由具有遺傳缺陷的受試者中獲得的細胞，其中該遺傳缺陷已得到糾正；或由重新編程的細胞衍生出的細胞，例如從由受試者獲得的細胞中衍生出的分化細胞。
“移植”是指將一個可移植的移植物轉(zhuǎn)移(移動)到一個受體受試者(例如，從供體受試者、從體外來源(例如分化的自體或異體天然的或誘導的多能細胞))和/或從同一受試者的一個身體部位轉(zhuǎn)移(移動)到另一身體部位的過程。
“所不希望的免疫應答”是指由暴露于抗原而引起的、促進或加劇在此提供的疾病、紊亂或病癥(或其癥狀)的任何所不希望的免疫應答，或是在此提供的疾病、紊亂或病癥的癥狀。此類免疫應答通常對受試者的健康具有負面影響或表明對受試者的健康的負面影響。在此提供了用于測試免疫應答的方法，或這些方法以另外的方式是本領域普通技術人員已知的。
c.發(fā)明組合物
在此提供了致耐受性方法、以及有關組合物，這些方法包括給予導致cd8+調(diào)節(jié)性t細胞產(chǎn)生的合成納米載體組合物，這些合成納米載體組合物包含免疫抑制劑和mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位。提供的這些方法還可以包括給予多種治療性蛋白和/或可移植的移植物。因此，提供的這些組合物還可以包括這些治療性蛋白和/或可移植的移植物。可以向受試者給予這些組合物，在這些受試者中一種致耐受性免疫應答(例如，產(chǎn)生cd8+調(diào)節(jié)性t細胞)是所希望的。此類受試者包括具有或正處于具有一種炎性疾病、一種自身免疫性疾病、一種過敏癥、器官或組織排斥、或移植物抗宿主病的風險的那些受試者。此類受試者還包括已經(jīng)被、正在被或?qū)⒁唤o予一種治療性蛋白的那些受試者，該受試者已經(jīng)經(jīng)歷或預期會經(jīng)歷一種針對該治療性蛋白的所不希望的免疫應答。此類受試者還包括已經(jīng)經(jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷移植的那些受試者。
如上所提到的，這些合成納米載體被設計成包含免疫抑制劑和(在一些實施例中)抗原，針對該抗原的致耐受性作用是所希望的。根據(jù)本發(fā)明，可以使用各種各樣的合成納米載體。在一些實施例中，合成納米載體是球體或球狀體。在一些實施例中，合成納米載體是扁平的或盤狀的。在一些實施例中，合成納米載體是立方體或立方形的。在一些實施例中，合成納米載體是卵形或橢圓形的。在一些實施例中，合成納米載體是圓柱體、錐體、或錐形。
在一些實施例中，希望使用在大小、形狀、和/或構成方面較一致的一個群體的合成納米載體，使得每一合成納米載體具有相似特性。例如，基于合成納米載體的總數(shù)，至少80％、至少90％、或至少95％的這些合成納米載體可以具有歸屬在這些合成納米載體的平均直徑或平均尺寸的5％、10％或20％之內(nèi)的最小尺寸或最大尺寸。在一些實施例中，一個群體的合成納米載體可以在大小、形狀、和/或構成方面是不均勻的。
合成納米載體可以是實心的或空心的，并且可以包含一個或多個層。在一些實施例中，每一層相對于其他一層或多層具有獨特的構成和獨特的特性。為了作為一個實例給出，合成納米載體可以具有一個核/殼結(jié)構，其中該核是一個層(例如一個聚合物核)并且該殼是一個第二層(例如一個脂質(zhì)雙層或單層)。合成納米載體可以包括多個不同的層。
在一些實施例中，合成納米載體可以任選地包含一種或多種脂質(zhì)。在一些實施例中，合成納米載體可以包含一種脂質(zhì)體。在一些實施例中，合成納米載體可以包含一個脂質(zhì)雙層。在一些實施例中，合成納米載體可以包含一個脂質(zhì)單層。在一些實施例中，合成納米載體可以包含一種微膠粒。在一些實施例中，合成納米載體可以包含一個核，該核包含被一個脂質(zhì)層(例如，脂質(zhì)雙層、脂質(zhì)單層等等)圍繞的一種聚合物基質(zhì)。在一些實施例中，合成納米載體可以包含被一個脂質(zhì)層(例如，脂質(zhì)雙層、脂質(zhì)單層等等)圍繞的一個非聚合物核(例如，金屬顆粒、量子點、陶瓷顆粒、骨顆粒、病毒顆粒、蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物等等)。
在其他實施例中，合成納米載體可以包含金屬顆粒、量子點、陶瓷顆粒等等。在一些實施例中，非聚合物合成納米載體是非聚合組分的一個聚集體，如金屬原子(例如，金原子)的一個聚集體。
在一些實施例中，合成納米載體可以任選地包含一種或多種兩親實體。在一些實施例中，兩親實體可以促進具有增加的穩(wěn)定性、改進的均勻性、或增加的粘度的合成納米載體的產(chǎn)生。在一些實施例中，兩親實體可以與一個脂質(zhì)膜(例如，脂質(zhì)雙層、脂質(zhì)單層等等)的內(nèi)表面結(jié)合。在本領域中已知的許多兩親實體可以適用于制造根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體。此類兩親實體包括但不限于：磷酸甘油酯類；磷脂酰膽堿類；二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dppc)；二油烯基磷脂?；掖及?dope)；二油烯基氧丙基三乙基銨(dotma)；二油?；字Ｄ憠A；膽固醇；膽固醇酯；二?；视?；二酰基甘油琥珀酸酯；二磷脂?；视?dppg)；十六烷醇；脂肪醇類，如聚乙二醇(peg)；聚氧乙烯-9-月桂基醚；一種表面活性脂肪酸，如棕櫚酸或油酸；脂肪酸類；脂肪酸甘油單酯類；脂肪酸甘油二酯類；脂肪酸酰胺類；脫水山梨糖醇三油酸酯(
在一些實施例中，合成納米載體可以任選地包含一種或多種碳水化合物。碳水化合物可以是天然的或合成的。碳水化合物可以是衍生的天然碳水化合物。在某些實施例中，碳水化合物包含單糖或二糖，包括但不限于：葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖(cellbiose)、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、以及神經(jīng)氨酸。在某些實施例中，碳水化合物是一種多糖，包括但不限于：支鏈淀粉、纖維素、微晶纖維素、羥丙基甲基纖維素(hpmc)、羥基纖維素(hc)、甲基纖維素(mc)、葡聚糖、環(huán)葡聚糖、糖原、羥乙基淀粉、卡拉膠、多聚糖(glycon)、直鏈淀粉、殼聚糖、n，o-羧甲基殼聚糖、藻膠和海藻酸、淀粉、甲殼質(zhì)、菊糖、魔芋、葡萄甘露聚糖(glucommannan)、石耳素、肝素、透明質(zhì)酸、凝膠多糖、以及黃原膠。在實施例中，這些發(fā)明的合成納米載體并不包含(或特別排除)碳水化合物，如多糖。在某些實施例中，該碳水化合物可以包含一種碳水化合物衍生物，如一種糖醇，包括但不限于：甘露醇、山梨醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、以及乳糖醇。
在一些實施例中，合成納米載體可以包含一種或多種聚合物。在一些實施例中，這些合成納米載體包含一種或多種聚合物，該聚合物是非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在一些實施例中，構成這些合成納米載體的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、或99％(重量/重量)的這些聚合物是非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在一些實施例中，構成這些合成納米載體的所有這些聚合物是非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在一些實施例中，這些合成納米載體可以包含一種或多種聚合物，該聚合物是非甲氧基封端的聚合物。在一些實施例中，構成這些合成納米載體的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、或99％(重量/重量)的這些聚合物是非甲氧基封端的聚合物。在一些實施例中，構成這些合成納米載體的所有這些聚合物是非甲氧基封端的聚合物。在一些實施例中，這些合成納米載體包含一種或多種聚合物，該聚合物不包含普朗尼克聚合物。在一些實施例中，構成這些合成納米載體的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、或99％(重量/重量)的這些聚合物不包含普朗尼克聚合物。在一些實施例中，構成這些合成納米載體的所有這些聚合物不包含普朗尼克聚合物。在一些實施例中，可以由包被層(例如脂質(zhì)體、脂質(zhì)單層、微膠粒等)環(huán)繞這樣一種聚合物。在一些實施例中，這些合成納米載體的不同成分可以與該聚合物偶聯(lián)。
可以通過多種方法中的任一種使這些免疫抑制劑和/或抗原與這些合成納米載體偶聯(lián)。通常，該偶聯(lián)可以是這些免疫抑制劑和/或抗原與這些合成納米載體之間鍵合的結(jié)果。此鍵合可以導致這些免疫抑制劑和/或抗原附接至這些合成納米載體的表面上和/或包含(封裝)在這些合成納米載體內(nèi)。然而，在一些實施例中，這些免疫抑制劑和/或抗原由于這些合成納米載體的結(jié)構而被這些合成納米載體封裝，而不是鍵合至這些合成納米載體上。在多個優(yōu)選的實施例中，這些合成納米載體包含如在此所提供的一種聚合物，并且這些免疫抑制劑和/或抗原與該聚合物偶聯(lián)。
當由于這些免疫抑制劑和/或抗原與合成納米載體之間的鍵合而發(fā)生偶聯(lián)時，該偶聯(lián)可以經(jīng)由一個偶聯(lián)部分而發(fā)生。一個偶聯(lián)部分可以是通過其使免疫抑制劑和/或抗原鍵合至合成納米載體上的任何部分。此類部分包括共價鍵(如一個酰胺鍵或酯鍵)、以及使免疫抑制劑和/或抗原鍵合(共價地或非共價地)至該合成納米載體上的單獨的分子。此類分子包括連接物或聚合物或其單元。例如，該偶聯(lián)部分可以包含免疫抑制劑和/或抗原靜電結(jié)合至其上的一種帶電荷的聚合物。作為另一個實例，該偶聯(lián)部分可以包含它共價結(jié)合至其上的一種聚合物或其單元。
在多個優(yōu)選的實施例中，這些合成納米載體包含如在此所提供的一種聚合物。這些合成納米載體可以是完全聚合的或它們可以是聚合物與其他材料的混合物。
在一些實施例中，具有合成納米載體的這些聚合物結(jié)合以形成一種聚合物基質(zhì)。在這些實施例中的一些中，一種組分(如一種免疫抑制劑或抗原)可以與該聚合物基質(zhì)中的一種或多種聚合物共價結(jié)合。在一些實施例中，共價結(jié)合是由一個連接物介導的。在一些實施例中，一種組分可以與該聚合物基質(zhì)中的一種或多種聚合物非共價結(jié)合。例如，在一些實施例中，一種組分可以被封裝在一種聚合物基質(zhì)之內(nèi)、被聚合物基質(zhì)圍繞、和/或分散在整個聚合物基質(zhì)中。可替代地或另外地，一種組分可以通過疏水相互作用、電荷相互作用、范德華力等等與一種聚合物基質(zhì)中的一種或多種聚合物結(jié)合。用于從其形成聚合物基質(zhì)的各種各樣的聚合物和方法是常規(guī)已知的。
聚合物可以是天然的或非天然的(合成的)聚合物。聚合物可以是均聚物或包含兩種或更多種單體的共聚物。在序列方面，共聚物可以是隨機的、嵌段的，或包含隨機序列與嵌段序列的組合。典型地，根據(jù)本發(fā)明的聚合物是有機聚合物。
在一些實施例中，該聚合物包含一種聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、或聚醚、或其單元。在其他實施例中，該聚合物包含聚(乙二醇)(peg)、聚丙二醇、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、或一種聚己酸內(nèi)酯、或其單元。在一些實施例中，優(yōu)選的是該聚合物是可生物降解的。因此，在這些實施例中，優(yōu)選的是如果該聚合物包含一種聚醚(如聚(乙二醇)或聚丙二醇或其單元)，則該聚合物包含一種聚醚和一種可生物降解的聚合物的嵌段共聚物，使得該聚合物是可生物降解的。在其他實施例中，該聚合物不僅僅包含一種聚醚或其單元，如聚(乙二醇)或聚丙二醇或其單元。
適合用于本發(fā)明的聚合物的其他實例包括但不限于：聚乙烯、聚碳酸酯(例如聚(1，3-二噁烷-2酮))、聚酐(例如聚(癸二酸酐))、聚丙基延胡索酸酯(polypropylfumerate)、聚酰胺(例如聚己內(nèi)酰胺)、聚縮醛、聚醚、聚酯(例如聚丙交酯、聚乙交酯、丙交酯-乙交酯共聚物、聚己酸內(nèi)酯、多羥基酸(例如聚(β-羥基烷酸酯)、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、以及聚胺、聚賴氨酸、聚賴氨酸-peg共聚物、以及聚(乙烯亞胺)、聚(乙烯亞胺)-peg共聚物。
在一些實施例中，根據(jù)本發(fā)明的聚合物包括在21c.f.r.§177.2600下已經(jīng)由美國食品與藥品管理局(fda)批準用于人的聚合物，包括但并不局限于聚酯(例如聚乳酸、聚(乳酸乙醇酸)共聚物、聚己內(nèi)酯、聚戊內(nèi)酯、聚(1，3-二噁烷-2酮))；聚酐(例如聚(癸二酸酐))；聚醚(例如聚乙二醇)；聚氨酯；聚甲基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；以及聚氰基丙烯酸酯。
在一些實施例中，聚合物可以是親水性的。例如，聚合物可以包含陰離子基團(例如磷酸根、硫酸根、羧酸根)；陽離子基團(例如，季胺基團)；或極性基團(例如，羥基基團、硫醇基團、胺基團)。在一些實施例中，包含一種親水性聚合物基質(zhì)的合成納米載體在該合成納米載體內(nèi)產(chǎn)生親水環(huán)境。在一些實施例中，聚合物可以是疏水性的。在一些實施例中，包含疏水性聚合物基質(zhì)的合成納米載體在該合成納米載體內(nèi)產(chǎn)生疏水環(huán)境。聚合物親水性或疏水性的選擇可以影響被結(jié)合(例如偶聯(lián))在合成納米載體之內(nèi)的材料的性質(zhì)。
在一些實施例中，聚合物可以用一個或多個部分和/或官能團修飾。根據(jù)本發(fā)明，可以使用各種各樣的部分或官能團。在一些實施例中，可以用聚乙二醇(peg)、用碳水化合物、和/或用衍生自多糖類的非環(huán)狀聚縮醛來修飾聚合物(papisov(巴比索夫)，2001，acssymposiumseries，786：301)?？梢允褂胓ref(格里夫)等人的美國專利號5543158、或vonandrian(馮安德里安)等人的wo公開wo2009/051837中的全部傳授內(nèi)容進行某些實施例。
在一些實施例中，可以用脂質(zhì)或脂肪酸基團修飾聚合物。在一些實施例中，脂肪酸基團可以是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山崳酸、或廿四烷酸中的一種或多種。在一些實施例中，脂肪酸基團可以是棕櫚烯酸、油酸、異油酸、亞麻酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、或芥酸中的一種或多種。
在一些實施例中，聚合物可以是聚酯，包括共聚物，這些共聚物包括乳酸和乙醇酸單元(例如聚(乳酸乙醇酸共聚物)和聚(丙交酯乙交酯共聚物))，在此統(tǒng)稱為“plga”；以及包括乙醇酸單元的均聚物，在此稱為“pga”，以及乳酸單元(例如聚-l-乳酸、聚-d-乳酸、聚-d，l-乳酸、聚-l-丙交酯、聚-d-丙交酯、以及聚-d，l-丙交酯)，在此統(tǒng)稱為“pla”。在一些實施例中，示例性的聚酯包括，例如多羥基酸；peg共聚物和丙交酯與乙交酯的共聚物(例如pla-peg共聚物、pga-peg共聚物、plga-peg共聚物)，以及它們的衍生物)。在一些實施例中，聚酯包括例如聚(己內(nèi)酯)、聚(己內(nèi)酯)-peg共聚物、聚(l-丙交酯--l-賴氨酸共聚物)、聚(絲氨酸酯)、聚(4-羥基-l-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-l-乙醇酸]、以及它們的衍生物。
在一些實施例中，聚合物可以是plga。plga是一種生物相容的并且生物可降解的乳酸和乙醇酸的共聚物，并且多種形式的plga特征在于乳酸：乙醇酸的比率。乳酸可以是l-乳酸、d-乳酸、或d，l-乳酸?？梢酝ㄟ^改變?nèi)樗幔阂掖妓岬谋嚷收{(diào)整plga的降解速率。在一些實施例中，根據(jù)本發(fā)明的將使用的plga特征在于大約85∶15、大約75∶25、大約60∶40、大約50∶50、大約40∶60、大約25∶75、或者大約15∶85的乳酸∶乙醇酸比率。
在一些實施例中，聚合物可以是一種或多種丙烯酸聚合物。在某些實施例中，丙烯酸聚合物包括，例如丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙基酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酸酐)、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚物、聚腈基丙烯酸酯、以及包括一種或多種以上聚合物的組合。該丙烯酸聚合物可以包含具有低含量的季銨基團的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的完全聚合的共聚物。
在一些實施例中，聚合物可以是陽離子型聚合物。通常，陽離子型聚合物能夠縮合和/或保護核酸(例如dna、或它的衍生物)的帶負電的鏈。含有胺的聚合物(例如聚(賴氨酸)(zauner(澤納)等人，1998，先進藥物遞送綜述，30∶97；以及kabanov(卡巴諾夫)等人，1995，生物共軛化學，6∶7)、聚(亞乙基亞胺)(pei；boussif(波希夫)等人，1995，美國科學院院刊，1995，92：7297)、以及聚(酰胺胺)樹枝狀聚合物(kukowska(庫科斯卡)-latallo(拉塔羅)等人，1996，美國科學院院刊，93：4897；tang(唐)等人，1996，生物共軛化學，7：703；以及haensler(亨斯勒)等人，1993，生物共軛化學，4：372)在生理ph下是帶正電的，在多種細胞系中與核酸形成離子對，并且介導轉(zhuǎn)染。在多個實施例中，這些發(fā)明的合成納米載體可以不包含(或可以排除)陽離子型聚合物。
在一些實施例中，聚合物可以是帶有陽離子側(cè)鏈的可降解聚酯(putnam(普特南)等人，1999，大分子，32：3658；barrera(巴雷拉)等人，1993，美國化學會志，115：11010；kwon(權)等人，1989，大分子，22：3250；lim(林)等人，1999，美國化學會志，121：5633；以及zhou(周)等人，1990，大分子，23：3399)。這些聚酯的實例包括聚(l-丙交酯l-賴氨酸共聚物)(barrera(巴雷拉)等人，1993，美國化學會志，115：11010)、聚(絲氨酸酯)(zhou(周)等人，1990，大分子，23：3399)、聚(4-羥基-l-脯氨酸酯)(putnam(普特南)等人，1999，大分子，32：3658；以及l(fā)im(林)等人，1999，美國化學會志，121：5633)、以及聚(4-羥基-l-脯氨酸酯)(putnam(普特南)等人，1999，大分子，32：3658；以及l(fā)im(林)等人，1999，美國化學會志，121：5633)。
這些和其他聚合物的特性以及用于制備它們的方法在本領域中是熟知的(參見，例如美國專利6,123,727；5,804,178；5,770,417；5,736,372；5,716,404；6,095,148；5,837,752；5,902,599；5,696,175；5,514,378；5,512,600；5,399,665；5,019,379；5,010,167；4,806,621；4,638,045；以及4,946,929；wang(王)等人，2001，美國化學會志，123：9480；lim(林)等人，2001，美國化學會志，123：2460；langer(朗格爾)，2000，化學研究評述，33：94；langer(朗格爾)，1999，控釋雜志，62：7；以及uhrich(烏利希)等人，1999，化學評論，99：3181)。更一般地，在conciseencyclopediaofpolymerscienceandpolymericaminesandammoniumsalts，goethals(戈薩爾斯)編輯，培格曼出版社，1980中；在principlesofpolymerizationbyodian，約翰·威利父子出版公司，第四版，2004中；在allcock(阿爾庫克)等人的contemporarypolymerchemistry，prentice-hall，1981中；在deming(德明)等人，1997，自然，390：386中；以及在美國專利6,506,577、6,632,922、6,686,446、以及6,818,732中說明了用于合成某些適合的聚合物的多種方法。
在一些實施例中，聚合物可以是線型聚合物或分支聚合物。在一些實施例中，聚合物可以是樹枝狀化合物。在一些實施例中，聚合物可以是基本上彼此交聯(lián)的。在一些實施例中，聚合物可以基本上不交聯(lián)。在一些實施例中，聚合物可以根據(jù)本發(fā)明進行使用而不經(jīng)歷交聯(lián)步驟。進一步理解的是，發(fā)明的合成納米載體可以包含嵌段共聚物、接枝共聚物、共混物、混合物、和/或任何上述及其他聚合物的加合物。本領域的那些技術人員將認識到，在此列出的這些聚合物代表根據(jù)本發(fā)明可以使用的聚合物的示例性的、而不是全面的清單。
根據(jù)本發(fā)明的多種組合物包含與藥學上可接受的賦形劑(如防腐劑、緩沖劑、生理鹽水或磷酸鹽緩沖的生理鹽水)組合的合成納米載體?？梢允褂贸Ｒ?guī)藥物制造和配制技術制造這些組合物，以實現(xiàn)有用的劑型。在一個實施例中，將本發(fā)明的合成納米載體與防腐劑一起懸浮在注射用無菌鹽水溶液中。
在多個實施例中，當制備合成納米載體作為載體時，用于將組分與這些合成納米載體偶聯(lián)的方法可以是有用的。如果該組分是小分子，那么在組裝這些合成納米載體之前將該組分附接至聚合物上可能是有利的。在多個實施例中，制備具有用于將該組分與合成納米載體偶聯(lián)的表面基團的合成納米載體也可能是有利的，該偶聯(lián)是通過使用這些表面基團而不是將該組分附接至聚合物上且隨后在合成納米載體的構建中使用這種聚合物共軛物來進行。
在某些實施例中，該偶聯(lián)可以是一個共價連接物。在多個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的肽可以經(jīng)由1，2，3-三唑連接物共價與外表面偶聯(lián)，該連接物通過納米載體表面上的疊氮基團與含有炔基的抗原或免疫抑制劑進行1，3-偶極環(huán)加成反應、或通過納米載體表面上的炔與含有疊氮基團的組分進行1，3-偶極環(huán)加成反應而形成。此類環(huán)加成反應優(yōu)選地是在銅(i)催化劑以及適合的cu(i)-配體和將cu(ii)化合物還原成催化活性的cu(i)化合物的還原劑存在下進行的。此類cu(i)催化的疊氮-炔環(huán)加成反應(cuaac)也可以稱為點擊反應。
另外，共價偶聯(lián)可以包含一個共價連接物，該共價連接物包含酰胺連接物、二硫化物連接物、硫醚連接物、腙連接物、酰肼連接物、亞胺或肟連接物、脲或硫脲連接物、脒連接物、胺連接物、以及磺酰胺連接物。
酰胺連接物經(jīng)由一種組分上的胺與第二組分(如納米載體)的羧酸基團之間的酰胺鍵形成。該連接物中的酰胺鍵可以用被適當保護的氨基酸或組分與被活化的羧酸(如被n-羥基丁二酰亞胺活化的酯)、使用任何常規(guī)酰胺鍵形成反應制成。
二硫化物連接物經(jīng)由在例如r1-s-s-r2的形式的兩個硫原子之間形成二硫(s-s)鍵制成。二硫鍵可以通過含有硫醇基/巰基(-sh)的組分與
在多個實施例中，制備了一種在聚合物鏈末端含有一個疊氮基或炔基的聚合物。然后使用此聚合物來制備合成納米載體，以此方式使得多個炔或疊氮基放置在該納米載體的表面上?？商娲?，可以通過另一種途徑制備該合成納米載體，并且隨后用炔或疊氮基功能化。該組分是在或者炔(如果該聚合物含有疊氮基)或者疊氮基(如果該聚合物含有炔)存在下制備。然后在具有或不具有催化劑的情況下允許該組分與該納米載體經(jīng)由1，3-偶極環(huán)加成反應進行反應，該催化劑將該組分經(jīng)由1，4-二取代的1，2，3-三唑連接物共價偶聯(lián)至顆粒上。
硫醚連接物通過以例如r1-s-r2的形式形成硫-碳(硫醚)鍵制成。硫醚可以通過用第二組分(如納米載體)上的烷基化基團(如鹵基或環(huán)氧基)烷基化一種組分(如該組分)上的硫醇基/巰基(-sh)制成。硫醚連接物還可以通過將一種組分上的硫醇基/巰基與作為邁克爾受體的含有順丁烯二酰亞胺基或乙烯砜基的第二組分(如一種聚合物)上的缺電子烯基進行邁克爾加成來形成。以另一種方式，硫醚連接物可以通過一種組分上的硫醇基/巰基與第二組分(如一種聚合物或納米載體)上的烯基進行自由基硫醇-烯反應來制備。
腙連接物通過一種組分上的酰肼基與第二組分(如納米載體)上的醛基/酮基進行反應制成。
酰肼連接物通過一種組分上的肼基與第二組分(如納米載體)上的羧酸基團進行反應來形成。此類反應通常使用類似于形成酰胺鍵的化學方法(其中羧酸用活化試劑活化)來進行。
亞胺或肟連接物通過一種組分上的胺或n-烷氧基胺基(或氨氧基)與第二組分(如納米載體)上的醛或酮基進行反應來形成。
脲或硫脲連接物通過一種組分上的胺基與第二組分(納米載體)上的異氰酸酯或異硫氰酸酯基進行反應來制備。
脒連接物通過一種組分上的胺基與第二組分(如納米載體)上的亞氨酸酯基團進行反應來制備。
胺連接物通過一種組分上的胺基與第二組分(納米載體)上的烷基化基團(如鹵基、環(huán)氧基、或磺酸酯基)進行烷基化反應制成?？商娲兀愤B接物還可以用適合的還原試劑(如氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉)、通過一種組分上的胺基與第二組分(如納米載體)上的醛基或酮基進行還原胺化反應制成。
磺酰胺連接物通過一種組分上的胺基與第二組分(納米載體)上的磺?；u化物(如磺酰氯)基團進行反應制成。
砜連接物通過親核試劑與乙烯砜進行邁克爾加成制成?；蛘咴撘蚁╉炕蛘咴撚H核試劑可以位于納米載體的表面上或附接至一種組分上。
該組分還可以經(jīng)由非共價共軛方法與納米載體共軛。例如，帶負電荷的抗原或免疫抑制劑可以通過靜電吸附與帶正電荷的納米載體共軛。含有金屬配體的組分還可以經(jīng)由金屬-配體絡合物與含有金屬絡合物的納米載體共軛。
在多個實施例中，該組分可以在組裝該合成納米載體之前附接至聚合物(例如聚乳酸-嵌段-聚乙二醇)上，或可以形成該合成納米載體而使得反應性或可活化基團在它的表面上。在后一種情況下，可以制備該組分以使其具有與由這些合成納米載體的表面呈現(xiàn)的附接化學性質(zhì)相容的基團。在其他實施例中，可以使用一種適合的連接物將肽組分附接至vlp或脂質(zhì)體上。連接物是能夠?qū)蓚€分子偶聯(lián)在一起的化合物或試劑。在一個實施例中，該連接物可以是在赫曼森(hermanson)2008中所描述的同雙功能或異雙功能試劑。例如，可以在edc存在下用同雙功能連接物(己二酸二酰肼(adh))處理表面上含有羧基的vlp或脂質(zhì)體合成納米載體，以形成具有adh連接物的相應合成納米載體。然后使所得被adh偶聯(lián)的合成納米載體經(jīng)由nc上的該adh連接物的另一端與含有酸基團的肽組分共軛，以產(chǎn)生相應的vlp或脂質(zhì)體肽共軛物。
針對可獲得的共軛方法的詳細描述，參見2008年由學術出版公司(academicpress，inc.)出版的第2版，赫曼森·gt(hermansongt)“生物共軛技術(bioconjugatetechniques)”。除了共價附接之外，該組分可以通過吸附至預先形成的合成納米載體上來偶聯(lián)、或它可以通過在該合成納米載體形成過程中進行封裝來偶聯(lián)。
在此所提供的任何免疫抑制劑可以與該合成納米載體偶聯(lián)。免疫抑制劑包括但不限于：抑制素；mtor抑制劑，如雷帕霉素或一種雷帕霉素類似物；tgf-β信號劑；tgf-β受體激動劑；組蛋白去乙?；?hdac)抑制劑；皮質(zhì)類固醇類；線粒體功能抑制劑，如魚藤酮；p38抑制劑；nf-κβ抑制劑；腺苷受體激動劑；前列腺素e2激動劑；磷酸二酯酶抑制劑，如磷酸二酯酶4抑制劑；蛋白酶體抑制劑；激酶抑制劑；g-蛋白偶聯(lián)受體激動劑；g-蛋白偶聯(lián)受體拮抗劑；糖皮質(zhì)激素類；類視黃醇類；細胞因子抑制劑；細胞因子受體抑制劑；細胞因子受體活化劑；過氧化物酶體增殖物激活受體拮抗劑；過氧化物酶體增殖物激活受體激動劑；組蛋白去乙?；敢种苿烩}調(diào)磷酸酶抑制劑；磷酸酶抑制劑以及氧化的atp。免疫抑制劑還包括ido、維生素d3、環(huán)孢霉素a、芳香烴受體抑制劑、白藜蘆醇、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、阿司匹林、尼氟酸、雌三醇、雷公藤甲素、白細胞介素(例如，il-1、il-10)、環(huán)孢霉素a、sirna靶向細胞因子或細胞因子受體等。
抑制素的實例包括：阿托伐他汀(atorvastatin)
mtor抑制劑的實例包括：雷帕霉素和其類似物(例如，ccl-779、rad001、ap23573、c20-甲代烯丙基雷帕霉素(c20-marap)、c16-(s)-丁基磺酰氨基雷帕霉素(c16-bsrap)、c16-(s)-3-甲基吲哚雷帕霉素(c16-irap)(貝爾(bayle)等人，化學與生物學(chemistry&biology)2006，13：99-107))、azd8055、bez235(nvp-bez235)、大黃根酸(大黃酚)、德福羅莫司(deforolimus)(mk-8669)、依維莫司(everolimus)(rad0001)、ku-0063794、pi-103、pp242、替西羅莫司(temsirolimus)以及wye-354(可獲自賽立克公司(selleck)，休斯頓(houston)，德克薩斯州(tx)，美國(usa))。
tgf-β信號劑的實例包括：tgf-β配體(例如，活化素a、gdf1、gdf11、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、nodal、tgf-β)和它們的受體(例如，acvr1b、acvr1c、acvr2a、acvr2b、bmpr2、bmpr1a、bmpr1b、tgfβri、tgfβrii)、r-smads/co-smads(例如，smad1、smad2、smad3、smad4、smad5、smad8)、以及配體抑制劑(例如，卵泡抑素、頭蛋白、腱蛋白、dan、lefty、ltbp1、thbs1、核心蛋白聚糖)。
線粒體功能抑制劑的實例包括：蒼術苷(二鉀鹽)、米酵菌酸(三銨鹽)、羰基氰化間氯苯腙、羧基蒼術苷(例如，來自蒼術屬植物(atractylisgummifera))、cgp-37157、(-)-魚藤素(例如，來自栓皮豆(munduleasericea))、f16、己糖激酶iivdac結(jié)合域肽、寡霉素、魚藤酮、ru360、sfk1、以及纈氨霉素(例如，來自極暗黃鏈霉菌(streptomycesfulvissimus))(emd4生物科學(emd4biosciences)，美國(usa))。
p38抑制劑的實例包括：sb-203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亞硫?；交?-5-(4-吡啶基)1h-咪唑)、sb-239063(反式-1-(4-羥基環(huán)己基)-4-(氟苯基)-5-(2-甲氧基-嘧啶-4-基)咪唑)、sb-220025(5-(2-氨基-4-嘧啶基)-4-(4-氟苯基)-1-(4-哌啶基)咪唑))、以及arry-797。
nf(例如，nk-κβ)抑制劑的實例包括：ifrd1、2-(1，8-萘啶-2-基)-苯酚、5-氨基水楊酸、bay11-7082、bay11-7085、cape(咖啡酸苯乙酯)、馬來酸二乙酯、ikk-2抑制劑iv、imd0354、乳胞素(lactacystin)、mg-132[z-leu-leu-leu-cho]、nfκb活化抑制劑iii、nf-κb活化抑制劑ii、jsh-23、小白菊內(nèi)酯(parthenolide)、氧化苯胂(pao)、ppm-18、吡咯烷二硫代氨基甲酸銨鹽、qnz、ro106-9920、楝酰胺(rocaglamide)、楝酰胺al、楝酰胺c、楝酰胺i、楝酰胺j、洛克米蘭醇(rocaglaol)、(r)-mg-132、水楊酸鈉、雷公藤甲素(pg490)、蟛蜞菊內(nèi)酯(wedelolactone)。
腺苷受體激動劑的實例包括cgs-21680和atl-146e。
前列腺素e2激動劑的實例包括e-前列腺素類激素2(e-prostanoid2)和e-前列腺素類激素4。
磷酸二酯酶抑制劑(非選擇性和選擇性抑制劑)的實例包括：咖啡因、氨荼堿、ibmx(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)、副黃嘌呤、己酮可可堿、可可堿、荼堿、甲基化的黃嘌呤類、長春西汀(vinpocetine)、ehna(赤-9-(2-羥基-3-壬基)腺嘌呤)、阿那格雷(anagrelide)、伊諾昔酮(enoximone)(perfantm)、米利酮(milrinone)、左昔孟坦(levosimendon)、松葉菊堿(mesembrine)、異丁司特(ibudilast)、吡拉米司特(piclamilast)、木犀草素(luteolin)、屈他維林(drotaverine)、羅氟司特(roflumilast)(daxastm、daliresptm)、西地那非(sildenafil)
蛋白酶體抑制劑的實例包括硼替佐米(bortezomib)、雙硫侖(disulfiram)、表兒荼素-3-沒食子酸鹽、以及鹽孢菌酰胺a(salinosporamidea)。
激酶抑制劑的實例包括：貝伐單抗(bevacizumab)、bibw2992、西妥昔單抗(cetuximab)
糖皮質(zhì)激素類的實例包括：氫化可的松(皮質(zhì)醇)、醋酸可的松、強的松(prednisone)、潑尼松龍(prednisolone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)、曲安西龍(triamcinolone)、倍氯米松(beclometasone)、醋酸氟氫可的松、醋酸脫氧皮質(zhì)酮(doca)、以及醛固酮。
類視黃醇類的實例包括：視黃醇、視黃醛、維甲酸(視黃酸，
細胞因子抑制劑的實例包括il1ra、il1受體拮抗劑、igfbp、tnf-bf、尿調(diào)節(jié)素(uromodulin)、α-2-巨球蛋白、環(huán)孢霉素a、戊烷脒、以及己酮可可堿
過氧化物酶體增殖物激活受體拮抗劑的實例包括gw9662、pparγ拮抗劑iii、g335、t0070907(emd4生物科學(emd4biosciences)，美國(usa))。
過氧化物酶體增殖物激活受體激動劑的實例包括：吡格列酮(pioglitazone)、環(huán)格列酮(ciglitazone)、氯貝特(clofibrate)、gw1929、gw7647、l-165，041、ly171883、pparγ活化劑、fmoc-leu、曲格列酮(troglitazone)、以及wy-14643(emd4生物科學(emd4biosciences)，美國(usa))。
組蛋白去乙酰化酶抑制劑的實例包括：異氫肟酸類(或異氫肟酸酯類)，如曲古抑菌素a(trichostatina)；環(huán)狀四肽類(如曲破辛b(trapoxinb))和縮肽類；苯甲酰胺類；親電酮類；脂肪族酸化合物，如苯基丁酸酯和丙戊酸；異羥肟酸類，如伏立諾他(vorinostat)(saha)、貝林司他(belinostat)(pxd101)、laq824、以及帕比司他(panobinostat)(lbh589)；苯甲酰胺類，如恩替諾特(entinostat)(ms-275)、ci994、以及莫替司他(mocetinostat)(mgcd0103)、煙酰胺；nad的衍生物、二氫香豆素、萘并吡喃酮(naphthopyranone)、以及2-羥基萘醛類。
鈣調(diào)磷酸酶抑制劑的實例包括環(huán)孢霉素、吡美莫司(pimecrolimus)、伏環(huán)孢素(voclosporin)、以及他克莫司(tacrolimus)。
磷酸酶抑制劑的實例包括：bn82002鹽酸鹽、cp-91149、花萼海綿誘癌素a(calyculina)、斑蝥酸(cantharidicacid)、斑蝥素(cantharidin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、乙基-3，4-迪磷他汀(ethyl-3，4-dephostatin)、福司曲星(fostriecin)鈉鹽、maz51、甲基-3，4-迪磷他汀(methyl-3，4-dephostatin)、nsc95397、去甲斑蝥素(norcantharidin)、來自凹形原甲藻(prorocentrumconcavum)的岡田酸銨鹽、岡田酸、岡田酸鉀鹽、岡田酸鈉鹽、氧化苯胂、各種磷酸酶抑制劑混合、蛋白質(zhì)磷酸酶1c、蛋白質(zhì)磷酸酶2a抑制蛋白、蛋白質(zhì)磷酸酶2a1、蛋白質(zhì)磷酸酶2a2、原釩酸鈉。
在一些實施例中，在此所描述的抗原也與合成納米載體偶聯(lián)。在一些實施例中，這些抗原與這些免疫抑制劑偶聯(lián)至其上的相同或不同的合成納米載體偶聯(lián)。在其他實施例中，這些抗原不與任何合成納米載體偶聯(lián)?？梢詮脑诖颂峁┑娜魏慰乖蝎@得或衍生出多個表位、或包含這些表位的蛋白質(zhì)、多肽或肽。此類抗原包括以上描述的那些，包括：與一種炎性疾病、自身免疫性疾病、過敏癥、器官或組織排斥或移植物抗宿主病相關聯(lián)的抗原；一種可移植的移植物以及一種治療性蛋白。全長抗原本身可以與這些合成納米載體偶聯(lián)。包括表位(如mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位)的上述任何物質(zhì)的片段或衍生物也可以與這些合成納米載體偶聯(lián)。
治療性蛋白包括但不限于：可輸注的治療性蛋白、酶、酶輔助因子、激素、凝血因子、細胞因子和干擾素、生長因子、單克隆抗體、及多克隆抗體(例如，作為替代療法向受試者給予的多克隆抗體)、以及與龐貝氏病相關聯(lián)的蛋白質(zhì)(例如，阿葡糖苷酶α、rhgaa(例如，myozyme和lumizyme(健贊公司(genzyme)))。治療性蛋白還包括涉及在凝血級聯(lián)系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)。治療性蛋白包括但不限于：因子vih、因子vii、因子ix、因子v、血管性血友病因子、vonheldebrant因子、組織型纖溶酶原激活物、胰島素、生長激素、α促紅細胞生成素、vegf、促血小板生成素、溶菌酶、抗凝血酶等。治療性蛋白還包括脂肪因子類，如瘦素和脂聯(lián)素。如下和在此其他地方描述了治療性蛋白的其他實例。還包括作為表位、包含該表位的蛋白質(zhì)、多肽或肽而提供的任何這些治療性蛋白的片段或衍生物。
在具有溶酶體貯積癥的受試者的酶替代療法中使用的治療性蛋白的實例包括但不限于：用于治療高雪病的伊米苷酶(例如，cerezymetm)、用于治療法布里病的a-半乳糖苷酶a(a-gala)(例如，α-半乳糖苷酶、fabryzymetm)、用于治療龐貝氏病的酸性a-葡糖苷酶(gaa)(例如，α-重組阿葡糖苷酶、lumizymetm、myozymetm)、用于治療粘多糖病的芳基硫酸酯酶b(例如，拉羅尼酶(laronidase)、aldurazymetm、艾度硫酸酯酶、elaprasetm、芳基硫酸酯酶b、naglazymetm)。
酶的實例包括氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構酶、以及連接酶。
激素的實例包括：褪黑素(n-乙?；?5-甲氧基色胺)、血清素、甲狀腺素(或四碘甲狀腺原氨酸)(一種甲狀腺激素)、三碘甲狀腺原氨酸(一種甲狀腺激素)、腎上腺素(epinephrine)(或腎上腺素(adrenaline))、去甲腎上腺素(norepinephrine)(或去甲腎上腺素(noradrenaline))、多巴胺(或催乳素抑制激素)、抗苗勒氏管激素(或苗勒氏管抑制因子或激素)、脂聯(lián)素、促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropichormone)(或促腎上腺皮質(zhì)激素(corticotropin))、血管緊張素原和血管緊張素、抗利尿激素(antidiuretichormone)(或加壓素(vasopressin)、精氨酸加壓素(argininevasopressin))、心房利鈉肽(或心房肽)、降鈣素、縮膽囊素(cholecystokinin)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、紅細胞生成素、促卵泡激素、胃泌素、胃饑餓素(ghrelin)、胰高血糖素(glucagon)、胰高血糖素樣肽(glp-1)、gip、促性腺激素釋放激素、生長激素釋放激素、人絨毛膜促性腺激素、人胎盤催乳素、生長激素、抑制素(inhibin)、胰島素、胰島素樣生長因子(或生長調(diào)節(jié)素)、瘦素、促黃體激素、促黑素細胞激素、阿立新(orexin)、催產(chǎn)素、甲狀旁腺激素、催乳素、松弛素、分泌素、促生長素抑制素、促血小板生成素、促甲狀腺激素(或促甲狀腺素)、促甲狀腺素釋放激素、皮質(zhì)醇、醛固酮、睪酮、脫氫表雄酮、雄烯二酮、二氫睪酮、雌二醇、雌酮、雌三醇、黃體酮、骨化三醇(1，25-二羥基維生素d3)、骨化二醇(25-羥基維生素d3)、前列腺素類、白三烯類、前列腺環(huán)素、凝血噁烷、催乳素釋放激素、促脂解素、腦利鈉肽、神經(jīng)肽y、組胺、內(nèi)皮素、胰多肽、腎素、以及腦啡肽。
血液和凝血因子的實例包括：因子i(纖維蛋白原)、因子ii(凝血酶原)、組織因子、因子v(促凝血球蛋白原、易變因子)、因子vii(穩(wěn)定因子、前轉(zhuǎn)變素)、因子viii(抗血友病球蛋白)、因子ix(克雷司馬斯因子(christmasfactor)或血漿促凝血酶原激酶組分)、因子x(斯圖亞特因子(stuart-prowerfactor))、因子xa、因子xi、因子xii(哈格曼因子(hagemanfactor))、因子xiii(纖維蛋白穩(wěn)定因子)、血管性血友病因子、前激肽釋放酶(費萊徹因子(fletcherfactor))、高分子量激肽原(hmwk)(菲茨杰拉德因子)、纖連蛋白、纖維蛋白、凝血酶、抗凝血酶iii、肝素輔助因子ii、蛋白c、蛋白s、蛋白z、蛋白z相關蛋白酶抑制劑(zpi)、纖溶酶原、α2-抗纖維蛋白溶酶、組織型纖溶酶原激活物(tpa)、尿激酶、纖溶酶原激活物抑制劑-1(pai1)、纖溶酶原激活物抑制劑-2(pai2)、癌性促凝物質(zhì)、以及阿法依伯汀(益比奧(epogen)、普羅克里特(procrit))。
細胞因子的實例包括：淋巴因子、白細胞介素、及趨化因子、1型細胞因子(如ifn-γ、tgf-β)、以及2型細胞因子(如il-4、il-10、以及il-13)。
生長因子的實例包括：腎上腺髓質(zhì)素(am)、血管生成素(ang)、自分泌運動因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bmp)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf)、表皮生長因子(egf)、紅細胞生成素(epo)、成纖維細胞生長因子(fgf)、膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(gdnf)、粒細胞集落刺激因子(g-csf)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)、生長分化因子-9(gdf9)、肝細胞生長因子(hgf)、肝細胞瘤源性生長因子(hdgf)、胰島素樣生長因子(igf)、促移行因子、肌生長抑制素(gdf-8)、神經(jīng)生長因子(ngf)和其他神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、血小板源性生長因子(pdgf)、促血小板生成素(tpo)、α-轉(zhuǎn)化生長因子(tgf-α)、β-轉(zhuǎn)化生長因子(tgf-β)、α-腫瘤壞死因子(tnf-α)、血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、wnt信號通路、胎盤生長因子(pigf)、[(胎牛生長激素)](fbs)、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、以及il-7。
單克隆抗體的實例包括：阿巴伏單抗(abagovomab)、阿昔單抗(abciximab)、阿達木單抗(adalimumab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿非莫單抗(afelimomab)、阿夫土珠(afutuzumab)、培化阿珠單抗(alacizumabpegol)、ald、阿侖單抗(alemtuzumab)、噴替酸阿妥莫單抗(altumomabpentetate)、麻安莫單抗(anatumomabmafenatox)、安蘆珠單抗(anrukinzumab)、抗胸腺細胞球蛋白、阿泊珠單抗(apolizumab)、阿西莫單抗(arcitumomab)、阿塞珠單抗(aselizumab)、那他珠單抗(atlizumab)(托珠單抗(tocilizumab))、阿托木單抗(atorolimumab)、巴品珠單抗(bapineuzumab)、巴利昔單抗(basiliximab)、巴維昔單抗(bavituximab)、貝妥莫單抗(bectumomab)、貝利木單抗(belimumab)、貝那利珠單抗(benralizumab)、柏替木單抗(bertilimumab)、貝索單抗(besilesomab)、貝伐單抗(bevacizumab)、比西單抗(biciromab)、比伐珠單抗-美登素(bivatuzumabmertansine)、蘭妥莫單抗(blinatumomab)、貝倫妥單抗-維多汀(brentuximabvedotin)、布雷奴單抗(briakinumab)、卡那單抗(cahakinumab)、莫坎妥珠單抗(cantuzumabmertansine)、卡羅單抗噴地肽(capromabpendetide)、卡妥索單抗(catumaxomab)、西利珠單抗(cedelizumab)、賽妥珠單抗(certolizumabpegol)、西妥昔單抗(cetuximab)、泊西他珠單抗(citatuzumabbogatox)、西妥木單抗(cixutumumab)、克立昔單抗(clenoliximab)、克伐珠單抗(clivatuzumabtetraxetan)、可那木單抗(conatumumab)、達西珠單抗(dacetuzumab)、達利珠單抗(daclizumab)、達雷木單抗(daratumumab)、地諾單抗(denosumab)、地莫單抗(detumomab)、阿托度單抗(dorlimomabaritox)、達利珠單抗(dorlixizumab)、依美昔單抗(ecromeximab)、依庫珠單抗(eculizumab)、埃巴單抗(edobacomab)、依決洛單抗(edrecolomab)、依法利珠單抗(efalizumab)、依芬古單抗(efungumab)、依洛珠單抗(elotuzumab)、艾西莫單抗(elsilimomab)、培化恩莫單抗(enlimomabpegol)、西艾匹莫單抗(epitumomabcituxetan)、依帕珠單抗(epratuzumab)、厄利珠單抗(erlizumab)、厄妥索單抗(ertumaxomab)、埃達珠單抗(etaracizumab)、艾維單抗(exbivirumab)、法索單抗(fanolesomab)、法拉莫單抗(faralimomab)、法利珠單抗(farletuzumab)、泛維珠單抗(felvizumab)、非扎奴單抗(fezakinumab)、芬妥木單抗(fieitumumab)、芳妥珠單抗(fontolizumab)、福拉韋單抗(foravirumab)、夫蘇木單抗(fresolimumab)、加利昔單抗(galiximab)、羅氏單抗(gantenerumab)、加維莫單抗(gavilimomab)、吉妥珠單抗-奧唑米星(gemtuzumabozogamicin)、gc1008、吉瑞昔單抗(girentuximab)、格雷帕珠單抗-維德汀(glembatumumabvedotin)、戈利木單抗(golimumab)、戈利昔單抗(gomiliximab)、伊巴珠單抗(ibalizumab)、替伊莫單抗(ibritumomabtiuxetan)、伊戈伏單抗(igovomab)、英西單抗(imciromab)、英夫利昔單抗(infliximab)、英妥木單抗(intetumumab)、伊諾莫單抗(inolimomab)、伊珠單抗-奧加米星(inotuzumabozogamicin)、伊匹單抗(ipilimumab)、伊妥木單抗(iratumumab)、凱利昔單抗(keliximab)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、來金珠單抗(lebrikizumab)、來馬索單抗(lemalesomab)、樂德木單抗(lerdelimumab)、來沙木單抗(lexatumumab)、利韋單抗(libivirumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、羅佛珠單抗-美登素(lorvotuzumabmertansine)、魯卡木單抗(lucatumumab)、魯昔單抗(lumiliximab)、馬帕木單抗(mapatumumab)、馬司莫單抗(maslimomab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、美泊利單抗(mepolizumab)、美替木單抗(metelimumab)、米拉珠單抗(milatuzumab)、明瑞莫單抗(minretumomab)、米妥莫單抗(mitumomab)、莫羅木單抗(morolimumab)、莫維珠單抗(motavizumab)、莫羅單抗-cd3(muromonab-cd3)、他那可洛單抗(nacolomabtafenatox)、他那莫單抗(naptumomabestafenatox)、那他珠單抗(natalizumab)、奈巴庫單抗(nebacumab)、奈昔木單抗(necitumumab)、奈瑞莫單抗(nerelimomab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、莫諾非莫單抗(nofetumomabmerpentan)、奧瑞珠單抗(ocrelizumab)、奧度莫單抗(odulimomab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧拉雷單抗(olaratumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、莫奧珠單抗(oportuzumabmonatox)、奧戈伏單抗(oregovomab)、奧昔珠單抗(otelixizumab)、帕吉昔單抗(pagibaximab)、帕利珠單抗(palivizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、帕諾庫單抗(panobacumab)、帕考珠單抗(pascolizumab)、帕尼單抗(pemtumomab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、培克珠單抗(pexelizumab)、平妥單抗(pintumomab)、普立昔單抗(priliximab)、普托木單抗(pritumumab)、瑞非韋魯(rafivirumab)、禮來單抗(ramucirumab)、來尼珠單抗(ranibizumab)、瑞希巴庫(raxibacumab)、瑞加韋單抗(regavirumab)、瑞利珠單抗(reslizumab)、利妥木單抗(rilotumumab)、利妥珠單抗(rituximab)、羅妥木單抗(robatumumab)、羅利珠單抗(rontalizumab)、羅韋來單抗(rovelizumab)、蘆利珠單抗(ruplizumab)、噴地肽沙妥莫單抗(satumomabpendetide)、司韋單抗(sevirumab)、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、西法木單抗(sifalimumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、希普利珠單抗(siplizumab)、蘇蘭珠單抗(solanezumab)、索尼普單抗(sonepcizumab)、索土珠單抗(sontuzumab)、司他蘆單抗(stamulumab)、硫索單抗(sulesomab)、他珠單抗(tacatuzumabtetraxetan)、他度珠單抗(tadocizumab)、他利珠單抗(talizumab)、他尼珠單抗(tanezumab)、帕他莫單抗(taplitumomabpaptox)、特非珠單抗(tefibazumab)、阿替莫單抗(telimomabaritox)、替妥莫單抗(tenatumomab)、替奈昔單抗(teneliximab)、替利珠單抗(teplizumab)、替西莫單抗(ticilimumab)(替西木單抗(tremelimumab))、替加珠單抗(tigatuzumab)、托珠單抗(tocilizumab)(阿替珠單抗(atlizumab))、托利珠單抗(toralizumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、曲美木單抗(tremelimumab)、西莫白細胞介素單抗(tucotuzumabcelmoleukin)、妥韋單抗(tuvirumab)、烏珠單抗(urtoxazumab)、優(yōu)特克單抗(ustekinumab)、伐利昔單抗(vapaliximab)、維多珠單抗(vedolizumab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、維帕莫單抗(vepalimomab)、維西珠單抗(visilizumab)、伏洛昔單抗(volociximab)、伏妥莫單抗(votumumab)、扎魯木單抗(zalutumumab)、扎木單抗(zanolimumab)、齊拉木單抗(ziralimumab)、以及阿佐莫單抗(zolimomabaritox)。
輸注療法或可注射的治療性蛋白的實例包括：例如，塔西單抗(tocilizumab)(羅氏公司(roche)
對根據(jù)本發(fā)明的方面有用的另外的治療性蛋白對于本領域普通技術人員而言將是顯而易見的，并且本發(fā)明在此方面是不受限的。在一些實施例中，可以對一種組分(如抗原或免疫抑制劑)進行分離。分離是指該成分與它的天然環(huán)境分離并且以容許對它進行鑒定或使用的足夠量存在。這意味著，例如，該成分可以(i)通過表達克隆選擇性地產(chǎn)生或(ii)如通過色譜法或電泳進行純化。分離的成分可以是基本上純的，但是不需要如此。由于在藥物制劑中分離的成分可以與藥學上可接受的賦形劑相混合，按該制劑的重量計該成分可以僅包含小的百分比。雖然如此，該成分是分離的原因在于，它已經(jīng)從在活系統(tǒng)中可能與其相關聯(lián)的物質(zhì)中分離出來，即從其他脂質(zhì)或蛋白質(zhì)中分離出來。在此提供的任何成分可以以分離的形式包含在這些組合物中。
d.制造和使用本發(fā)明的組合物和相關方法的方法
可以使用本領域中已知的各種各樣的方法制備合成納米載體。例如，可以通過如納米沉淀、使用流體通道的流動聚焦、噴霧干燥、單和雙乳液溶劑蒸發(fā)、溶劑萃取、相分離、研磨、微乳液步驟、微制造、納米制造、犧牲層、簡單和復雜凝聚法的方法、以及本領域的那些普通技術人員熟知的其他方法形成合成納米載體?？商娲鼗蛄硗獾?，已經(jīng)說明了用于單分散半導體，傳導性的、磁性的、有機的、以及其他納米材料的水性和有機溶劑合成(pellegrino(佩萊格里諾)等人，2005，小物質(zhì)，1：48；murray(莫雷)等人，2000，材料科學年度評論，30：545；以及trindade(特林達德)等人，2001，材料化學，13：3843)。在文獻中已經(jīng)描述了另外的方法(參見，例如，多布羅夫(doubrow)編著，“醫(yī)藥中的微膠囊和納米顆粒(microcapsulesandnanoparticlesinmedicineandpharmacy)”，crc出版社，博卡拉頓(bocaraton)，1992；馬西威茲(mathiowitz)等人，1987，控釋期刊(j.control.release)，5：13；馬西威茲(mathiowitz)等人，1987，反應性聚合物(reactivepolymers)，6：275；以及馬西威茲(mathiowitz)等人，1988，應用聚合物科學期刊(j.appl.polymersci.)，35：755；美國專利5578325和6007845；p·保利賽利(p.paolicelli)等人，“可以有效結(jié)合并遞送病毒樣顆粒的表面修飾的基于plga的納米顆粒(surface-modifiedplga-basednanoparticlesthatcanefficientlyassociateanddelivervirus-likeparticles)”，納米醫(yī)學(nanomedicine)，5(6)：843-853(2010))。
可以使用各種方法將各種材料封裝在所令人希望的合成納米載體中，這些方法包括但不限于：c·阿斯泰特(c.astete)等人，“plga納米顆粒的合成和表征(synthesisandcharacterizationofplgananoparticles)”生物材料科學期刊(j.biomater.sci.)聚合物版，第17卷，第3期，第247-289頁(2006)；k·阿芙古斯塔基斯(k.avgoustakis)“peg化的聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)納米顆粒：制備、特性以及在藥物遞送中的可能應用(pegylatedpoly(lactide)andpoly(lactide-co-glycolide)nanoparticles：preparation，propertiesandpossibleapplicationsindrugdelivery)”當前藥物遞送(currentdrugdelivery)1：321-333(2004)；里斯·c(c.reis)等人，“納米封裝i.用于制備載藥聚合物納米顆粒的方法(nanoencapsulationi.methodsforpreparationofdrug-loadedpolymericnanoparticles)”納米醫(yī)學(nanomedicine)2：8-21(2006)；p·保利賽利(p.paolicelli)等人，“可以有效結(jié)合和遞送病毒樣顆粒的表面修飾的基于plga的納米顆粒(surface-modifiedplga-basednanoparticlesthatcanefficientlyassociateanddelivervirus-likeparticles)”納米醫(yī)學(nanomedicine)，5(6)：843-853(2010)。可以使用其他適合于將材料封裝至合成納米載體中的方法，這些方法包括但不限于披露在昂格爾(unger)的美國專利6,632,671(2003年10月14日)中的方法。
在某些實施例中，通過納米沉淀工藝或噴霧干燥來制備合成納米載體?？梢愿淖冊谥苽浜铣杉{米載體中使用的條件以產(chǎn)生具有希望的大小和特性(例如，疏水性、親水性、外部形態(tài)學、“粘性”、形狀等等)的顆粒。制備這些合成納米載體的方法和使用的條件(例如，溶劑、溫度、濃度、空氣流速等等)可以取決于有待與這些合成納米載體偶聯(lián)的材料和/或該聚合物基質(zhì)的組成。
如果通過任何以上方法制備的顆粒具有在所希望的范圍外的大小范圍，那么可以按大小分類這些顆粒，例如使用一個篩。
本發(fā)明的合成納米載體的成分(即，組分)(如構成一個免疫特征表面的部分、靶向部分、聚合物基質(zhì)、抗原、免疫抑制劑等)可以例如通過一個或多個共價鍵偶聯(lián)至整體的合成納米載體上或可以借助一個或多個連接物來偶聯(lián)。使合成納米載體功能化的另外方法可以由以下文獻改編而來：薩爾茨曼(saltzman)等人的公布的美國專利申請2006/0002852、戴斯蒙(desimone)等人的公布的美國專利申請2009/0028910、或默西(murthy)等人的公布的國際專利申請wo/2008/127532a1。
可替代地或另外地，可以經(jīng)由非共價相互作用使合成納米載體直接地或間接地與組分偶聯(lián)。在非共價的實施例中，通過非共價相互作用介導非共價偶聯(lián)，這些非共價相互作用包括但不限于：電荷相互作用、親和相互作用、金屬配位、物理吸附、主-客體相互作用、疏水相互作用、tt堆積相互作用、氫鍵相互作用、范德華相互作用、磁相互作用、靜電相互作用、偶極-偶極相互作用、和/或其組合。此類偶聯(lián)可以安排在本發(fā)明合成納米載體的一個外表面或一個內(nèi)表面上。在多個實施例中，封裝和/或吸附是偶聯(lián)的形式。在多個實施例中，本發(fā)明的這些合成納米載體可以通過在相同媒介物或遞送系統(tǒng)中混合而與抗原相組合。
可以使用傳統(tǒng)的藥物混合方法組合多個群體的合成納米載體以形成根據(jù)本發(fā)明的藥物劑型。這些方法包括液體-液體混合，其中兩種或更多種各自含有一個或多個納米載體子集的懸浮液被直接組合或經(jīng)由一個或多個含有稀釋劑的容器被集合在一起。因為合成納米載體還可以以粉末形式生產(chǎn)或貯存，所以可以進行干燥的粉末-粉末混合，因為可以將兩種或更多種粉末再懸浮于共同的介質(zhì)中。取決于納米載體的特性和它們的相互作用潛力，一種或另一種混合途徑可能也有優(yōu)勢。
包含合成納米載體的典型的發(fā)明組合物可以包含無機或有機緩沖劑(例如，磷酸、碳酸、乙酸、或檸檬酸的鈉鹽或鉀鹽)和ph調(diào)節(jié)劑(例如，鹽酸、氫氧化鈉或氫氧化鉀、檸檬酸或乙酸的鹽、氨基酸和它們的鹽)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、α-生育酚)、表面活性劑(例如，聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚氧乙烯9-10壬基酚、去氧膽酸鈉)、溶液和/或低溫/凍干穩(wěn)定劑(例如，蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖)、滲透調(diào)節(jié)劑(例如，鹽類或糖類)、抗細菌劑(例如，苯甲酸、苯酚、慶大霉素)、消泡劑(例如，聚二甲基硅酮(polydimethylsilozone))、防腐劑(例如，硫柳汞、2-苯氧乙醇、edta)、聚合物穩(wěn)定劑和粘度調(diào)節(jié)劑(例如，聚乙烯吡咯酮、泊洛沙姆488、羧甲基纖維素)、以及共溶劑(例如，甘油、聚乙二醇、乙醇)。
根據(jù)本發(fā)明的組合物包含與藥學上可接受的賦形劑組合的本發(fā)明的合成納米載體?？梢允褂贸Ｒ?guī)藥物制造和配制技術制造這些組合物，以實現(xiàn)有用的劑型。適合用于實踐本發(fā)明的技術可以在以下文獻中找到：愛德華·l保羅(edwardl.paul)，維克多·a.atiemo-obeng(victora.atiemo-obeng)以及蘇珊娜·m.kresta(suzannem.kresta)編著的工業(yè)混合手冊：科學與實踐(handbookofindustrialmixing：scienceandpractice)，2004約翰威利國際出版公司(johnwiley&sons，inc.)；和奧斯丁·m.e.(m.e.auten)編著的制藥學：劑型設計科學(pharmaceutics：thescienceofdosageformdesign)，第2版，2001，丘吉爾利文斯通出版社(churchilllivingstone)。在一個實施例中，將本發(fā)明的合成納米載體與防腐劑一起懸浮在注射用無菌鹽水溶液中。
應當理解可以按任何適合的方式制造本發(fā)明的這些組合物，并且本發(fā)明絕不局限于可以使用在此描述的方法所產(chǎn)生的組合物。適當方法的選擇可能要求注意被結(jié)合的特定部分的特性。
在一些實施例中，本發(fā)明的合成納米載體是在無菌條件下制造或最后進行滅菌。這可以確保所得的組合物是無菌的并且是非感染性的，因此當與非無菌的組合物相比時提高了安全性。這提供了有價值的安全措施，尤其是當接受合成納米載體的受試者具有免疫缺陷、正在遭受感染、和/或易受感染時。在一些實施例中，取決于配制策略，可以將本發(fā)明的合成納米載體凍干并且儲存在懸浮液中或呈凍干粉末形式，持續(xù)延長的時間而元活性損失。
可以通過各種途徑給予本發(fā)明的這些組合物，這些途徑包括但不限于皮下、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、透粘膜、透粘膜、舌下、直腸、眼睛、肺部、皮膚內(nèi)、經(jīng)皮膚、經(jīng)皮或真皮內(nèi)或這些途徑的組合。給予途徑還包括通過吸入或肺氣溶膠來進行的給予。用于制備氣溶膠遞送系統(tǒng)的技術是本領域技術人員眾所周知的(參見，例如夏拉(sciarra)和庫替(curie)，“氣溶膠(aerosols)，”雷明頓的藥物科學(remington’spharmaceuticalsciences)，第18版，1990，第1694-1712頁；該文獻通過引用結(jié)合在此)。
作為本發(fā)明的基于細胞的治療而提供的可移植的移植物或治療性蛋白可以通過腸胃外、動脈內(nèi)注射、鼻內(nèi)或靜脈內(nèi)給予或通過注射至淋巴結(jié)或眼前房或通過局部給予至感興趣的器官或組織而進行給予?？梢酝ㄟ^皮下、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、冠狀動脈內(nèi)、胰腺內(nèi)、肝內(nèi)或支氣管注射來進行給予。
本發(fā)明的這些組合物可以按有效的量給予，如在此其他地方描述的有效的量。根據(jù)本發(fā)明，劑型的劑量含有不同量的多個群體的合成納米載體和/或不同量的抗原和/或免疫抑制劑。本發(fā)明的劑型中存在的合成納米載體和/或抗原和/或免疫抑制劑的量可以根據(jù)這些抗原和/或免疫抑制劑的性質(zhì)、有待完成的治療益處、以及其他此類參數(shù)而改變。在多個實施例中，可以進行劑量范圍研究，以建立有待存在于該劑型中的合成納米載體群體的最佳治療量以及抗原和/或免疫抑制劑的量。在多個實施例中，這些合成納米載體和/或這些抗原和/或免疫抑制劑是以一定的量存在于該劑型中，當向受試者給予時，該量是有效產(chǎn)生針對這些抗原的致耐受性免疫應答。在受試者中使用常規(guī)劑量范圍研究和技術，也許有可能確定對產(chǎn)生致耐受性免疫應答有效的抗原和/或免疫抑制劑的量?？梢栽诙喾N頻率下給予本發(fā)明的劑型。在一個優(yōu)選的實施例中，至少一次給予該劑型足以產(chǎn)生藥理學上相關的應答。在多個更優(yōu)選的實施例中，利用至少兩次給予、至少三次給予、或至少四次給予該劑型來確保藥理學上相關的應答。
可以在疾病、紊亂或病癥發(fā)作之前啟動這些發(fā)明組合物的預防性給予，或可以在病癥、紊亂或病癥建立之后啟動治療性給予。
在一些實施例中，例如在給予一種治療性蛋白或可移植的移植物或暴露于一種過敏原之前進行合成納米載體的給予。在多個示例性的實施例中，在給予一種治療性蛋白或可移植的移植物或暴露于一種過敏原之前包括但不限于30天、25天、20天、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、1天、或0天給予合成納米載體一次或多次。另外或可替代地，可以在給予一種治療性蛋白或可移植的移植物或暴露于一種過敏原之后向受試者給予合成納米載體。在多個示例性的實施例中，在給予一種治療性蛋白或可移植的移植物或暴露于一種過敏原之后包括但不限于1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、20天、25天、30天等等而給予合成納米載體一次或多次。
在一些實施例中，在初始給予已經(jīng)在受試者中產(chǎn)生一種致耐受性應答之后向該受試者給予維持劑量(例如，在此提供的合成納米載體組合物的維持劑量)，例如以便維持在初始劑量之后所達到的致耐受性作用、以便防止該受試者中的所不希望的免疫應答、或以便防止該受試者變?yōu)樘幱诮?jīng)歷所不希望的免疫應答或所不希望的水平的免疫應答風險中的受試者。在一些實施例中，該維持劑量是與該受試者接受的初始劑量相同的劑量。在一些實施例中，該維持劑量是比初始劑量更低的劑量。例如，在一些實施例中，該維持劑量是約3/4、約2/3、約1/2、約1/3、約1/4、約1/8、約1/10、約1/20、約1/25、約1/50、約1/100、約1/1,000、約1/10,000、約1/100,000、或約1/1,000,000(重量/重量)的初始劑量。
出于免疫抑制的目的，在此描述的這些組合物和方法可以用來誘導或增強一種致耐受性免疫應答和/或抑制、調(diào)節(jié)、引導或重定向所不希望的免疫應答。在此描述的這些組合物和方法可以用于診斷、預防和/或治療其中免疫抑制(例如，致耐受性免疫應答)將會賦予治療益處的疾病、紊亂或病癥。這類疾病、紊亂或病癥包括炎性疾病、自身免疫性疾病、過敏、器官或組織排斥以及移植物抗宿主病。在此描述的這些組合物和方法還可以用于已經(jīng)經(jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷移植的受試者。在此描述的這些組合物和方法還可以用于已經(jīng)接受、正在接受或?qū)⒁邮芤环N治療性蛋白的受試者，該受試者已經(jīng)產(chǎn)生或預期會產(chǎn)生一種針對該治療性蛋白的所不希望的免疫應答。
自身免疫性疾病包括但不限于類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、免疫介導的或i型俺糖尿病、炎性腸病(例如，克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、硬皮病、自身免疫性甲狀腺疾病、斑禿、格雷夫病、格林-巴利綜合征、腹腔病、干燥綜合征、風濕熱、胃炎、自身免疫性萎縮性胃炎、自身免疫性肝炎、胰島炎、卵巢炎、睪丸炎、葡萄膜炎、晶狀體源性葡萄膜炎、重癥肌無力、原發(fā)性粘液性水腫、惡性貧血、自身免疫性溶血性貧血、阿狄森病、硬皮病、肺出血腎炎綜合征、腎炎(例如，腎小球腎炎)、銀屑病、尋常性天皰瘡、類天皰瘡、交感性眼炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、特發(fā)性白細胞減少癥(feucopenia)、韋格納肉芽腫病以及多/皮肌炎。
一些另外的示例性的自身免疫性疾病、相關聯(lián)的自身抗原、以及自身抗體(它們預期會在本發(fā)明中使用)在以下表1中描述：
炎癥性疾病包括但不限于：阿爾茨海默病、強直性脊柱炎、關節(jié)炎、哮喘、動脈粥樣硬化、白塞病、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)根神經(jīng)病、克羅恩病、結(jié)腸炎、囊性纖維化、皮炎、憩室炎、肝炎、腸易激綜合征(ibs)、紅斑狼瘡、肌營養(yǎng)不良癥、腎炎、帕金森病、帶狀皰疹和潰瘍性結(jié)腸炎。炎性疾病還包括，例如，心血管疾病、慢性阻塞性肺疾病(copd)、支氣管擴張、慢性膽囊炎、結(jié)核病、橋本氏甲狀腺炎、敗血病、結(jié)節(jié)病、矽肺及其他塵肺、以及傷口中的植入異物、但都不局限于此。如在此所使用，術語“敗血癥”是指一種公認的與針對微生物侵襲的宿主系統(tǒng)性炎癥應答相關聯(lián)的臨床綜合征。在此所使用的術語“敗血癥”是指典型地信號為發(fā)熱或低體溫、心動過速以及呼吸急促的一種病癥，并在嚴重的情況下可進展為低血壓、器官功能障礙，甚至死亡。
在一些實施例中，炎性疾病是非自身免疫性炎性腸病、手術后粘連、冠狀動脈病、肝纖維化、急性呼吸窘迫綜合征、急性炎性胰腺炎、內(nèi)窺鏡逆行膽管胰造影術引起的胰腺炎、燒傷、冠狀動脈粥樣硬化、腦和外周動脈、闌尾炎、膽囊炎、憩室炎、內(nèi)臟纖維化癥、傷口愈合、皮膚瘢痕形成病癥(瘢痕瘤、化膿性汗腺炎)、肉芽腫性病癥(結(jié)節(jié)病、原發(fā)性膽汁性肝硬變)、哮喘、壞疽性膿皮病、sweet氏綜合征、白塞病、原發(fā)性硬化性膽管炎或膿腫。在一些優(yōu)選實施例中，炎性疾病是炎性腸病(例如，克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎)。
在一些實施例中，炎性疾病是一種自身免疫性疾病。在一些實施例中自身免疫性疾病是類風濕性關節(jié)炎、風濕熱、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、自身免疫性炎性腸病、胰島素依賴型糖尿病、糖尿病、青少年糖尿病、自發(fā)性自身免疫性糖尿病、胃炎、自身免疫性萎縮性胃炎、自身免疫性肝炎、甲狀腺炎、橋本氏甲狀腺炎、胰島炎、卵巢炎、睪丸炎、葡萄膜炎、晶狀體源性葡萄膜炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、原發(fā)性粘液性水腫、甲狀腺功能亢進、惡性貧血、自身免疫性溶血性貧血、阿狄森病、強直性脊柱炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、肺出血腎炎綜合征、格林-巴利綜合征、格雷夫病、腎小球腎炎、銀屑病、尋常性天皰瘡、類天皰瘡、濕疹、大皰性類天皰瘡、交感性眼炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、特發(fā)性白細胞減少癥(feucopenia)、干燥綜合征、系統(tǒng)性硬化、韋格納肉芽腫、多肌炎/皮肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、原發(fā)性硬化性膽管炎、紅斑狼瘡或系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
移植物抗宿主病(gvhd)是可能在多能細胞(例如，干細胞)或骨髓移植之后發(fā)生的并發(fā)癥，在移植中新移植的材料導致移植受體身體的攻擊。在一些實例中，gvhd在輸血后發(fā)生。移植物抗宿主病可以分為急性和慢性形式。急性或暴發(fā)形式的疾病(agvhd)通常在移植之后的前100天之內(nèi)觀察到，并且由于相關的發(fā)病率和死亡率它對移植物是一項重大挑戰(zhàn)。慢性形式的移植物抗宿主病(cgvhd)通常發(fā)生在100天之后。中度至重度情況的cgvhd的出現(xiàn)不利地影響長期存活。
實例
實例1：具有或不具有卵白蛋白肽(323-339)的帶有偶聯(lián)的雷帕霉素的合成納米載體的免疫應答
材料
從巴亨美洲公司(bachemamericasinc.)(柏市街(kashiwastreet)3132號，托倫斯，加利福尼亞州(torranceca)90505，區(qū)號#4065609)購買卵白蛋白肽323-339，即一種已知為卵白蛋白的t和b細胞表位的17氨基酸肽。從tsz化學品公司(tszchem)(威爾遜街(wilsonstreet)185號，弗雷明漢，馬薩諸塞州(framingham，ma)01702；產(chǎn)品目錄#r1017)購買雷帕霉素。從surmodics制藥公司(surmodicspharmaceuticals)(湯姆馬丁路(surmodicspharmaceuticals)756號，伯明翰，亞拉巴馬州35211(birmingham，al)；產(chǎn)品代碼7525dlg7a)購買丙交酯∶乙交酯比為3∶1并且特性粘度為0.75dl/g的plga。從emd化學品公司(emdchemicals)(產(chǎn)品編號1.41350.1001)購買聚乙烯醇(85％-89％水解的)。
溶液1：在稀釋的鹽酸水溶液中的卵白蛋白肽323-339@20mg/ml。通過在室溫下將卵白蛋白肽溶解在0.13m鹽酸溶液中而制備該溶液。
溶液2：在二氯甲烷中的雷帕霉素@50mg/ml。通過將雷帕霉素溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液。
溶液3：在二氯甲烷中的plga@100mg/ml。通過將plga溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液。
溶液4：在100mm的ph8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇@50mg/ml。
用于制備含有雷帕霉素和卵白蛋白(323-339)的合成納米載體的方法
首先制備第一油包水乳液。通過將溶液1(0.2ml)、溶液2(0.2ml)、以及溶液3(1.0ml)合并在一個小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀(bransondigitalsonifier)250在50％振幅下進行聲處理40秒來制備w1/o1。然后通過將溶液4(3.0ml)與第一w1/o1乳液合并、渦旋10秒、并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進行聲處理60秒來制備第二乳液(w1/o1/w2)。
將該w1/o1/w2乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許合成納米載體形成。通過以下方式來洗滌一部分合成納米載體：將合成納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移至一個離心管中，并且在21,000×g和4℃下離心一小時、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中。重復該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的合成納米載體分散液。
通過hplc分析來確定在合成納米載體中的肽和雷帕霉素的量。通過重量法來確定每ml懸浮液的總的干燥合成納米載體質(zhì)量。
用于含有雷帕霉素的合成納米載體的方法
首先制備第一油包水乳液。通過將0.13m鹽酸溶液(0.2ml)、溶液2(0.2ml)、以及溶液3(1.0ml)合并在一個小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在50％振幅下進行聲處理40秒來制備w1/o1。然后通過將溶液4(3.0ml)與第一w1/o1乳液合并、渦旋10秒、并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進行聲處理60秒來制備第二乳液(w1/o1/w2)。
將該w1/o1/w2乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許合成納米載體形成。通過以下方式來洗滌一部分合成納米載體：將合成納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移至一個離心管中，并且在21,000×g和4℃下離心一小時、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中。重復該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的合成納米載體分散液。
通過hplc分析來確定在合成納米載體中的雷帕霉素的量。通過重量法來確定每ml懸浮液的總的干燥合成納米載體質(zhì)量。
用于測量雷帕霉素負載量的方法
收集近似3mg的合成納米載體，并且離心以使上清液與合成納米載體沉淀分離。向該沉淀添加乙腈，并且對樣品進行聲處理并且離心以去除任何不溶的材料。將該上清液和沉淀注射在rp-hplc上，并且在278nm處讀取吸光度。該沉淀中發(fā)現(xiàn)的μg用來計算％包載(負載)，在上清液和沉淀中的μg用來計算回收的總μg。
用于測量卵白蛋白(323-339)負載量的方法
收集近似3mg的合成納米載體，并且離心以使上清液與合成納米載體沉淀分離。向該沉淀添加三氟乙醇并且對樣品進行聲處理以溶解該聚合物，添加0.2％三氟乙酸并且對樣品進行聲處理并且然后離心以去除任何不溶的材料。將該上清液和沉淀注射在rp-hplc上，并且在215nm處讀取吸光度。該沉淀中發(fā)現(xiàn)的μg用來計算％包載(負載)，上清液和沉淀中的μg用來計算回收的總μg。
在treg細胞發(fā)育上的抗原特異性致耐受性樹突狀細胞(tdc)活性
該測定包括使用具有對免疫顯性卵白蛋白(323-339)特異的轉(zhuǎn)基因t細胞受體的otii小鼠。為了產(chǎn)生抗原特異性tdc，將cd11c+脾臟細胞分離，并且在1μg/ml或無抗原下在體外添加卵白蛋白(323-339)肽。然后將可溶的或納米載體封裝的雷帕霉素添加到dc中保持2小時，然后將這些dc充分洗滌以從培養(yǎng)物中去除游離雷帕霉素。將純化的應答cd4+cd25-細胞從otii小鼠分離并且以10∶1的t與dc比添加到tdc中。然后將tdc與otiit-細胞的混合物培養(yǎng)4-5天，并且通過如圖1所示的流式細胞術來分析treg細胞(cd4+cd25highfoxp3+)的頻率。基于同種型對照選擇區(qū)域。
實例2：具有偶聯(lián)的布洛芬的介孔二氧化硅納米顆粒(預示的)
介孔sio2納米顆粒核心通過溶膠-凝膠法來產(chǎn)生。將十六烷基三甲基溴化銨(ctab)(0.5g)溶解在去離子水(500ml)中，并且然后將2m的naoh水溶液(3.5ml)添加到ctab溶液中。將該溶液攪拌30分鐘，并且然后向該溶液中添加四乙氧基硅烷(teos)(2.5ml)。在80℃的溫度下將生成的凝膠攪拌3小時。通過過濾捕獲形成的白色沉淀，隨后用去離子水洗滌并且在室溫下干燥。然后通過懸浮于hcl的乙醇溶液中過夜而從顆粒中提取出殘留的表面活性劑。將這些顆粒用乙醇洗滌、離心、并且在超聲處理下再分散。這個洗滌程序另外再重復兩次。
然后使用(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷(aptms)用氨基對sio2納米顆粒進行功能化。為此，將顆粒懸浮在乙醇(30ml)中，并且將aptms(50μl)添加到懸浮液中。允許該懸浮液在室溫下靜置2小時，并且然后煮沸4小時，通過周期性地添加乙醇使體積保持恒定。殘留的反應物通過五個離心洗滌和再分散于純乙醇中的循環(huán)來去除。
在一個單獨的反應中，產(chǎn)生1-4nm直徑的金種子。在此反應中使用的所有的水首先被去離子并且然后從玻璃蒸餾。將水(45.5ml)添加到100ml圓底燒瓶中。在攪拌下，添加0.2m水性naoh(1.5ml)，隨后添加氯化四(羥甲基)鏻(thpc)的1％水溶液(1.0ml)。在添加thpc溶液之后兩分鐘，添加已經(jīng)老化至少15分鐘的氯金酸的10mg/ml水溶液(2ml)。通過用水透析來純化這些金種子。
為了形成核-殼納米載體，將以上形成的氨基功能化的sio2納米顆粒首先在室溫下與這些金種子混合2小時。將金修飾的sio2顆粒通過離心來收集，并且與氯金酸和碳酸氫鉀的水溶液混合來形成金外殼。然后將這些顆粒離心洗滌、并且再分散于水中。通過將這些顆粒懸浮于布洛芬鈉的溶液(1mg/l)中72小時來負載布洛芬。然后將游離的布洛芬通過離心從顆粒中洗滌出并且再分散于水中。
實例3：含有環(huán)孢霉素a的脂質(zhì)體(預示的)
這些脂質(zhì)體使用薄膜水合來形成。將1，2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(dppc)(32μmol)、膽固醇(32μmol)、以及環(huán)孢霉素a(6.4μmol)溶解在純氯仿(3ml)中。將此脂質(zhì)溶液添加到50ml的圓底燒瓶中，并且在60℃的溫度下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)溶劑。燒瓶然后用氮氣沖洗以去除殘留溶劑。將磷酸鹽緩沖鹽水(2ml)和五個玻璃珠添加到燒瓶中，并且通過在60℃下?lián)u晃1小時來使脂質(zhì)膜水合以形成懸浮液。將該懸浮液轉(zhuǎn)移到一個小的壓力管中并且在60℃下進行聲處理，持續(xù)四個30秒脈沖循環(huán)，其中在每個脈沖之間有30秒的延遲。然后使懸浮液在室溫下靜置2小時，以允許完全水合。離心洗滌脂質(zhì)體，隨后再懸浮于新鮮磷酸鹽緩沖鹽水中。
實例4：含有聚合物-雷帕霉素共軛物的聚合納米載體(預示的)
plga-雷帕霉素共軛物的制備：
將具有酸端基的plga聚合物(7525dlg1a，酸值0.46mmol/g，lakeshore生物材料公司(lakeshorebiomaterials)；5g，2.3mmol，1.0當量)溶解在30ml的二氯甲烷(dcm)中。添加n，n-二環(huán)己基碳二亞胺(1.2當量，2.8mmol，0.57g)，隨后添加雷帕霉素(1.0當量，2.3mmol，2.1g)和4-二甲氨基吡啶(dmap)(2.0當量，4.6mmol，0.56g)。將混合物在室溫下攪拌2天。然后過濾混合物以去除不溶的二環(huán)己脲。將濾液濃縮至體積大約為10ml并且添加到100ml的異丙醇(ipa)中以沉淀出plga-雷帕霉素共軛物。將ipa層去除并且聚合物然后用50ml的ipa和50ml的甲基叔丁醚(mtbe)洗滌。然后將聚合物在35℃下真空干燥2天，給出呈白色固體的plga-雷帕霉素(大約6.5g)。
含有plga-雷帕霉素共軛物和卵白蛋白肽(323-339)的納米載體的制備：
根據(jù)實例1中所述的程序如下制備含有plga-雷帕霉素的納米載體：
如下制備用于納米載體形成的溶液：
溶液1：在稀釋的鹽酸水溶液中的卵白蛋白肽323-339@20mg/ml。通過在室溫下將卵白蛋白肽溶解在0.13m鹽酸溶液中而制備該溶液。溶液2：在二氯甲烷中的plga-雷帕霉素@100mg/ml。通過將plga-雷帕霉素溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液。溶液3：在二氯甲烷中的pla-peg@100mg/ml通過將pla-peg溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液。溶液4：在100mm的ph8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇@50mg/ml。
首先制備第一油包水乳液。通過將溶液1(0.2ml)、溶液2(0.75ml)、以及溶液3(0.25ml)合并在一個小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在50％振幅下進行聲處理40秒來制備w1/o1。然后通過將溶液4(3.0ml)與第一w1/o1乳液合并、渦旋10秒、并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進行聲處理60秒來制備第二乳液(w1/o1/w2)。將該w1/o1/w2乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許納米載體形成。通過以下方式來洗滌一部分納米載體：將納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移至一個離心管中，并且在75,600×g和4℃下離心35分鐘、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中。重復該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的納米載體分散液。
實例5：含有雷帕霉素的金納米載體(aunc)的制備(預示的)
hs-peg-雷帕霉素的制備：
將peg酸二硫化物(1.0當量)、雷帕霉素(2.0-2.5當量)、dcc(2.5當量)以及dmap(3.0當量)在無水dmf中的溶液在室溫下攪拌過夜。通過過濾去除不溶的二環(huán)己脲并且將濾液添加到異丙醇(ipa)中以沉淀出peg-二硫化物-二-雷帕霉素酯并用ipa洗滌并干燥。聚合物然后用在dmf中的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽處理，以便將peg二硫化物還原成硫醇基peg雷帕霉素酯(hs-peg-雷帕霉素)。通過沉淀從ipa回收生成的聚合物并且如先前所述進行干燥并且通過hnmr和gpc來分析。
金nc(aunc)的形成：
在一個裝備有冷凝器的1l圓底燒瓶中，在劇烈攪拌下加熱回流500ml的1mmhaucl4的水溶液10分鐘。然后向攪拌的溶液迅速添加50ml的40mm的檸檬酸三鈉溶液。將生成的深酒紅色溶液保持回流25-30分鐘，然后停止加熱，并且冷卻該溶液至室溫。然后通過一個0.8μm薄膜過濾器過濾該溶液，以給出aunc溶液。使用可見光譜學和透射電子顯微術表征aunc。這些aunc直徑為大約20nm，被檸檬酸鹽包裹，并且吸收峰在520nm處。
具有hs-peg-雷帕霉素的aunc共軛物：
將150μl的hs-peg-雷帕霉素的溶液(10μm，在10mmph9.0碳酸鹽緩沖液中)添加到1ml的20nm直徑的檸檬酸鹽包裹的金納米載體(1.16nm)中，以產(chǎn)生2500∶1的硫醇基與金的摩爾比。在室溫在氬下攪拌混合物1小時以允許金納米載體上的硫醇與檸檬酸鹽完全交換。然后通過在12,000g下離心30分鐘將表面上的具有peg-雷帕霉素的aunc純化。將上清液傾析出來并且然后將含有aunc-s-peg-雷帕霉素的沉淀用1xpbs緩沖液沉淀洗滌。然后將純化的金-peg-雷帕霉素納米載體再懸浮于合適的緩沖液中以便進行進一步分析和生物測定。
實例6：含有卵白蛋白的介孔二氧化硅-金核-殼納米載體(預示的)
介孔sio2納米顆粒核心通過溶膠-凝膠法來產(chǎn)生。將十六烷基三甲基溴化銨(ctab)(0.5g)溶解在去離子水(500ml)中，并且然后將2m的naoh水溶液(3.5ml)添加到ctab溶液中。將該溶液攪拌30分鐘，并且然后向該溶液中添加四乙氧基硅烷(teos)(2.5ml)。在80℃的溫度下將生成的凝膠攪拌3小時。通過過濾捕獲形成的白色沉淀，隨后用去離子水洗滌并且在室溫下干燥。然后通過懸浮于hcl的乙醇溶液中過夜而從顆粒中提取出殘留的表面活性劑。將這些顆粒用乙醇洗滌、離心、并且在超聲處理下再分散。這個洗滌程序另外再重復兩次。
然后使用(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷(aptms)用氨基對sio2納米顆粒進行功能化。為此，將顆粒懸浮在乙醇(30ml)中，并且將aptms(50μl)添加到懸浮液中。允許該懸浮液在室溫下靜置2小時，并且然后煮沸4小時，通過周期性地添加乙醇使體積保持恒定。殘留的反應物通過五個離心洗滌和再分散于純乙醇中的循環(huán)來去除。
在一個單獨的反應中，產(chǎn)生1-4nm直徑的金種子。在此反應中使用的所有的水首先被去離子并且然后從玻璃蒸餾。將水(45.5ml)添加到100ml圓底燒瓶中。在攪拌下，添加0.2m水性naoh(1.5ml)，隨后添加氯化四(羥甲基)鏻(thpc)的1％水溶液(1.0ml)。在添加thpc溶液之后兩分鐘，添加已經(jīng)老化至少15分鐘的氯金酸的10mg/ml水溶液(2ml)。通過用水透析來純化這些金種子。
為了形成核-殼納米載體，將以上形成的氨基功能化的sio2納米顆粒首先在室溫下與這些金種子混合2小時。將金修飾的sio2顆粒通過離心來收集，并且與氯金酸和碳酸氫鉀的水溶液混合來形成金外殼。然后將這些顆粒離心洗滌、并且再分散于水中。通過將這些顆粒懸浮于硫醇化的卵白蛋白溶液(1mg/l)中72小時來負載硫醇化的卵白蛋白(通過用2-亞氨基硫烷鹽酸鹽處理卵白蛋白而制成)。顆粒然后用1xpbs(ph7.4)沉淀洗滌以去除游離蛋白。然后將生成的含有卵白蛋白的二氧化硅-金核-殼納米載體再懸浮于1xpbs中以便進行進一步分析和測定。
實例7：含有雷帕霉素和卵白蛋白的脂質(zhì)體(預示的)
這些脂質(zhì)體通過薄膜水合來形成。將1，2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(dppc)(32μmol)、膽固醇(32μmol)、以及雷帕霉素(6.4μmol)溶解在純氯仿(3ml)中。將此脂質(zhì)溶液添加到10ml玻璃管中，并且在氮氣流下去除溶劑并且真空干燥6小時。通過用2.0ml的25mmmops緩沖液ph8.5使該膜水合來獲得多層囊泡，其含有過量的卵白蛋白。使管渦旋，直到脂質(zhì)膜從管表面上剝落。為了將多層囊泡打破成單層的，應用十個冷凍(液氮)和融化(30℃水浴)循環(huán)。然后將樣品在25mmmops緩沖液ph8.5中稀釋到1ml。通過使樣品10倍穿過200nm孔聚碳酸酯過濾器而擠出將生成的脂質(zhì)體的大小均勻化。然后使用生成的脂質(zhì)體用于進一步分析和生物測定。
實例8：由具有表面共軛的卵白蛋白的修飾聚氨基酸組成的聚合納米載體(預示的)
步驟1.用l-苯丙氨酸乙酯(l-pae)修飾的聚(γ-谷氨酸)(γ-pga)的制備：將4.7單位毫摩爾的γ-pga(mn＝300kd)溶解在0.3n-nahco3水溶液(50ml)中。將l-pae(4.7mmol)和edc.hcl(4.7mmol)添加到該溶液中并且在4c下攪拌30分鐘。然后在攪拌下將該溶液保持在室溫24小時。使用具有mwco50kd的透析薄膜通過滲析去除低分子量化學物質(zhì)。通過凍干獲得生成的γ-pga-接枝-l-pae。
步驟2.由γ-pga-接枝-l-pae聚合物制備納米顆粒：由γ-pga-接枝-l-pae組成的納米顆粒通過沉淀和透析方法來制備。將γ-pga-接枝-l-pae(20mg)溶解在2ml的dmso中，隨后添加2ml的水以形成半透明溶液。然后在室溫下用蒸餾水使用纖維素薄膜配管(50,000mwco)透析該溶液72小時，以形成納米顆粒并且去除有機溶劑。蒸餾水以12小時的間隔進行更換。然后使用生成的納米顆粒溶液(在水中的10mg/ml)以用于抗原共軛。
步驟3.卵白蛋白與γ-pga納米顆粒的共軛：γ-pga納米顆粒(10mg/ml)的表面羧酸基團首先在環(huán)境溫度下通過edc和nhs(各自在磷酸鹽緩沖液中的10mg/ml，ph5.8)活化2小時。在沉淀洗滌以去除過量的edc/nhs之后，將活化的納米顆粒與1ml的卵白蛋白(10mg/ml)混合在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs，ph7.4)中，并且將混合物在4c-8c下孵育24小時。將生成的卵白蛋白共軛的γ-pga納米顆粒用pbs洗滌兩次并且以5mg/ml再懸浮于pbs中以便進行進一步分析和生物測定。
實例9：紅細胞生成素(epo)封裝的γ-pga納米顆粒(預示的)
為了制備epo封裝的γ-pga納米顆粒，將0.25-4mg的epo溶解在1ml的pbs(ph7.4)中，并且將1ml的γ-pga-接枝-l-pae(dmso中的10mg/ml)添加到epo溶液中。將生成的溶液在14,000xg下離心15分鐘并且用pbs重復清洗。然后將生成的epo封裝的γ-pga納米顆粒再懸浮于pbs(5mg/ml)中以便進行進一步分析和生物測定。
實例10：含有卵白蛋白的金納米載體(aunc)的制備(預示的)
步驟1.金nc(aunc)的形成：在一個裝備有冷凝器的1l圓底燒瓶中，在劇烈攪拌下加熱回流500ml的1mmhaucl4的水溶液10分鐘。然后向攪拌的溶液迅速添加50ml的40mm的檸檬酸三鈉溶液。將生成的深酒紅色溶液保持回流25-30分鐘，然后停止加熱，并且冷卻該溶液至室溫。然后通過一個0.8μm薄膜過濾器過濾該溶液，以給出aunc溶液。使用可見光譜學和透射電子顯微術表征aunc。這些aunc直徑為大約20nm，被檸檬酸鹽包裹，并且吸收峰在520nm處。
步驟2.卵白蛋白與aunc的共軛：將150μl的硫醇化的卵白蛋白溶液(在10mmph9.0碳酸鹽緩沖液中的10μm)添加到1ml的20nm直徑的檸檬酸鹽包裹的金納米載體(1.16nm)中，以產(chǎn)生2500∶1的硫醇基與金的摩爾比。在室溫在氬下攪拌混合物1小時以允許金納米載體上的硫醇與檸檬酸鹽完全交換。然后通過在12,000g下離心30分鐘將表面上的具有卵白蛋白的aunc純化。將上清液傾析出來并且然后將含有aunc-卵白蛋白的沉淀用1xpbs緩沖液沉淀洗滌。然后將純化的金-卵白蛋白納米載體再懸浮于合適的緩沖液中以便進行進一步分析和生物測定。
實例11：通過t細胞表型分析評估致耐受性免疫應答(預示的)
將本發(fā)明的組合物溶解磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中并且以含500μg的該組合物的0.1-0.2ml肌內(nèi)地注射到雌路易斯鼠中。一個大鼠對照組接收0.1-0.2ml的pbs。在注射之后9到10天，從這些小鼠收獲脾臟和淋巴結(jié)并且通過經(jīng)由40μm的尼龍細胞濾網(wǎng)浸軟組織來獲得單細胞懸浮液。在pbs(1％fcs)中對樣品進行染色，并且適當?shù)叵♂屜嚓P單克隆抗體。碘化丙啶染色細胞從分析中排除。在lsr2流式細胞儀(bd生物科學公司(bdbiosciences)，usa)上獲得樣品并且使用facsdiva軟件進行分析。在細胞上分析標記cd8、cd25以及foxp3的表達。cd8+cd25+foxp3+細胞的存在表明對treg細胞的誘導。
實例12：在體內(nèi)評估針對自身抗原的致耐受性免疫應答(預示的)
給予balb/c小鼠包含mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位的一種自身抗原，并且評定cd8+調(diào)節(jié)性t細胞增殖的水平。隨后，以劑量依賴性方式皮下給予包含該自身抗原或其部分以及一種免疫抑制劑的本發(fā)明的一種組合物，該自身抗原或其部分包含這些表位。再次評定cd8+調(diào)節(jié)性t細胞增殖的水平的增加，表明了致耐受性免疫應答。
實例13：體內(nèi)誘導針對可移植的骨髓細胞的所希望的免疫應答(預示的)
在受試者接受骨髓移植前四周，向受試者皮下給予一個群體的至少106個合成納米載體，這些合成納米載體包含免疫抑制劑和從骨髓細胞中獲得或衍生出的抗原。在該受試者接受該移植之后，在接受該移植后的第一周期間內(nèi)每日一次、并且然后在接下來三周每周一次、并且然后在接下來11周每個月一次地對該受試者中的所希望的免疫應答的產(chǎn)生進行評定。作為評定的一部分，取得cd8+調(diào)節(jié)性t細胞計數(shù)，并且與向該受試者給予骨髓移植或這些合成納米載體之前取得的cd8+調(diào)節(jié)性t細胞計數(shù)進行比較。在第一年期間，向該受試者雙月地給予維持劑量的這些合成納米載體。該受試者預期會展現(xiàn)出更高的或所希望的水平的對該骨髓移植特異的cd8+調(diào)節(jié)性t細胞。
實例14：在給予nc之后從受試者中分離cd8+調(diào)節(jié)性t細胞(tregs)細胞(預示的)
從生物樣品中，例如從受試者給予在此所描述的合成納米載體(nc)之后而從該受試者中獲得的外周血中分離出cd8+tregs。典型地，該生物樣品是從足以使被給予的nc誘導cd8+tregs的時間段之后的該受試者中獲得的。通過陰性和/或陽性選擇，從生物樣品中(例如，從全血中)分離出cd8+tregs。
例如，通過離心獲得全血的細胞部分，并且使用紅細胞溶解緩沖液細胞溶解紅細胞。在細胞溶解之后，外周血單核細胞耗盡cd4+細胞，包括cd4+t細胞。隨后，通過陽性選擇cd8、foxp3、和/或cd25來富集cd8+tregs。
cd8+foxp3+cd25+tregs經(jīng)常是cd127lo或cd127-(cd127lo/-)。cd127(il-7受體的α鏈)表達在大多數(shù)的成熟t細胞上，并且對它們的增殖和分化起重要作用。然而，在調(diào)節(jié)性t細胞上，不存在cd127或在十分低的水平下表達，并且它的表達與foxp3表達呈負相關。因此，在一些實施例中，cd127用作另外的標記在調(diào)節(jié)性t細胞與活化的t細胞之間進行區(qū)別。在此類實施例中，進行cd127的陰性選擇以富集cd8+tregs。
在一些實施例中，使用用于耗盡非cd8+和cd127high細胞的生物素化的抗體和抗生物素磁珠的混合以及用于隨后陽性選擇cd8+cd25+cd127lo/-細胞的cd25生物素化的抗體和抗生物素磁珠來進行cd8+cd25+cd127lo/-調(diào)節(jié)性t細胞的分離。典型地，如此分離的細胞是foxp3+，因此構成cd8+tregs。
實例15：評定具有抗原和免疫抑制劑的納米載體的作用
納米載體
從巴亨美洲公司(柏市街3132號，托倫斯，加利福尼亞州90505，區(qū)號#4065609)購買卵白蛋白肽323-339，即一種已知為卵白蛋白的t和b細胞表位的17氨基酸肽。從surmodics制藥公司(湯姆馬丁路756號，伯明翰，亞拉巴馬州35211；產(chǎn)品代碼7525dlg7a)購買丙交酯∶乙交酯比為3∶1并且特性粘度為0.75dl/g的plga。合成了peg嵌段大約為5,000da并且pla嵌段大約為20,000da的pla-peg嵌段共聚物。從emd化學品公司(產(chǎn)品編號1.41350.1001)購買聚乙烯醇(85％-89％水解的)。
如下制備溶液：溶液1：在稀釋的鹽酸水溶液中的卵白蛋白肽323-339@20mg/ml。通過在室溫下將卵白蛋白肽溶解在0.13m鹽酸溶液中而制備該溶液。溶液2：在二氯甲烷中的plga@100mg/ml。通過將plga溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液。溶液3：在二氯甲烷中的pla-peg@100mg/ml通過將pla-peg溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液。溶液4：在100mm的ph8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇@50mg/ml。首先制備第一油包水乳液。通過將溶液1(0.2ml)、溶液2(0.75ml)、以及溶液3(0.25ml)合并在一個小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在50％振幅下進行聲處理40秒來制備w1/o1。然后通過將溶液4(3.0ml)與第一w1/o1乳液合并、渦旋10秒、并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進行聲處理60秒來制備第二乳液(w1/o1/w2)。
將該w1/o1/w2乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許納米載體形成。通過以下方式來洗滌一部分納米載體：將納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移至一個離心管中，并且以75,600×g和4℃離心45分鐘、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中。重復該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的納米載體分散液。
通過動態(tài)光散射來確定納米載體大小。通過hplc分析來確定在納米載體中的肽的量。通過重量法來確定每ml懸浮液的總的干燥納米載體質(zhì)量。
從巴亨美洲公司(柏市街3132號，托倫斯，加利福尼亞州90505，區(qū)號#4065609)購買卵白蛋白肽323-339，即一種已知為卵白蛋白的t和b細胞表位的17氨基酸肽。從tsz化學品公司(威爾遜街185號，弗雷明漢，馬薩諸塞州01702；產(chǎn)品目錄#r1017)購買雷帕霉素。從surmodics制藥公司(湯姆馬丁路756號，伯明翰，亞拉巴馬州35211；產(chǎn)品代碼7525dlg7a)購買丙交酯∶乙交酯比為3∶1并且特性粘度為0.75dl/g的plga。合成了peg嵌段大約為5,000da并且pla嵌段大約為20,000da的pla-peg嵌段共聚物。從emd化學品公司(產(chǎn)品編號1.41350.1001)購買聚乙烯醇(85％-89％水解的)。
如下制備溶液：溶液1：在稀釋的鹽酸水溶液中的卵白蛋白肽323-339@20mg/ml。通過在室溫下將卵白蛋白肽溶解在0.13m鹽酸溶液中而制備該溶液。溶液2：在二氯甲烷中的雷帕霉素@50mg/ml。通過將雷帕霉素溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液。溶液3：在二氯甲烷中的plga@100mg/ml。通過將plga溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液。溶液4：在二氯甲烷中的pla-peg@100mg/ml該溶液通過將pla-peg溶解在純二氯甲烷中而制備。溶液5：在100mm的ph8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇@50mg/ml。
首先制備第一油包水乳液。通過將溶液1(0.2ml)、溶液2(0.2ml)、溶液3(0.75ml)、以及溶液4(0.25ml)合并在一個小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在50％振幅下進行聲處理40秒來制備w1/o1。然后通過將溶液5(3.0ml)與第一w1/o1乳液合并、渦旋10秒、并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進行聲處理60秒來制備第二乳液(w1/o1/w2)。
將該w1/o1/w2乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許納米載體形成。通過以下方式來洗滌一部分納米載體：將納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移至一個離心管中，并且以21,000×g和4℃離心45分鐘、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中。重復該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的納米載體分散液。
通過動態(tài)光散射來確定納米載體大小。通過hplc分析來確定在納米載體中的肽和雷帕霉素的量。通過重量法來確定每ml懸浮液的總的干燥納米載體質(zhì)量。
通過動態(tài)光散射(dls)獲得合成納米載體尺寸的測量值。將合成納米載體的懸浮液用純化水稀釋到以達到近似0.01至0.1mg/ml的最終的合成納米載體懸浮液濃度。在一個適合的比色皿中直接制備稀釋的懸浮液以用于dls分析。然后將該比色皿置于布魯克海文儀器公司(brookhaveninstrumentscorp.)zetapals中，允許其平衡至25℃，并且然后掃描充分的時間以在介質(zhì)的粘度和樣品的折射率的適當輸入的基礎上獲得穩(wěn)定且可再現(xiàn)的分布。然后報告有效直徑，或該分布的平均值。
免疫
將納米載體融化并平衡。初始稀釋液構成一個10x儲備溶液，并且進一步在ova323-339中稀釋到100μg/ml的濃度或1x溶液。將此1x溶液用于以每靜脈內(nèi)注射按200μl進行注射。將動物用ova蛋白(ova)免疫并且用ova323-339肽處理。免疫途徑如下：10μg的ova+4mg明礬(alum)，腹膜內(nèi)，在每只balb/c初次接受試驗的雌性小鼠400μl中。實驗組各自由5只動物組成。脾細胞用抗原使用cfse或cto重新刺激，以便測定抗原特異性增殖的量。
測量cd8+調(diào)節(jié)性t細胞
借助流式細胞檢測計算卵白蛋白反應性il-10分泌的cd8+t細胞的頻率。在完全培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2下用卵白蛋白蛋白質(zhì)將脾細胞培養(yǎng)3天。在第3天，使用標準的方法和試劑盒、通過胞內(nèi)染色測定這些細胞分泌不同的細胞因子的潛力。簡單地說，將細胞用乙酸肉豆蔻佛波醇(pma)和離子霉素重新刺激2小時，并且阻斷蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運持續(xù)另外的4小時。將未特異性結(jié)合的抗體用抗cd16/32抗體阻斷，并且然后用特異性識別cd8、tcr、cd122以及cxcr5的共軛抗體對細胞進行染色。在用多聚甲醛固定之后，將細胞透化以允許單克隆抗體進入這些細胞并且標記細胞內(nèi)表位(細胞因子)。確定cd8+tcr+cd122+cxcr5+il-10+細胞的比例。
結(jié)果
圖2證明了這些納米載體在灌洗樣品中產(chǎn)生cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的有效性，這些清洗樣品來自用包含ova323-339和免疫抑制劑的合成納米載體處理的動物受試者。
實例16：評定具有抗原和免疫抑制劑的納米載體的作用(預示的)
納米載體
類似于以上實例(實例15)使用mhci類限制性肽sinfekl(seqidno：944)代替卵白蛋白肽來制備納米載體。
免疫
將這些納米載體融化并平衡。初始稀釋液構成一個10x儲備溶液，并且進一步在肽中稀釋到100μg/ml的濃度或1x溶液。將這個1x溶液用于以每靜脈內(nèi)注射按200μl進行注射。將動物用包含該肽的蛋白質(zhì)免疫并且用肽處理。免疫途徑如下：10μg的肽+4mg明礬(alum)，腹膜內(nèi)，每只balb/c初次接受試驗的雌性小鼠400μl。實驗組各自由5只動物組成。脾細胞用抗原使用cfse或cto重新刺激，以便測定抗原特異性增殖的量。
測量cd8+調(diào)節(jié)性t細胞
借助流式細胞檢測計算卵白蛋白反應性il-10分泌的cd8+t細胞的頻率。在完全培養(yǎng)基中，在37c、5％co2下用蛋白質(zhì)將脾細胞培養(yǎng)3天。在第3天，使用標準的方法和試劑盒、通過胞內(nèi)染色測定這些細胞分泌不同的細胞因子的潛力。簡單地說，將細胞用乙酸肉豆蔻佛波醇(pma)和離子霉素重新刺激2小時，并且阻斷蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運持續(xù)另外的4小時。未特異性結(jié)合的抗體用抗cd16/32抗體阻斷，并且然后用特異性識別cd8、tcr、cd122以及cxcr5的共軛抗體對細胞進行染色。在用多聚甲醛固定之后，將細胞透化以允許單克隆抗體進入這些細胞并且標記細胞內(nèi)表位(細胞因子)。確定cd8+tcr+cd122+cxcr5+il-10+細胞的比例。
以下實施方案內(nèi)容對應于原申請的權利要求書：
1.一種方法，包括：
向受試者給予一種組合物，該組合物包含：
(i)第一群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，和
(ii)第二群體的合成納米載體，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)，其中該組合物處于有效在該受試者中產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的量。
2.一種方法，包括：
通過給予一種組合物在受試者中產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞，該組合物包含：
(i)第一群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，和
(ii)第二群體的合成納米載體，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。
3.一種方法，包括：
根據(jù)一種治療方案向受試者給予一種組合物，該治療方案先前已經(jīng)顯示在一個或多個測試受試者中產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞；
其中，該組合物包含：
(i)第一群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，和
(ii)第二群體的合成納米載體，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。
4.如實施方案1-3中任一項所述的方法，其中該第一群體和該第二群體是相同的群體。
5.如實施方案1-4中任一項所述的方法，其中該方法進一步包括提供或鑒定該受試者。
6.如實施方案1-5中任一項所述的方法，其中該抗原是一種治療性蛋白、一種自身抗原或一種過敏原，或與炎性疾病、自身免疫性疾病、器官或組織排斥或移植物抗宿主病相關聯(lián)。
7.如實施方案1-6中任一項所述的方法，其中該方法進一步包括在給予該組合物之前和/或之后評定該受試者中的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的產(chǎn)生。
8.如實施方案1-7中任一項所述的方法，其中該受試者具有或正處于具有一種炎性疾病、一種自身免疫性疾病、一種過敏癥、器官或組織排斥或移植物抗宿主病的風險中。
9.如實施方案1-7中任一項所述的方法，其中該受試者已經(jīng)經(jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷移植。
10.如實施方案1-7中任一項所述的方法，其中該受試者具有或正處于具有針對一種治療性蛋白的一種所不希望的免疫應答的風險中，該治療性蛋白是正被給予或?qū)⒁唤o予該受試者的。
11.如實施方案1-10中任一項所述的方法，其中該方法進一步包括向該受試者給予一種可移植的移植物或治療性蛋白。
12.如實施方案1-11中任一項所述的方法，其中向該受試者給予一個或多個維持劑量的組合物，該組合物包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體。
13.如實施方案1-12中任一項所述的方法，其中這些合成納米載體的給予是通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、透粘膜、經(jīng)口、皮下、肺部、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)給予而進行的。
14.如實施方案1-13中任一項所述的方法，其中這些合成納米載體的給予是通過吸入或靜脈內(nèi)、皮下或透粘膜給予而進行的。
15.如實施方案1-14中任一項所述的方法，其中當該治療性蛋白作為一個或多個單元(cell)被提供時，該可移植的移植物或治療性蛋白的給予是通過腸胃外、動脈內(nèi)、鼻內(nèi)或靜脈內(nèi)給予或通過注射至淋巴結(jié)或眼前房或通過局部給予至感興趣的器官或組織而進行的。
16.如實施方案1-15中任一項所述的方法，其中該方法進一步包括收集所產(chǎn)生的這些抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞。
17.如實施方案1-16中任一項所述的方法，其中這些免疫抑制劑包括一種抑制素、一種mtor抑制劑、一種tgf-β信號劑、一種皮質(zhì)類固醇、一種線粒體功能抑制劑、一種p38抑制劑、一種nf-κβ抑制劑、一種腺苷受體激動劑、一種前列腺素e2激動劑、一種磷酸二酯酶4抑制劑、一種hdac抑制劑、或一種蛋白酶體抑制劑。
18.如實施方案17所述的方法，其中該mtor抑制劑是雷帕霉素。
19.如實施方案1-18中任一項所述的方法，其中平均在這些第一和/或第二群體的合成納米載體上的這些免疫抑制劑和/或表位的負載是在0.0001％與50％之間(重量/重量)。
20.如實施方案19所述的方法，其中平均在這些第一和/或第二群體的合成納米載體上的這些免疫抑制劑和/或表位的負載是在0.1％與10％之間。
21.如實施方案1-20中任一項所述的方法，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體包括脂質(zhì)納米顆粒、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹枝狀化合物、巴基球、納米線、病毒樣顆粒、或肽或蛋白質(zhì)顆粒。
22.如實施方案21所述的方法，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體包括脂質(zhì)納米顆粒。
23.如實施方案22所述的方法，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體包括脂質(zhì)體。
24.如實施方案21所述的方法，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體包括金屬納米顆粒。
25.如實施方案24所述的方法，其中這些金屬納米顆粒包括金納米顆粒。
26.如實施方案21所述的方法，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體包括聚合物納米顆粒。
27.如實施方案26所述的方法，其中該聚合物納米顆粒包括聚合物，該聚合物是一種非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。
28.如實施方案26或27所述的方法，其中這些聚合物納米顆粒包括聚酯、與聚醚偶聯(lián)的聚酯、聚氨基酸、聚碳酸酯、聚縮醛、聚縮酮、多糖、聚乙基噁唑啉、或聚乙烯亞胺。
29.如實施方案28所述的方法，其中該聚酯包括一種聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、或聚己酸內(nèi)酯。
30.如實施方案28或29所述的方法，其中這些聚合物納米顆粒包括聚酯以及與聚醚偶聯(lián)的聚酯。
31.如實施方案28-30中任一項所述的方法，其中該聚醚包括聚乙二醇或聚丙二醇。
32.如實施方案1-31中任一項所述的方法，其中使用對該第一和/或第二群體的這些合成納米載體進行的動態(tài)光散射而獲得的粒度分布的平均值是大于100nm的直徑。
33.如實施方案32所述的方法，其中該直徑大于150nm。
34.如實施方案33所述的方法，其中該直徑大于200nm。
35.如實施方案34所述的方法，其中該直徑大于250nm。
36.如實施方案35所述的方法，其中該直徑大于300nm。
37.如實施方案1-36中任一項所述的方法，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體的長寬比大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10。
38.如實施方案16-37中任一項所述的方法，其中該方法進一步包括制造一種劑型，該劑型包含所收集的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞。
39.如實施方案16-38中任一項所述的方法，其中該方法進一步包括制造可供使用的收集的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞或可供受試者給予的劑型。
40.如實施方案16-39中任一項所述的方法，其中該方法進一步包括使一種可移植的移植物或治療性蛋白包括具有收集的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞或劑型。
41.一種組合物，該組合物包含根據(jù)實施方案1-40中任一項所述的方法產(chǎn)生的分離的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞。
42.如實施方案41所述的組合物，其中該組合物進一步包含一種藥學上可接受的賦形劑。
43.如實施方案41或42所述的組合物，其中該組合物進一步包含一種可移植的移植物或治療性蛋白。
44.一種包含如實施方案41-43中任一項所述的組合物的劑型。
45.一種方法，包括：
(i)產(chǎn)生第一群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，并且
(ii)產(chǎn)生第二群體的合成納米載體，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。
46.如實施方案45所述的方法，其中該第一群體和第二群體是相同的群體。
47.如實施方案45或46所述的方法，其中該方法進一步包括制造一種包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體的劑型。
48.如實施方案45-47中任一項所述的方法，其中該方法進一步包括制造一種包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體的組合物、或可供受試者給予的劑型。
49.如實施方案45-48中任一項所述的方法，其中該方法進一步包括評定使用一種組合物的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的產(chǎn)生，該組合物包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體。
50.如實施方案45-49中任一項所述的方法，其中該組合物處于有效產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的量。
51.如實施方案45-50中任一項所述的方法，其中產(chǎn)生的這些第一群體和第二群體的合成納米載體是如在實施方案1-43中任一項所定義的。
52.一種用于生產(chǎn)一種組合物或劑型的工藝，該工藝包括以下步驟：
(i)將第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，并且
(ii)將第二群體的合成納米載體與一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。
53.如實施方案52所述的工藝，該工藝包括如在實施方案45-52中任一項所述的方法中所定義的步驟。
54.一種如在實施方案1-43中任一項所定義的組合物。
55.一種具有如實施方案54所述的組合物的劑型。
56.一種通過如實施方案45-52中任一項所述的方法或工藝可獲得的組合物或劑型。
57.一種供在治療或預防中使用的如實施方案41-43和54中任一項所述的組合物或如實施方案44所述的劑型。
58.一種供在受試者中產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的方法、治療或預防過敏癥、自身免疫性疾病、炎性疾病、器官或組織排斥或移植物抗宿主病或如實施方案1-40中任一項所定義的方法中使用的如實施方案41-43、54和56中任一項所述的組合物或如實施方案44或55所述的劑型。
59.如實施方案41-43、54和56中任一項所述的組合物或如實施方案44或55所述的劑型用于制造一種藥劑的用途，該藥劑用于在受試者中產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的方法、治療或預防過敏癥、自身免疫性疾病、炎性疾病、器官或組織排斥或移植物抗宿主病或如實施方案1-40中任一項所定義的方法中使用。
60.一種包含如實施方案56-58中任一項所述的組合物的劑型。
61.一種供在治療或預防中使用的包含分離的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞的組合物，所述分離的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞通過一種工藝可獲得，該工藝包括以下步驟：(a)通過給予一種組合物在受試者中產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞，該組合物包含：(i)第一群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，和
(ii)第二群體的合成納米載體，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)；并且(b)收集所產(chǎn)生的抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞。
62.如實施方案61所述的組合物，該組合物是如在實施方案41-43中任一項所定義的。
63.一種組合物，包含：(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的mhci類限制性表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)，該組合物用于在治療或預防中使用。
64.如實施方案63所述的組合物，其中該組合物是如在實施方案1-40中任一項所定義的。
65.如實施方案41-43、61和62中任一項所述或如在實施方案1-40和56中任一項所定義的組合物、或如實施方案44所述的劑型，用于在治療或預防中使用。
66.如實施方案41-43、61和62中任一項所述或如在實施方案1-40和56中任一項所定義的組合物、或如實施方案44所述的劑型，用于在受試者中促進一種致耐受性免疫應答或產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞。
67.如實施方案41-43、61和62中任一項所述或如在實施方案1-40和56中任一項所定義的組合物、或如實施方案44所述的劑型用于制造一種藥劑的用途，該藥劑用于在受試者中促進一種致耐受性免疫應答或產(chǎn)生抗原特異性cd8+調(diào)節(jié)性t細胞中使用。
68.一種包含如實施方案56-58和61-66中任一項所述的組合物的劑型。
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