本發(fā)明涉及一種巖藻多糖在抗腫瘤中的應(yīng)用，特別涉及一種巖藻多糖在制備PC-12細(xì)胞或MKN-45細(xì)胞活性抑制劑中的應(yīng)用。

(二)

背景技術(shù)：

海洋藻類(lèi)作為一種新的生物活性物質(zhì)的來(lái)源正在迅速被研究，我國(guó)藻類(lèi)資源十分豐富，特別是褐藻(Phaeophyta)資源，是海藻生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)。褐藻(Phaeophyta)是海洋藻類(lèi)中的第二大種群，分為25個(gè)屬，大約有1500種，是生長(zhǎng)在海洋中的低等植物，在很多國(guó)家，褐藻(Phaeophyta)如墨角藻(Fucus)，海帶(Laminaria japonica)，羊棲菜(Hizikiafusifarme)等作為食品來(lái)食用。褐藻中含有的多糖成分，如褐藻膠，巖藻多糖，褐藻淀粉等，均已在醫(yī)藥原料中廣泛的應(yīng)用。

巖藻多糖(Fucoidan)是Kylin在1913年首次從掌狀海帶中提取的，它是褐藻中所固有的細(xì)胞間多糖，存在于細(xì)胞壁基質(zhì)中。研究表明巖藻多糖具有廣泛的生物活性如抗氧化，抗腫瘤，抗凝血，抗病毒等。巖藻多糖不僅能夠增強(qiáng)人體免疫力，還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是重要的自由基清除劑和抗氧化劑，巖藻多糖在功能性食品和藥品行業(yè)具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

巖藻多糖是以L-巖藻糖和硫酸基為主要特征的一類(lèi)水溶性多糖，并伴有其他單糖(如半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖)的雜多糖。巖藻多糖結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，一方面不同褐藻的巖藻多糖，化學(xué)組成不盡相同，除了主要成分巖藻糖、硫酸基、其他單糖(甘露糖、半乳糖、葡萄糖等)以及糖醛酸外，有些還具有乙?；偷鞍踪|(zhì)；另一方面不同種褐藻中的巖藻多糖的結(jié)構(gòu)也不相同，并且由不同提取方法得到的巖藻多糖分子量和結(jié)構(gòu)也會(huì)不同。褐藻中的巖藻多糖，單糖組成以L-巖藻糖為主，L-巖藻糖通過(guò)α-(1→2)，α-(1→3)或α-(1→4)連接構(gòu)成主鏈，主鏈除了由巖藻糖構(gòu)成還含有其他單糖，并且有較多的分支。硫酸基主要結(jié)合在C-2或C-4位上，平均每?jī)蓚€(gè)巖藻糖基含有一個(gè)硫酸基。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種巖藻多糖在制備PC-12細(xì)胞或MKN-45細(xì)胞活性抑制劑中的應(yīng)用，本發(fā)明從海帶中獲得純度高達(dá)71％-92％巖藻多糖的方法，提供測(cè)定巖藻多糖抗氧化及抗腫瘤活性的方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種巖藻多糖在制備PC-12細(xì)胞或MKN-45細(xì)胞活性抑制劑中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述巖藻多糖按如下方法制備：將干海帶粉與溶劑混合，在60-100℃浸提1-5h，將提取液5000-10000r/min離心，取上清液50℃-70℃減壓濃縮至1/2-1/15體積(優(yōu)選濃縮至1/10)，然后加1M CaCl₂水溶液至無(wú)沉淀產(chǎn)生，攪拌4h，離心，取上清液，加入無(wú)水乙醇至乙醇體積濃度為60-90％(優(yōu)選75％)，攪拌，在4℃下靜置過(guò)夜，離心，沉淀凍干，得粗巖藻多糖；將粗巖藻多糖用純水制成質(zhì)量濃度為2％(m/m)的溶液，上樣DEAE-52纖維素陰離子交換柱(3.2cm×22cm)，分別用純水，1.0M NaCl水溶液，2.0M NaCl水溶液進(jìn)行洗脫，分別收集三種洗脫餾分的流出液，經(jīng)透析(14KDa)，凍干(6-10小時(shí))，獲得巖藻多糖；所述溶劑為體積濃度95％乙醇水溶液或純水；所述溶劑體積用量以干海帶粉質(zhì)量計(jì)為25-50ml/g。

進(jìn)一步，優(yōu)選所述溶劑為純水。

進(jìn)一步，優(yōu)選所述溶劑體積用量以干海帶粉質(zhì)量計(jì)為40ml/g；所述浸提條件為90℃浸提3h。

本發(fā)明取巖藻多糖的原料可以是人工養(yǎng)殖的海帶，也可以是野生褐藻馬尾藻(Scagassum)。

本發(fā)明所述純水是指去離子水。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：

1)采用本發(fā)明的制備方法制取巖藻多糖作為抗腫瘤(PC-12，MKN-45)及抗氧化劑，具備純度高(71％-92％)，操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件易于控制、工藝成本低等特點(diǎn)。

2)本發(fā)明的制備方法制取分離得到的巖藻多糖(FCSP，F(xiàn)CSP-1，F(xiàn)CSP-2，F(xiàn)CSP-3)，其抗腫瘤(PC-12，MKN-45)抑制率要高于市售巖藻多糖(純度80％，來(lái)自于陜西天然原料匯)對(duì)PC-12，MKN-45的抑制率。

3)采用本發(fā)明制備的巖藻多糖作為抗腫瘤(PC-12，MKN-45)及抗氧化劑，也可以用于食品添加劑產(chǎn)品可制成粉劑、水劑、針劑等劑型。

(四)附圖說(shuō)明

圖1為FCSP，F(xiàn)CSP-1，F(xiàn)CSP-2，F(xiàn)CSP-3的羥基自由基清除活性圖，a為FCSP的羥基自由基清除活性，b為FCSP-1的羥基自由基清除活性，c為FCSP-2的羥基自由基清除活性，d為FCSP-3的羥基自由基清除活性。

圖2為FCSP，F(xiàn)CSP-1，F(xiàn)CSP-2，F(xiàn)CSP-3抗腫瘤(PC-12、MKN-45)抑制率圖，a為FCSP，F(xiàn)CSP-1，F(xiàn)CSP-2，F(xiàn)CSP-3抗PC-12抑制率，b為FCSP，F(xiàn)CSP-1，F(xiàn)CSP-2，F(xiàn)CSP-3抗MKN-45抑制率。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1：水煮法工藝優(yōu)化提取巖藻多糖

(1)溶劑體積對(duì)多糖得率的影響：分別稱(chēng)取15份1.00g干海帶粉(80目)，分五批。每一批加入純水的體積為25.0mL，30.0mL，35.0mL，40.0mL，45.0mL，50.0mL。在90℃下，水浴2h。離心，取上清液，用純水純水定容至250.0mL，作為儲(chǔ)備液，60℃下減壓烘干計(jì)算多糖得率。取2.0mL儲(chǔ)備液，用純水定容至100.0mL，作為待測(cè)液，使用硫酸苯酚法測(cè)定多糖含量。

(2)時(shí)間對(duì)多糖得率的影響：分別稱(chēng)取15份1.00g干海帶粉(80目)，分五批，分別加入純水35mL。每一批設(shè)置提取時(shí)間分別為1h，2h，3h，4h，5h。溫度為90℃，料液比為1:35。離心，取上清液，用純水定容至250.0mL，作為儲(chǔ)備液，60℃下減壓烘干計(jì)算多糖得率。取2.0mL儲(chǔ)備液，用純水定容至100.0mL，作為待測(cè)液，使用硫酸苯酚法測(cè)定多糖含量。

(3)溫度對(duì)多糖得率的影響：分別稱(chēng)取15份1.00g干海帶粉(80目)，分五批，分別加入純水35mL。每一批溫度設(shè)置為60℃，70℃，80℃，90℃，100℃。料液比1:35，時(shí)間3h。離心，取上清液，用純水定容至250.0mL，作為儲(chǔ)備液，60℃下減壓烘干計(jì)算多糖得率。取2.0mL儲(chǔ)備液，用純水定容至100.0mL，作為待測(cè)液，使用硫酸苯酚法測(cè)定多糖含量。

上述待測(cè)液分別使用硫酸苯酚法測(cè)定多糖含量(參照Dubois,M.,et al.(2002).Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances.Analytical Chemistry,28(3):p.350-356.)，以多糖儲(chǔ)備液減壓蒸干得到固體質(zhì)量與投料質(zhì)量之比計(jì)算多糖得率。

表1水煮法提取，料液比，提取時(shí)間，提取溫度對(duì)巖藻多糖提取的影響

在單因素提取優(yōu)化基礎(chǔ)上，以多糖含量和多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L₉(3³)正交設(shè)計(jì)，研究A(提取溫度，℃)、B(提取時(shí)間，h)、C(料液比)對(duì)巖藻多糖水煮法提取的影響，確定最佳提取工藝條件。

表2為本發(fā)明正交試驗(yàn)的表頭設(shè)計(jì)

表3為正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)確定最佳提取工藝條件

本發(fā)明中海帶巖藻多糖的水煮最佳提取工藝條件為A₃B₂C₃，即提取溫度90℃，提取時(shí)間3h，料液比為1:40。在此條件下，巖藻多糖得率最大。顯著性分析(表4)。

表4顯著性分析

實(shí)施例2：水煮法提取巖藻多糖以及分離純化

(1)稱(chēng)取干海帶粉(80目)40.0g，加入1600mL水(即料液比1:40)，在90℃下，提取3h，然后在8000rpm下離心10min，過(guò)濾，濾渣加入1600ml水在同樣條件下重新再提取一次，取離心后的上清液，兩次合并，即為提取液。將提取液體積濃縮至1/10，然后加1M CaCl₂水溶液至無(wú)沉淀產(chǎn)生，攪拌4h，離心，取上清液，加入無(wú)水乙醇至乙醇體積濃度為75％，攪拌，在4℃下靜置過(guò)夜，離心，沉淀凍干，得粗巖藻多糖FCSP4.5g。

(2)稱(chēng)取步驟(1)1.0g粗巖藻多糖FCSP，用純水配置濃度為2％(m/m)的溶液，上樣DEAE-52纖維素陰離子交換柱(3.2cm×22cm)，分別用純水，1.0M NaCl水溶液，2.0M NaCl水溶液進(jìn)行洗脫，得到餾分FCSP-1，餾分FCSP-2，餾分FCSP-3，每個(gè)餾分用硫酸苯酚法檢測(cè)，然后用14KDa的透析袋截留透析10h，取截留液凍干，即為巖藻多糖。

表5巖藻多糖餾分成分含量

實(shí)施例3：巖藻多糖抗氧化活性

(1)DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)：稱(chēng)取4mg 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，用無(wú)水乙醇定容至100mL，濃度為0.1mM。配置0.1mL樣品溶液(實(shí)施例2制備的粗巖藻多糖FCSP，餾分FCSP-1，餾分FCSP-2，餾分FCSP-3用純水配制濃度0.20-3.00mg/mL，表6)，分別加入3mL、0.1mM的DPPH/乙醇溶液，在暗處30℃下培養(yǎng)30min，在紫外波長(zhǎng)517nm處，測(cè)吸光度。DPPH/乙醇溶液作為空白對(duì)照。

計(jì)算公式DPPH清除率(％)＝(1-As/Ac)

As是樣品吸光值，Ac是用無(wú)水乙醇做空白吸光值。

表6為巖藻多糖FCSP作為抗氧化劑DPPH自由基清除率

(2)羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)：配置樣品濃度為1.00-4.50mg/mL(實(shí)施例2制備的粗巖藻多糖FCSP，餾分FCSP-1，餾分FCSP-2，餾分FCSP-3用純水配制)，移取0.5mL樣品于0.5mL水楊酸-乙醇體系(9.0mM)中，然后加入7.5mM FeSO₄(溶劑是水)(1.0mL)，質(zhì)量濃度0.1％H₂O₂(溶劑是水)(1.0mL)，在37℃水浴下保持30min，在紫外波長(zhǎng)510nm處，測(cè)定吸光度。

FCSP，F(xiàn)CSP-1，F(xiàn)CSP-2，F(xiàn)CSP-3的羥基自由基清除活性如圖1。

清除率(％)＝(Ac-As)/Ac

As是樣品吸光值，Ac是用無(wú)水乙醇做空白吸光值。

結(jié)果如圖1，F(xiàn)CSP抑制效率最高，其EC50是3.4mg/mL。FCSP-1,FCSP-2,FCSP-3在4.5mg/mL時(shí)，羥基自由基抑制率分別為20.26±0.08％,17.57±0.11,19.89±0.07％。

實(shí)施例4：巖藻多糖抗腫瘤活性

(1)細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮罐中取出冷凍的鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞(由浙江大學(xué)藥學(xué)院提供)，37℃水浴解凍，將鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含10mL含10％胎牛血清的DMEM-1640培養(yǎng)基的15mL離心管中，3000r/min，離心1min，倒掉液體，加入5mL含10％胎牛血清的DMEM-1640培養(yǎng)基，并吹散細(xì)胞，隨后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放置在37℃，含有5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；(2)細(xì)胞培養(yǎng)：將步驟(1)中培養(yǎng)24h的細(xì)胞進(jìn)行換液，倒掉培養(yǎng)基，加入5mLPBS清洗，倒掉PBS，再加入5mL含10％胎牛血清的DMEM-1640培養(yǎng)基，放置在37℃，含有5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；(3)細(xì)胞傳代：將步驟(2)中培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行傳代，倒掉培養(yǎng)基，加入5mLPBS清洗，倒掉PBS，加入1mL胰酶，進(jìn)行消化，直到細(xì)胞變圓脫離培養(yǎng)瓶壁，轉(zhuǎn)移出胰酶，再加入15mL含10％胎牛血清的DMEM-1640培養(yǎng)基，再分別轉(zhuǎn)移出5mL培養(yǎng)基到兩瓶培養(yǎng)瓶中，將三瓶培養(yǎng)瓶放置在培養(yǎng)箱中，放置在37℃，含有5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；(4)細(xì)胞種板：將步驟(3)中培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96微孔板中，5×10⁴個(gè)/mL，每孔100μL含10％胎牛血清的DMEM-1640培養(yǎng)基，放置在37℃，含有5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；(5)細(xì)胞加藥：將步驟(4)中的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移出來(lái)，加入200μL樣品溶液(樣品溶液是將實(shí)施例2制備的粗巖藻多糖FCSP，餾分FCSP-1，餾分FCSP-2，餾分FCSP-3用含10％胎牛血清DMEM-1640培養(yǎng)基溶解制成終濃度分別為62.5μg/mL，125μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL的樣品溶液)，放置在37℃，5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；(6)加MTT：向步驟(5)中細(xì)胞加入15μL MTT(5mg/mL)進(jìn)行染色，放置在37℃，含有5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移出去，加入150μL DMSO，振蕩10min，在紫外波長(zhǎng)570nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)圖2。

同樣條件下，將上述鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12換成人胃癌細(xì)胞MKN-45(由浙江大學(xué)藥學(xué)院提供)，將含10mL含10％胎牛血清的DMEM-1640培養(yǎng)基換成含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，以市售巖藻多糖為對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖2。

細(xì)胞抑制率(％)＝(1–As/Ac)×100％As樣品組570nm吸光值，Ac空白組570nm吸光值。

結(jié)果表明，在濃度為1000μg/mL時(shí)，餾分FCSP-2對(duì)PC-12、MKN-45的抑制率分別為58.93±3.93％、42.18±0.55％，而市售巖藻多糖(純度80％，來(lái)自于陜西天然原料匯)抑制率分別為33.27±1.26％，20.87±2.78％。FCSP、FCSP-1和FCSP-3對(duì)PC-12也有較高的抑制率(33.34±2.02％、35.17±0.47％、50.06±0.77％)。FCSP-3對(duì)MKN-45的抑制率最高為45.18±1.44％。因此，本發(fā)明制備的巖藻多糖(FCSP-2)對(duì)(鼠嗜鉻細(xì)胞瘤(PC-12)，人胃癌細(xì)胞(MKN-45)的抑制活性比市場(chǎng)上巖藻多糖對(duì)這兩種細(xì)胞的抑制活性高25％，22％。