本發(fā)明涉及中藥材麋鹿角，具體涉及一種具有強筋骨的麋鹿角活性部位及其制備方法和其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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麋鹿角是鹿科動物麋鹿(Elaphurus davidianus Milne-Edwards)骨化脫落的老角。麋鹿角是傳統(tǒng)補益類中藥材，至清末麋鹿在中國的滅絕，入藥已逾千年。中醫(yī)認(rèn)為麋鹿角性溫味咸，入肝補腎，可以滋補耗損之陰津，故能安心神，治療五心煩熱、暴躁易怒等癥狀。由于近代麋鹿在中國的滅絕，麋鹿角的近代藥用記載及其相關(guān)研究甚為稀少。近代張德昌等對比了麋鹿角和鹿角的成分含量，發(fā)現(xiàn)麋鹿角除了有和鹿角相當(dāng)?shù)陌被岷客猓湮⒘吭睾蜕攀忱w維含量遠(yuǎn)高于鹿角，提示了麋鹿角可能具有與鹿角相當(dāng)?shù)乃帉W(xué)價值。而鹿角作為一傳統(tǒng)補益藥，其益腎助陽已為多年的臨床應(yīng)用和實驗研究所證實。但是對麋鹿角的活性部位、活性物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機制尚未有研究報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種活性部位明確、功效好的具有強筋骨的麋鹿角活性部位，本發(fā)明另一個目的是提供該具有強筋骨的麋鹿角活性部位的制備方法和其在制備治療骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)方案：為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為：

一種具有強筋骨的麋鹿角活性部位，它是由下列方法制備得到的：

取麋鹿角，鎊片，加水回流提取，濾液減壓濃縮，得麋鹿角總水提物；麋鹿角總水提物依次通入截留分子量分別為3K，1W，10W的中空纖維超濾膜組件，得到分子量大于100kDa，分子量位于10kDa和100kDa之間，分子量位于3kDa和10kDa之間和分子量小于3kDa的四個不同分子量的具有強筋骨的麋鹿角活性部位部位。

作為優(yōu)選方案，以上所述的具有強筋骨的麋鹿角活性部位，采用的回流溶劑為超純水，加水量為藥材重量的6～15倍，回流提取次數(shù)為1～3次，每次4～12小時。

本發(fā)明所述的具有強筋骨的麋鹿角活性部位的制備方法，包括以下步驟：

(1)取麋鹿角，鎊片，加6～15倍量超純水加熱回流提取1～3次，每次每次4～12小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮，得麋鹿角總水提物，備用；

(2)取步驟(1)麋鹿角總水提物通入截留分子量為3K的中空纖維超濾膜組件，經(jīng)超濾分離后得到透過液，即為分子量小于3000的麋鹿角水提溶液和截流液；截流液再依次用截留分子量為1W、10W的超濾膜組件，得到分子量大于100kDa，分子量位于10kDa和100kDa之間和分子量位于3kDa和10kDa之間的活性部位。

作為優(yōu)選方案，以上所述的具有強筋骨的麋鹿角活性部位的制備方法，其特征在于，步驟(1)取麋鹿角，鎊片，加8倍量超純水加熱回流提取3次，每次每次8小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮，得麋鹿角總水提物。

本發(fā)明所述的具有強筋骨的麋鹿角活性部位在制備治療骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的具有強筋骨的麋鹿角活性部位在制備婦女更年期骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的具有強筋骨的麋鹿角活性部位在制備治療骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用，把麋鹿角活性部位和藥學(xué)上可接受的載體制成膠囊劑、片劑、顆粒劑、注射劑或微囊的藥物制劑。

有益效果：本發(fā)明提供的具有強筋骨的麋鹿角活性部位具有以下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明提供的具有強筋骨的麋鹿角活性部位，經(jīng)過現(xiàn)代分離手段和藥理實驗跟蹤，確定了麋鹿角水提取物的精制活性部位，通過現(xiàn)代分析儀器確定活性部位主要成分為水溶性蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸和核苷類等成分，活性成分更清楚。

且通過藥理實驗表明，本發(fā)明提供的鹿角活性部位能增強潑尼松龍致斑馬魚骨質(zhì)疏松模型中斑馬魚頭部骨骼骨礦化量和骨密度，顯示出較好的阻止斑馬魚骨量丟失作用。并且具有顯著的擬雌激素樣作用，具有很好的抗骨質(zhì)疏松功效。

(2)本發(fā)明提供的具有強筋骨的麋鹿角活性部位的制備方法，可操作性強，提取活性成分效率高，且制備方法成本低、環(huán)保、可實現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為麋鹿角水提溶液(ML2)對斑馬魚幼魚9dpf的腹面頭骨染色礦化面積的柱狀圖。

圖2為麋鹿角水提溶液(ML2)對斑馬魚幼魚9dpf的腹面頭骨染色I(xiàn)OD值的的柱狀圖。

圖3為麋鹿角水提溶液(ML3)對斑馬魚幼魚9dpf的腹面頭骨染色礦化面積的柱狀圖。

圖4為麋鹿角水提溶液(ML3)對斑馬魚幼魚9dpf的腹面頭骨染色I(xiàn)OD值的的柱狀圖。

圖5為麋鹿角水提溶液(ML4)對斑馬魚幼魚9dpf的腹面頭骨染色礦化面積的柱狀圖。

圖6為麋鹿角水提溶液(ML4)對斑馬魚幼魚9dpf的腹面頭骨染色I(xiàn)OD值的的柱狀圖。

圖7為麋鹿角水提溶液(ML5)對斑馬魚幼魚9dpf的腹面頭骨染色礦化面積的柱狀圖。

圖8為麋鹿角水提溶液(ML5)對斑馬魚幼魚9dpf的腹面頭骨染色I(xiàn)OD值的的柱狀圖。

圖9為麋鹿角不同提取物對MG-63-ERE細(xì)胞熒光素酶強度的影響柱狀圖。

圖10為麋鹿角不同提取物對MG-63-ERE細(xì)胞熒光素酶強度的影響柱狀圖。

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實施例1麋鹿角強筋骨活性部位的制備方法

(1)取麋鹿角20g，鎊片，置于燒瓶中，加8倍量超純水加熱回流提取3次，每次8h，濾過，合并濾液，減壓濃縮至適當(dāng)體積(0.2g生藥/mL)，得麋鹿角總水提物(ML1)，減壓濃縮，備用。

(2)取步驟(1)中麋鹿角總水提物通入截留分子量為3K的中空纖維超濾膜組件，經(jīng)超濾分離后，麋鹿角總水提物溶液被分為透過液和截流液兩個部分。從膜組件下端的出口端流出的透過液即為分子量小于3000的麋鹿角水提溶液(ML5)；截流液返回儲液罐中繼續(xù)進(jìn)行循環(huán)超濾。同理，依次用截留分子量為1W、10W的超濾膜組件，依次得到分子量大于100kDa(ML2)，分子量位于10kDa和100kDa之間(ML3)和分子量位于3kDa和10kDa之間(ML4)的活性部位，減壓濃縮，冷凍干燥，即得。

將水提取后的麋鹿角藥渣，加95％乙醇回流提取2次，每次3小時，濾液減壓回收乙醇，冷凍干燥，得乙醇提取物(ML6，0.0151g/g生藥)。

實施例2麋鹿角對潑尼松龍致斑馬魚骨質(zhì)疏松作用

1實驗材料

1.1儀器與試藥

ZEISS熒光倒置顯微鏡Axio observer.A1(蔡司光學(xué)儀器國際貿(mào)易有限公司)；生化培養(yǎng)箱SPX-80(寧波海曙賽褔實驗儀器廠)；專業(yè)圖像分析軟件image pro plus 6.0(美國Media Cybernetics公司)

潑尼松龍(蘇州亞科化學(xué)試劑股份有限公司，批號YK2012020101)；依替膦酸二鈉(中國藥品生物制品檢定所，批號101174-201001)；二甲基亞砜(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20120331)；多聚甲醛(成都市科龍化工試劑廠，批號20100504)；MS-222(3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽)(美國Acros Organics，批號A0288328)；茜素紅S(鄭州四季化工產(chǎn)品有限公司，批號20110806)；其余試劑均為分析純。

1.2實驗動物

斑馬魚成魚由南京大學(xué)模式動物研究所提供，德國Tuebingen品系；幼魚培養(yǎng)基組成為：5mM NaCl，0.17mM KCl，0.33mM CaCl2，0.33mM MgSO4，10-5％亞甲基藍(lán)。

2方法與結(jié)果

2.1溶液配制與樣品制備

2500μmol/L潑尼松龍儲備液：精密稱取潑尼松龍9.1mg，加入DMSO 1.3mL，溶解后用培養(yǎng)基稀釋并定容至10mL，即得。

25μmol/L潑尼松龍溶液：取0.5mL 2500μmol/L潑尼松龍儲備液，加入適量DMSO后，用培養(yǎng)基稀釋并定容至50mL，即得。

150μg/mL依替膦酸二鈉儲備液：精密稱取依替膦酸二鈉7.62mg，用培養(yǎng)基溶解，稀釋并定容至50mL，即得。

含25μmol/L潑尼松龍的15μg/mL依替膦酸二鈉溶液(含0.5％DMSO)：取5mL 150μg/mL依替膦酸二鈉儲備液和0.5mL 2500μmol/L潑尼松龍儲備液，加入適量DMSO，用培養(yǎng)基稀釋并定容至50mL，即得。

含25μmol/L潑尼松龍的麋鹿角各提取物溶液：精密稱取麋鹿角各樣品約1～15mg，分別加入DMSO各0.4mL，然后加培養(yǎng)基溶解并稀釋至10mL，得各樣品貯備液。取各樣品貯備液適量，分別加入2500μmol/L潑尼松龍儲備液適量，用培養(yǎng)基依次稀釋成含0.5％DMSO和25μmol/L潑尼松龍的相當(dāng)于20μg生藥/mL、100μg生藥/mL和500μg生藥/mL的麋鹿角各樣品溶液。

2.2分組、造模及給藥

取受精后4天(4dpf)的斑馬魚幼魚置24孔板中，8個幼魚/孔，共分成22組，每組設(shè)2個復(fù)孔，分別為空白培養(yǎng)基組、陰性對照組(0.5％DMSO)、模型組(25μmol/L潑尼松龍)、陽性藥物組(含25μmol/L潑尼松龍的15μg/mL依替膦酸二鈉溶液)、ML1-ML6低、中及高劑量組(含25μmol/L潑尼松龍的20、100、500μg生藥/mL溶液)。除空白培養(yǎng)基組外，各組均用培養(yǎng)基配制成含0.5％DMSO的溶液。除空白培養(yǎng)基組和陰性對照組外，其余20組均給予潑尼松龍造模，培養(yǎng)48小時后，將其中的陽性藥物組及ML1-ML6組分別替換成相應(yīng)的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)。造模及給藥期間每天更換相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，換藥時，吸凈24孔板里的培養(yǎng)基后迅速加入新鮮含藥培養(yǎng)基并潤洗兩遍，最終使每孔含溶液1mL，置28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3斑馬魚頭部骨骼熒光染色

培養(yǎng)周期5天，培養(yǎng)至9dpf，斑馬魚置于100mg/L MS-222溶液中麻醉致死，然后在4％多聚甲醛磷酸鹽緩沖溶液中固定3小時；去除多聚甲醛，加入新鮮配制的含1％KOH和1.5％H2O2的漂白劑使魚體上的色素細(xì)胞脫色；去除漂白劑，加入含0.5％KOH的茜素紅染液染色，放置過夜；去除染色液并用純水洗滌后，依次用不同濃度比的1％KOH和甘油的混合溶液浸泡使幼魚透明，最后保存于甘油中。

2.4斑馬魚頭部骨骼定量分析

染色處理后的斑馬魚頭部腹面置于熒光倒置顯微鏡下，采集圖像，運用專業(yè)圖像軟件Image pro plus 6.0計算其頭部紅色染色部分面積之和和累積光密度值(IOD)，進(jìn)行骨礦化量和骨密度分析。結(jié)果應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，組間比較采用Indendent-Samples T Test方法。

2.5結(jié)果

結(jié)果表明，與DMSO溶媒陰性對照組相比，潑尼松龍模型組的斑馬魚頭部骨骼染色面積和染色強度明顯減?。魂栃运幬锝M的染色面積和強度較潑尼松龍模型組顯著增強；本發(fā)明制備得到的麋鹿角活性部位ML2、ML3、ML4和ML5的染色面積較模型組明顯增加，說明具有顯著的強筋骨作用。

圖1至圖8為應(yīng)用圖像分析軟件計算的各組斑馬魚頭骨染色礦化面積和累積光密度值(IOD)的統(tǒng)計結(jié)果。ML2低劑量組染色面積顯著增加(P<0.05)，但其IOD值增加不明顯；ML3低、中劑量時均有顯著性差異(P<0.01或0.05)，中劑量組染色面積亦有顯著性差異(P<0.05)；ML4染色面積和IOD值隨劑量的升高呈增加趨勢，高劑量時有顯著性差異(P<0.05或0.01)；ML5染色面積隨劑量的升高亦呈增加趨勢，高劑量時染色面積和IOD值均有顯著性差異(P<0.05或0.01)。ML2-ML5強筋骨活性不盡相同，可選擇適宜劑量聯(lián)合制備成制劑。

通過以上實驗表明，本發(fā)明提供的麋鹿角活性部位ML2-ML5均具有一定的增加斑馬魚頭部骨骼骨礦化量和骨密度的作用，顯示出較好的阻止斑馬魚骨量丟失作用。

實施例3利用MG-63-ERE穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選麋鹿角不同提取物擬雌激素樣作用

1儀器與材料

1.1實驗儀器

EnSpire多模式微孔板檢測儀(美國PerkinElmer公司)；CKX31SF型倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)；CO₂恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；96孔培養(yǎng)板(美國Costar公司)。1.2樣品與試劑

麋鹿角總水提取物(ML1)及其不同分子量段MW>100kDa(ML2)、10kDa<MW<100kDa(ML3)、3kDa<MW<10kDa(ML4)、MW<3kDa(ML5)和乙醇提取物(ML6)樣品同“實例1中活性部位制備。

熒光素酶報告基因檢測試劑盒Luciferase Assay(美國Promega公司，0000076591)；MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；青霉素(市售80萬單位/瓶)；鏈霉素(市售1g/瓶)；無水乙醇(批號12042510668，南京化學(xué)試劑有限公司)；PBS(pH7.2-7.4，廣州翔博生物科技有限公司)；MTT(批號M2128，美國Sigma公司)；DMSO(批號20131106，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞株：MG-63-ERE細(xì)胞株。細(xì)胞培養(yǎng)：用含10％(體積分?jǐn)?shù))滅活標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、1％Non-Essential Amino Acids、1％Sodium Pyruvate、250μg/mL G418、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)液，于37℃，5％CO₂，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)基，每4天傳代1次。

2方法與結(jié)果

2.1麋鹿角不同提取物對MG-63-ERE細(xì)胞存活率的影響

MG-63-ERE細(xì)胞以1×l0⁴個/mL密度接種于96孔板，每孔200μl，邊緣孔用無菌PBS填充，37℃，5％CO₂培養(yǎng)24h，吸去培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基90μL，孵育3小時后，加入不同濃度的麋鹿角提取物各10μL，每個濃度樣品設(shè)3個復(fù)孔，37℃，5％CO₂繼續(xù)培養(yǎng)24h，再按前法加藥一次。24小時后，吸出含藥培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基90μL，孵育3小時后，每孔加MTT液10μL，使MTT終濃度為0.5mg/mL，繼續(xù)孵育3h。終止培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)基，每孔加150μLDMSO，振蕩0.5h，酶標(biāo)儀測定每孔570nm的光密度值(OD)，計算細(xì)胞存活率。存活率＝給藥組OD值的均數(shù)/對照組OD值的均數(shù)×100％。結(jié)果顯示麋鹿角各提取物樣品在100μg/mL濃度以下對MG-63-ERE細(xì)胞生長沒有明顯的抑制作用。

2.2熒光素酶檢測

麋鹿角不同提取物各樣品的細(xì)胞最終給藥濃度分別從高濃度100μg/mL開始依次稀釋3倍，得5個濃度，照前法連續(xù)給藥2天，每次給藥前更換新鮮不含酚紅培養(yǎng)基，3個小時后給藥。給藥結(jié)束后，移去培養(yǎng)基，用PBS洗滌兩次，每次100μL，小心移去PBS，每孔加入細(xì)胞裂解液25μL，振搖20min。分取部分細(xì)胞裂解液測定蛋白含量，其余裂解液置于酶標(biāo)儀中，每孔加入100μL熒光素酶檢測試劑，延遲時間2秒，讀數(shù)時間10秒，測定熒光強度。

如圖9和圖10結(jié)果顯示，麋鹿角95％乙醇提取物和水提取物10kDa<MW<100kDa、3kDa<MW<10kDa和MW<3kDa分子量段均能顯著增強MG63-ERE中熒光素酶表達(dá)，具有顯著的擬雌激素樣作用。

人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63在很多生理學(xué)方面和人成骨細(xì)胞有相似的地方，在細(xì)胞分化增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成熟和礦化階段，這兩個細(xì)胞表現(xiàn)得極為相近，因此MG-63細(xì)胞可以作為研究骨質(zhì)疏松疾病的模型。結(jié)果表示，活性部位ML3-ML5均能顯著增強MG63-ERE中熒光素酶表達(dá)，具有顯著的擬雌激素樣作用，進(jìn)一步研究麋鹿角的抗骨質(zhì)疏松作用物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機理提供依據(jù)。