本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種提高猴頭菇多糖腸道吸收的納米化方法。

背景技術：

猴頭菇多糖是從優(yōu)質猴頭菇子實體中提取的有效活性成分，猴頭菇的主要成分是多糖類和猴頭菌素，經熱水提取的猴頭菇多糖對小白鼠肉瘤180和艾氏腹水癌有明顯的抑制作用，同時具有助消化、利五臟的功能，對慢性胃炎、十二指腸潰瘍等多種消化道疾病均有較好的療效，能提高人體免疫能力。

目前針對的猴頭菇多糖的納米化方法包括了PLGA溶劑擴散法，但其存在三個問題：1.直接將多糖與PLGA混合不利于多糖的包裹，降低了包封率。2..用二氯甲烷作為有機相不利于形成較小的納米粒子。3. 將該混懸液滴加到明膠水溶液容易造成水溶性藥物從聚合物相的泄漏。4.猴頭菇浸膏所含物質復雜，不利于有效成分的確定和提高藥效。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種提高猴頭菇多糖腸道吸收的納米化方法。

為實現上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種提高猴頭菇多糖腸道吸收的納米化方法，所述方法包括如下：

（1）將純化的猴頭菇多糖配成5wt.%的溶液置于燒杯中，然后將5wt.%PEG 溶液按照猴頭菇多糖溶液：PEG 溶液體積比為1：40的量加入，磁力攪拌機2000 rpm 攪拌10 min，靜置待表面氣泡基本消失后，置于-20℃的冰箱預凍12 小時；

（2）凍好的樣品放到真空冷凍干燥機中凍干24 h；用二氯甲烷洗滌凍干的粉末，經渦旋使PEG 充分溶解后用12000 rpm 離心5 min，除去上清液，加入新的二氯甲烷，重復3次，放入真空干燥箱過夜，得到干燥的多糖納米顆粒；

（3）將多糖納米顆粒和PLGA溶解于二氯甲烷與丙酮的混合液中，多糖納米顆粒和PLGA的質量比為1:5，超聲得到混懸液，邊攪拌邊加入到5wt.%的普朗尼克水溶液中，溶液置于旋轉蒸發(fā)儀中，溫度為60℃，直至二氯甲烷與丙酮揮發(fā)完全，離心，微球沉降析出；收集沉降的微球，用蒸餾水洗滌，真空冷凍干燥，即得成品。

二氯甲烷與丙酮的體積比例為2.2:1。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

本發(fā)明通過使用分段式的制備，將多糖與PEG混合后再與PLGA混合提高了納米多糖的包封率和載藥量。將二氯甲烷與丙酮以2.2：1混合，促進聚合物的分散，容易形成較小的粒子。將該混懸液滴加到明膠水溶液容易造成水溶性藥物從聚合物相的泄漏，本發(fā)明通過三甘油脂代替明礬水溶液解決了此類問題。猴頭菇浸膏所含物質復雜，不利于有效成分的確定，本發(fā)明首次采用納米擴散法包裹純化多糖，明確了藥物構成，提高了藥物藥效。

附圖說明

圖1 不同猴頭菇多糖的轉運量。

圖2不同猴頭菇多糖的轉運率。

具體實施方式

實施例1

一種提高猴頭菇多糖腸道吸收的納米化方法，所述方法包括如下：

（1）將純化的猴頭菇多糖配成5wt.%的溶液置于燒杯中，然后將5wt.%PEG 溶液按照猴頭菇多糖溶液：PEG 溶液體積比為1：40的量加入，磁力攪拌機2000 rpm 攪拌10 min，靜置待表面氣泡基本消失后，置于-20℃的冰箱預凍12 小時；

（2）凍好的樣品放到真空冷凍干燥機中凍干24 h；用二氯甲烷洗滌凍干的粉末，經渦旋使PEG 充分溶解后用12000 rpm 離心5 min，除去上清液，加入新的二氯甲烷，重復3次，放入真空干燥箱過夜，得到干燥的多糖納米顆粒；

（3）將多糖納米顆粒和PLGA溶解于二氯甲烷與丙酮的混合液中，多糖納米顆粒和PLGA的質量比為1:5，超聲得到混懸液，邊攪拌邊加入到5wt.%的普朗尼克水溶液中，溶液置于旋轉蒸發(fā)儀中，溫度為60℃，直至二氯甲烷與丙酮揮發(fā)完全，離心，微球沉降析出；收集沉降的微球，用蒸餾水洗滌，真空冷凍干燥，即得成品。

使用該制備方法后，納米多糖的包封率從傳統(tǒng)方法的44%提高到56%，載藥量從4.15%提高到6.64%。

實施例2

1. 雞腸上皮原代細胞的制備

無菌取雞胚腸組織，PBS反復洗滌，剔除腸系膜，剪成小于1 mm³的組織塊，Ⅰ型中性蛋白酶和Ⅺ型膠原酶聯合消化，在37 ℃水浴箱中，80 r/min攪拌30 min。消化完成后以1000 r/min離心10 min，向細胞沉淀中加入少量DMEM培養(yǎng)基懸浮細胞，離心洗滌3次后，收集的細胞用含10% FBS的細胞培養(yǎng)液DMEM 12 g/L +20 μg/L 表皮生長因子+100 mg/L 肝素鈉+110 mg/L 丙酮酸鈉+2.5 mg /L胰島素+200 mmol/L 谷氨酸氨+100 U/L 青霉素+100 μg/L 鏈霉素懸浮，種植到玻璃細胞瓶中。

2. 雞小腸上皮細胞單層模型的建立

將對數生長期細胞按 1×10⁵/cm² 利用Transwell 12孔板上培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)后第2、5、12、20 d的生長情況，并通過透射電鏡對生長20 d的細胞進行超微結構觀察，確定雞小腸上皮細胞從形態(tài)學上看已形成完整的細胞單層。

3. 納米猴頭菇多糖在雞小腸上皮細胞上的跨膜轉運

雞小腸上皮細胞在Transwell 12孔板上培養(yǎng)成單層細胞后，設2個試驗組（37 ℃，pH值7.4），分別是猴頭菇多糖和納米猴頭菇多糖。各組從AP→BL側的轉運時，將多糖加入到細胞AP側（0.4 mL），在BL側加入不含藥物的HBSS液（0.6 mL），每組重復 4 孔。放置37℃恒溫搖床中孵育，根據實驗需要，不同時間點從BL側取樣檢測轉運量。

4.結果

從圖1-2可以看出，納米猴頭菇多糖的轉運量與轉運率優(yōu)于猴頭菇多糖。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。