本發(fā)明涉及中藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種具有促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化的中藥組合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：長(zhǎng)期以來(lái)，一直被認(rèn)為脂肪細(xì)胞的主要功能是儲(chǔ)存能量。但隨著對(duì)脂肪細(xì)胞的深入研究，脂肪細(xì)胞其它方面的功能也逐漸顯露出來(lái)。研究表明脂肪細(xì)胞在免疫反應(yīng)、高血壓、肥胖、胰島素抵抗等代謝疾病中都起著重要的作用。最初，脂肪細(xì)胞被分為兩類(lèi)：白色脂肪細(xì)胞與褐色脂肪細(xì)胞。但隨著嚙齒動(dòng)物腹股溝脂肪部位的beige(brown-in-white,brite)細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，褐色脂肪細(xì)胞又可以被細(xì)分為兩類(lèi)：經(jīng)典的褐色脂肪細(xì)胞與brite/beige脂肪細(xì)胞。白色脂肪細(xì)胞內(nèi)含有一個(gè)巨大的圓形脂滴，細(xì)胞核呈扁平狀且位于細(xì)胞邊緣。脂滴幾乎占據(jù)了細(xì)胞的99％的空間。白色脂肪細(xì)胞主要是通過(guò)甘油三酯和膽固醇的形式，將能量?jī)?chǔ)存于脂滴當(dāng)中。但是白色脂肪細(xì)胞不僅可以?xún)?chǔ)存能量，它還可以分泌脂肪細(xì)胞因子如：脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素、腫瘤壞死因子α等等。這些脂肪細(xì)胞因子在能量代謝調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)等多種生理現(xiàn)象中發(fā)揮著重要作用。褐色脂肪細(xì)胞的外形呈多邊形，細(xì)胞核為圓形，且細(xì)胞內(nèi)的脂滴呈多室分布于整個(gè)細(xì)胞中。褐色脂肪細(xì)胞含有大量的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，并且細(xì)胞內(nèi)的線粒體含量很高。因?yàn)榫€粒體內(nèi)的細(xì)胞色素含有鐵原子，所以含有大量線粒體的褐色脂肪細(xì)胞的顏色為褐色。褐色脂肪細(xì)胞不同于白色脂肪細(xì)胞的主要特征是：線粒體內(nèi)膜上的解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)的表達(dá)量很高。所以，褐色脂肪細(xì)胞的主要功能就是通過(guò)UCP1來(lái)產(chǎn)熱從而消耗能量而不產(chǎn)生ATP：即褐色脂肪細(xì)胞可以通過(guò)UCP1，將線粒體內(nèi)的電子傳遞鏈與ATP合成解偶聯(lián)，進(jìn)而通過(guò)氧化磷酸化解偶聯(lián)呼吸，將脂肪酸β氧化產(chǎn)生的能量以熱量的形式散失掉。褐色脂肪細(xì)胞的非顫栗性產(chǎn)熱功能，可以維持體溫恒定，也可以以熱能的方式消耗機(jī)體攝入的能量，從而降低肥胖發(fā)生的概率。兩種褐色脂肪細(xì)胞的分布是不同的，經(jīng)典的褐色脂肪細(xì)胞主要分布于嚙齒動(dòng)物的肩胛骨區(qū)域，而B(niǎo)eige脂肪細(xì)胞主要分布于腹股溝區(qū)域的皮下脂肪組織中。對(duì)于人類(lèi)來(lái)說(shuō)，褐色脂肪細(xì)胞主要存在于嬰兒體內(nèi)，但是目前研究發(fā)現(xiàn)，成年人的頸部、鎖骨上也含有相當(dāng)量的褐色脂肪細(xì)胞，且它們與嚙齒動(dòng)物的beige脂肪細(xì)胞相似。除了分布差異外，兩種褐色脂肪細(xì)胞的來(lái)源也不同。經(jīng)典的褐色脂肪細(xì)胞與肌肉細(xì)胞同源；但是beige脂肪細(xì)胞存于白色脂肪組織中。研究發(fā)現(xiàn)，在一定條件下，冷凍，特定基因的敲除或者視黃酸(retinoidacid，RA)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF21)等藥物的刺激，beige脂肪細(xì)胞可以由白色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而來(lái)，例如專(zhuān)利CN104224780A和CN105287552A分別公開(kāi)了哈爾明堿和阿西替尼均能夠促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化。雖然對(duì)beige脂肪細(xì)胞的研究受到了廣泛關(guān)注，但是相關(guān)藥物的發(fā)現(xiàn)基本都屬于西藥，而西藥副作用較大已經(jīng)在人們觀念中形成共識(shí)，長(zhǎng)期用來(lái)治療和預(yù)防肥胖以及相關(guān)代謝疾病對(duì)人體有一定損傷。中藥相對(duì)于西藥副作用較小，但現(xiàn)有技術(shù)中天然中草藥多應(yīng)用于美容瘦身、養(yǎng)生排毒、調(diào)理脾胃腸等，雖然有減肥的效果，但多是從調(diào)理脾胃腸方面來(lái)實(shí)現(xiàn)，并沒(méi)有促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化的作用。因此，研發(fā)可以使白色脂肪細(xì)胞褐色化(即轉(zhuǎn)分化為beige脂肪細(xì)胞)的天然中藥藥物對(duì)于人類(lèi)肥胖相關(guān)代謝疾病的治療具有重大意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種具有促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化的中藥組合物及其制備方法和應(yīng)用，使得所述中藥組合物能夠促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化，可應(yīng)用于相關(guān)保健品、食品以及藥品的制備中。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種具有促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化的中藥組合物及其制備方法和應(yīng)用，使得所述中藥組合物能夠抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖，緩解胰島素抵抗癥狀，并降解多余脂肪，可應(yīng)用于預(yù)防或治療肥胖及肥胖相關(guān)代謝疾病藥物、保健品或食品的制備中。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種具有促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化的中藥組合物，黃芪、黑胡椒和甘草制成。本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中缺乏促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化的天然中草藥產(chǎn)品的問(wèn)題，根據(jù)藥物特性，以藥食同源的天然原料制成了安全、有效的促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化中藥產(chǎn)品，進(jìn)而能夠發(fā)揮其治療/預(yù)防肥胖及其相關(guān)代謝疾病的作用。其中，本發(fā)明所述制成可通過(guò)中藥提取領(lǐng)域中的醇提、水提等方式制備而成，在本發(fā)明具體實(shí)施中優(yōu)選采用水提取方式。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述中藥組合物以重量份計(jì)，由10-99份黃芪、1-80份黑胡椒和1-99份甘草制成，其中黑胡椒占三者總重的百分比不超過(guò)40％；進(jìn)一步優(yōu)選地，由10-55份黃芪、1-40份黑胡椒和1-35份甘草制成；更優(yōu)選地，由20-45份黃芪、1-20份黑胡椒和1-25份甘草制成。在本發(fā)明的具體實(shí)施過(guò)程中，所述中藥組合物可按照如下重量份原料藥制成：(1)20份黃芪、25份黑胡椒、20份甘草；(2)30份黃芪、5份黑胡椒、10份甘草；(3)45份黃芪、1份黑胡椒、1份甘草；(4)45份黃芪、10份黑胡椒、10份甘草；(5)10份黃芪、25份黑胡椒、40份甘草；(6)55份黃芪、20份黑胡椒、25份甘草；(7)55份黃芪、35份黑胡椒、40份甘草；(8)45份黃芪、25份黑胡椒、20份甘草.本發(fā)明所述中藥組合物無(wú)論在體內(nèi)還是在體外均可以促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化，降解多余的脂肪，幫助肥胖小鼠抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和緩解其胰島素抵抗癥狀，同時(shí)對(duì)小鼠的進(jìn)食不造成影響?；诒景l(fā)明記載的各實(shí)驗(yàn)效果，本發(fā)明提出了所述中藥組合物在制備促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化藥物、保健品或食品中的應(yīng)用，以及在制備預(yù)防或治療肥胖及肥胖相關(guān)代謝疾病藥物、保健品或食品中的應(yīng)用。作為優(yōu)選，所述肥胖相關(guān)代謝疾病為糖尿病、脂肪肝、胰島素抵抗或代謝綜合征。此外，本發(fā)明還提供了所述中藥組合物的制備方法，即稱(chēng)取黃芪、黑胡椒、甘草三種藥材進(jìn)行水提取，提取液濃縮，獲得所述中藥提取物。具體實(shí)施過(guò)程中，稱(chēng)取黃芪、黑胡椒、甘草三種藥材水提取兩次，第一次10倍量水，保沸2h，第二次8倍量水，保沸1.5h，兩次提取液合并，濃縮，獲得所述中藥提取物。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明選擇藥食同源的中藥組分制備成一種純天然的促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化的產(chǎn)品，彌補(bǔ)了在此研究領(lǐng)域天然原料產(chǎn)品的空白，在具備安全性的基礎(chǔ)上可發(fā)揮治療/預(yù)防肥胖及其代謝相關(guān)疾病的作用，如降解多余脂肪、抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和緩解其胰島素抵抗癥狀等，同時(shí)對(duì)正常飲食無(wú)不良影響，可應(yīng)用于相關(guān)藥物、食品和保健品中。附圖說(shuō)明圖1所示為本發(fā)明所述中藥組合物對(duì)Ucp1表達(dá)的影響的實(shí)驗(yàn)流程圖；具體實(shí)施方式本發(fā)明公開(kāi)了一種具有促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化的中藥組合物及其制備方法和應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述中藥組合物及其制備方法和應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的中藥組合物、制備方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。以下就本發(fā)明所提供的一種具有促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化的中藥組合物及其制備方法和應(yīng)用做進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1：制備本發(fā)明所述中藥組合物1、原料藥20份黃芪、25份黑胡椒、20份甘草2、制備方法按組方配方量分別稱(chēng)取藥材，水提取兩次：第一次10倍量水，保沸2h，第二次8倍量水，保沸1.5h。兩次提取液合并，濃縮，得到所述中藥提取物。實(shí)施例2：制備本發(fā)明所述中藥組合物1、原料藥30份黃芪、5份黑胡椒、10份甘草2、制備方法按組方配方量分別稱(chēng)取藥材，水提取兩次：第一次10倍量水，保沸2h，第二次8倍量水，保沸1.5h。兩次提取液合并，濃縮，得到所述中藥提取物。實(shí)施例3：制備本發(fā)明所述中藥組合物1、原料藥45份黃芪、1份黑胡椒、1份甘草2、制備方法按組方配方量分別稱(chēng)取藥材，水提取兩次：第一次10倍量水，保沸2h，第二次8倍量水，保沸1.5h。兩次提取液合并，濃縮，得到所述中藥提取物。實(shí)施例4：制備本發(fā)明所述中藥組合物1、原料藥45份黃芪、10份黑胡椒、10份甘草2、制備方法按組方配方量分別稱(chēng)取藥材，水提取兩次：第一次10倍量水，保沸2h，第二次8倍量水，保沸1.5h。兩次提取液合并，濃縮，得到所述中藥提取物。實(shí)施例5：制備本發(fā)明所述中藥組合物1、原料藥10份黃芪、25份黑胡椒、40份甘草2、制備方法按組方配方量分別稱(chēng)取藥材，水提取兩次：第一次10倍量水，保沸2h，第二次8倍量水，保沸1.5h。兩次提取液合并，濃縮，得到所述中藥提取物。實(shí)施例6：制備本發(fā)明所述中藥組合物1、原料藥55份黃芪、20份黑胡椒、25份甘草2、制備方法按組方配方量分別稱(chēng)取藥材，水提取兩次：第一次10倍量水，保沸2h，第二次8倍量水，保沸1.5h。兩次提取液合并，濃縮，得到所述中藥提取物。實(shí)施例7：制備本發(fā)明所述中藥組合物1、原料藥55份黃芪、35份黑胡椒、40份甘草2、制備方法按組方配方量分別稱(chēng)取藥材，水提取兩次：第一次10倍量水，保沸2h，第二次8倍量水，保沸1.5h。兩次提取液合并，濃縮，得到所述中藥提取物。實(shí)施例8：制備本發(fā)明所述中藥組合物1、原料藥45份黃芪、25份黑胡椒、20份甘草2、制備方法按組方配方量分別稱(chēng)取藥材，水提取兩次：第一次10倍量水，保沸2h，第二次8倍量水，保沸1.5h。兩次提取液合并，濃縮，得到所述中藥提取物。實(shí)施例9：本發(fā)明所述中藥組合物對(duì)Ucp1表達(dá)的影響腹股溝的白色脂肪組織是白色脂肪細(xì)胞褐色化的主要部位，因此分離此處的細(xì)胞用于進(jìn)行白色脂肪細(xì)胞褐色化實(shí)驗(yàn)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程圖見(jiàn)圖1。1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物敲入有解偶聯(lián)蛋白1-熒光素酶的C57小鼠置于SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)、繁殖。飼養(yǎng)室采用12小時(shí)亮燈/12小時(shí)黑暗的自動(dòng)控制體系，飼養(yǎng)室溫度始終維持在23℃。小鼠飼喂廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的標(biāo)準(zhǔn)飼料(10％kJ脂肪,20％kJ蛋白質(zhì),70％kJ碳水化合物)。2、受試物1)上述實(shí)施例1所得的提取物按原藥材量計(jì)算濃縮為0.9g/ml，為組方1；2)上述實(shí)施例2所得的提取物按原藥材量計(jì)算濃縮為0.9g/ml，為組方2；3)上述實(shí)施例3所得的提取物按原藥材量計(jì)算濃縮為0.9g/ml，為組方3；4)上述實(shí)施例4所得的提取物按原藥材量計(jì)算濃縮為0.9g/ml，為組方4；5)上述實(shí)施例5所得的提取物按原藥材量計(jì)算濃縮為0.9g/ml，為組方5；6)上述實(shí)施例6所得的提取物按原藥材量計(jì)算濃縮為0.9g/ml，為組方6；7)上述實(shí)施例7所得的提取物按原藥材量計(jì)算濃縮為0.9g/ml，為組方7；8)上述實(shí)施例8所得的提取物按原藥材量計(jì)算濃縮為0.9g/ml，為組方8；9)黃芪經(jīng)上述提取方法按原藥材量計(jì)算濃縮為0.9g/ml，為黃芪提取物；10)黑胡椒經(jīng)上述提取方法按原藥材量計(jì)算濃縮為0.6g/ml，為黑胡椒提取物；11)甘草經(jīng)上述提取方法按原藥材量計(jì)算濃縮為0.6g/ml，為甘草提取物；3、原代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的提取與脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化1)取一只敲入有解偶聯(lián)蛋白1-熒光素酶的小鼠，斷頸處死，在75％的酒精中浸泡5分鐘，然后轉(zhuǎn)移到操作臺(tái)中，取出腹股溝的白色脂肪；2)用PBS清洗3次，用剪刀將脂肪組織剪碎，1g脂肪組織加入10ml膠原酶I溶液(用D-Hanks溶液配制，100ml加入0.1g膠原酶I)，放置37℃消化40分鐘；3)用250μm濾膜過(guò)濾，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，然后轉(zhuǎn)移到離心管中，1000rpm離心3分鐘；4)第一次離心后的底部細(xì)胞為脂肪間充質(zhì)細(xì)胞，棄除上清后，用新鮮的培養(yǎng)液懸起，鋪到培養(yǎng)板中，第二天換液。5)獲得的脂肪間充質(zhì)細(xì)胞在添加10％胎牛血清(Hyclone)高糖的DMEM(Hyclone)的培養(yǎng)液生長(zhǎng)至80％匯聚度時(shí)，傳代至24孔培養(yǎng)板中直至長(zhǎng)滿；6)更換培養(yǎng)液為添加了MDIR(0.5mM異丁基黃嘌呤，1μM地塞米松，87nM胰島素和0.5μM羅格列酮:IBMX+Dex+Insulin+rosiglitazone)的誘導(dǎo)培養(yǎng)液(添加10％胎牛血清高糖的DMEM的培養(yǎng)液)，培養(yǎng)2天。7)2天后，培養(yǎng)液更換為只添加IR(87nM胰島素和0.5μM羅格列酮:Insulin+rosiglitazone)的誘導(dǎo)培養(yǎng)液(添加10％胎牛血清高糖的DMEM的培養(yǎng)液)，每?jī)商旄鼡Q一次，直到細(xì)胞完全分化為脂肪細(xì)胞。4)將培養(yǎng)基更換為正常的培養(yǎng)基(添加10％胎牛血清高糖的DMEM的培養(yǎng)液)，同時(shí)添加中草藥刺激兩天。兩天后，裂解細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性。4、細(xì)胞的熒光素酶信號(hào)檢測(cè)將完全分化的脂肪細(xì)胞更換為正常的培養(yǎng)基(添加10％胎牛血清高糖的DMEM的培養(yǎng)液)，同時(shí)分別添加各受試物刺激兩天。兩天后，裂解細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性，檢測(cè)方法如下：1)以24孔細(xì)胞板的1孔為例，將細(xì)胞的培養(yǎng)液移除，然后用300微升的PBS清洗一遍，然后盡量移除干凈PBS；2)加入100μL熒光素酶信號(hào)檢測(cè)緩沖液(150mMKCl，20mMHEPES，5mMMgcl2，1mMEGTA。NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0)，放置冰上裂解半小時(shí)。隨后刮離細(xì)胞，轉(zhuǎn)至1.5ml的EP管中。3)低溫4℃，13rpm離心20分鐘。4)取上清15μL，高糖DMEM培養(yǎng)基15μL和30μLSteady-試劑(Steady-LuciferaseAssaySystem，Promega)混合加入CulturPlateTM-96白色實(shí)底96孔板(PerkinElmer)的孔中。5)震蕩10分鐘。6)熒光照度計(jì)上進(jìn)行測(cè)量讀數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表1。由表1結(jié)果可知，組方1至組方8可以有效地促進(jìn)解偶聯(lián)蛋白1的表達(dá)，且組方1至組方8均呈劑量依賴(lài)性的促進(jìn)解偶聯(lián)蛋白1的表達(dá)，結(jié)果說(shuō)明組方1至組方8可在體外參與白色脂肪細(xì)胞褐色化過(guò)程。組方1至組方8不同劑量的相對(duì)熒光素酶活性顯然高于同等劑量下的單方黑胡椒組，即，組方1至組方8促進(jìn)解偶聯(lián)蛋白1的表達(dá)活性明顯優(yōu)于單方黑胡椒組。表1各組方及單方不同濃度的相對(duì)熒光素酶活性(n＝3)注：與對(duì)照組(不加藥組)相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；實(shí)施例10：本發(fā)明所述中藥組合物體內(nèi)促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步證實(shí)實(shí)施例1-8八組中藥組合物在體內(nèi)也能促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞褐色化并能抵抗高脂飼料引起的肥胖發(fā)生，本實(shí)施例進(jìn)行多項(xiàng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。C57野生型小鼠置于飼養(yǎng)籠中喂養(yǎng)。飼養(yǎng)室采用12小時(shí)亮燈/12小時(shí)黑暗的自動(dòng)控制體系，飼養(yǎng)室溫度始終維持在23℃。未滿8周齡的小鼠飼喂廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的標(biāo)準(zhǔn)飼料(15.9kJ/g,10％kJ脂肪,20％kJ蛋白質(zhì),70％kJ碳水化合物)。8周齡后的小鼠飼喂來(lái)自于ResearchDiet公司的D12492配方配制的60％熱量脂肪含量的高脂飼料(21.9kJ/g,60％kJ脂肪,20％kJ蛋白質(zhì),20％kJ碳水化合物)。8周齡的C57小鼠喂食高脂飼料8周后，體重達(dá)到40g左右，即為飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠。開(kāi)始對(duì)這些肥胖小鼠每天進(jìn)行中草藥灌胃處理(灌胃時(shí)間為8周，各組合物受試物用量為1.5mg/g小鼠，單方黃芪為1.5mg/g小鼠，單方黑胡椒和甘草分別為1mg/g小鼠)。1、小鼠體重和進(jìn)食量在灌胃的8周內(nèi)，每周進(jìn)行體重和進(jìn)食測(cè)量，結(jié)果見(jiàn)表2-3。與對(duì)照小鼠相比，所有受試物組方的小鼠的體重低于對(duì)照組小鼠的體重，并有顯著性差異。和對(duì)照小鼠相比，所有受試物小鼠每日進(jìn)食量沒(méi)有明顯區(qū)別(表3)。表2各組方及單方小鼠體重，g(n＝10)注：與對(duì)照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；表3各組方及單方小鼠平均進(jìn)食量，g/天/小鼠(n＝10)2、小鼠主要部位的脂肪組織重量測(cè)定分離小鼠主要部位的脂肪組織進(jìn)行重量測(cè)定(BAT：褐色脂肪組織，Epi：附睪周?chē)咨窘M織；Ing：腹股溝白色脂肪組織)。結(jié)果見(jiàn)表4，其中灌胃組方1-8及單方黑胡椒和甘草組小鼠的附睪周?chē)咨窘M織重量低于對(duì)照小鼠，并有顯著性差異；其中灌胃組方1-8及單方黃芪和甘草組小鼠的腹股溝白色脂肪組織重量低于對(duì)照小鼠，并有顯著性差異，其中組方1、組方2和組方4組小鼠腹股溝脂肪組織重量顯著性低于單方甘草組；由此結(jié)果可知，黃芪、黑胡椒和甘草復(fù)方促進(jìn)白色脂肪組織褐色化的效果優(yōu)于單方。所有灌胃小鼠和對(duì)照小鼠的褐色脂肪組織重量沒(méi)有顯著性差異。表4不同實(shí)驗(yàn)組小鼠的脂肪組織稱(chēng)重，g(n＝10)注：與對(duì)照組相比，*表示P<0.05；與黃芪組相比，★表示P<0.05；與黑胡椒組相比，#表示P<0.05；與甘草組相比，△表示P<0.05。3、小鼠葡萄糖及胰島素耐受實(shí)驗(yàn)用生理鹽水配制10％的葡萄糖溶液，然后按照1g/kg體重的劑量，腹腔注射經(jīng)12小時(shí)禁食(晚上9點(diǎn)-次日早上9點(diǎn))的小鼠。以血糖儀監(jiān)測(cè)注射前(0分鐘)以及注射后小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的血糖濃度(15分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘)，時(shí)間誤差控制在5秒以?xún)?nèi)。胰島素耐受實(shí)驗(yàn)所用胰島素劑量為0.5單位/kg體重。但是禁食時(shí)間為6小時(shí)(早上9點(diǎn)-下午3點(diǎn))，其余操作方法與葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5-6。結(jié)果顯示灌胃組方1-8及單方黃芪、黑胡椒和甘草組的小鼠的胰島素敏感性高于對(duì)照小鼠。說(shuō)明組方1-8及單方黃芪、黑胡椒和甘草均可以改善肥胖小鼠的胰島素敏感性和糖尿病癥狀(表5-6)。表5各組方實(shí)驗(yàn)組小鼠不同時(shí)間的GTT，(n＝10)表6各組方實(shí)驗(yàn)組小鼠不同時(shí)間的ITT，(n＝10)4、小鼠血液leptin和Ghrelin測(cè)定小鼠血清leptin和Ghrelin測(cè)定分別采用R&D和Millipore的ELISAKit。具體步驟如下：1)按照說(shuō)明書(shū)，配置洗滌緩沖液成工作濃度。將包被板用洗滌液洗滌1次。2)先加入matix，然后再加入10μl待測(cè)的血清樣品和標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)量監(jiān)控樣品。其中標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)量監(jiān)控樣品加入和血清相應(yīng)體積的matrixsolution。3)每孔添加檢測(cè)酶標(biāo)抗體80ul。封口、振搖孵育2小時(shí)。然后用洗滌液300μl/次洗滌3次。每次洗滌后將液體徹底傾倒干凈。4)每孔添加酶溶液100μl。封口、振搖孵育半小時(shí)。洗滌液300μl/次洗滌5次。5)加入顯色底物100μl。封口、振搖孵育15分鐘。6)加入終止液100μl終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀數(shù)OD450和OD590。7)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算質(zhì)量監(jiān)控樣品濃度是否在指定區(qū)間。計(jì)算待測(cè)樣品的濃度。ELISA分析各實(shí)驗(yàn)組小鼠血液中l(wèi)eptin和ghrelin濃度變化，各實(shí)驗(yàn)組之間沒(méi)有區(qū)別(結(jié)果見(jiàn)表7)。這與小鼠每日進(jìn)食量結(jié)果一致。表7各組方實(shí)驗(yàn)組小鼠血液中l(wèi)eptin和ghrelin，ng/ml(n＝10)leptinghrelin對(duì)照組22.70±2.34117.86±9.10組方123.07±2.17120.13±10.09組方222.72±2.91123.82±9.38組方322.32±1.43119.65±9.42組方422.91±3.11118.54±11.31組方521.34±2.75119.33±12.34組方622.64±1.65122.09±11.21組方722.54±1.74121.45±10.07組方821.33±1.78116.67±10.14黃芪21.77±2.90122.31±10.41黑胡椒22.68±4.08115.89±10.09甘草21.93±1.02126.67±11.31以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3