本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及藥物組合物及其用途。

背景技術(shù)：

從古至今，美是一個(gè)永恒的話題。但歲月流逝，無論您如何保養(yǎng)和愛護(hù)，也不能阻止皮膚自然松弛和皺紋生成。這令人們特別是眾多愛美女士顯露衰老神態(tài)，自信和個(gè)人魅力減弱，產(chǎn)生消極情緒，影響了工作和生活的質(zhì)量。同樣，因?yàn)轲畀彙⑼鈧纫蛩匾鸬拿娌堪枷菪园毯垡步o人們帶來了無限的煩惱和痛苦。

從皮膚的結(jié)構(gòu)來看，真皮組織的厚薄與其纖維組織和基質(zhì)的多少關(guān)系密切，并與皮膚的致密性，飽滿度，松弛和起皺現(xiàn)象密切相關(guān)，近年來受到越來越多的美容皮膚科學(xué)家的關(guān)注。伴隨著人生理性衰老以及外界各種刺激，真皮層中膠原蛋白、透明質(zhì)酸流失的速度就開始加快，供給不及耗損；同時(shí)膠原蛋白和透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)也逐步遭到破壞，失去了原有的彈力；而皮膚組織中能夠分泌膠原蛋白和透明質(zhì)酸的成纖維細(xì)胞的數(shù)量減少，合成能力也逐漸減弱，這使得皮膚開始變得松弛，出現(xiàn)皺紋。凹陷性疤痕主要是由于真皮層被破壞，真皮層變薄，局部凹陷，纖維細(xì)胞減少，分泌膠原蛋白和彈力纖維減少所致。

然而，如何有效延緩皮膚衰老，美化容顏仍是人們不斷探求和解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明提出了一種可以用于阻止皮膚自然松弛和皺紋生成的藥物組合物，該藥物組合物具有免疫原性低、見效快、自然性、療效好、效果持久、風(fēng)險(xiǎn)低的優(yōu)勢。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種藥物組合物，所述藥物組合物用于提高細(xì)胞活性。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該藥物組合物包括：間充質(zhì)干細(xì)胞；以及軟組織填充劑，所述軟組織填充劑包括選自膠原蛋白、透明質(zhì)酸、鈣羥基磷灰石、聚乳酸、脂肪和富血小板血漿的至少之一，其中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞預(yù)先與膠原蛋白刺激因子接觸。利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物提高細(xì)胞活性、消除皺紋、創(chuàng)傷修復(fù)、美容，相比于現(xiàn)有技術(shù)，克服了自體成纖維細(xì)胞移植見效慢、效果不穩(wěn)定的缺陷，克服了自體脂肪移植的遠(yuǎn)期脂肪細(xì)胞成活率不穩(wěn)定，并且易受重力影響而下垂，脂肪吸收不均勻，治療效果不佳的缺陷，克服了脂肪干細(xì)胞移植手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高、應(yīng)用范圍受限等不利因素。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物具有免疫原性低、見效更快、自然性、療效好、效果更加持久、風(fēng)險(xiǎn)低的優(yōu)勢。本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物，膠原蛋白刺激因子預(yù)先刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌膠原、纖維連接蛋白等，預(yù)刺激之后的間充質(zhì)干細(xì)胞所組成的藥物組合物，注射到真皮層與皮下脂肪層時(shí)更有利于膠原蛋白的分泌，更有效的活化自體細(xì)胞并刺激血管的發(fā)生，使得更多的營養(yǎng)物質(zhì)被運(yùn)送到皺紋部位的皮膚。此外，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物，軟組織填充劑與間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合使用，軟組織填充劑可以將間充質(zhì)干細(xì)胞維持在一定的空間和體積范圍內(nèi)，不僅可以起到保護(hù)和潤滑細(xì)胞的作用，還能夠提高該范圍內(nèi)有效因子的作用濃度，更高效的促進(jìn)目標(biāo)細(xì)胞活性的增加。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述藥物組合物還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛，免疫原性更低，用藥更加安全，且臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞自身能夠分泌膠原蛋白并進(jìn)一步分泌包括SCF、bFGF、VEGF、IGF等在內(nèi)的因子，刺激真皮層中成纖維細(xì)胞存活與增殖并進(jìn)一步分泌膠原蛋白、透明質(zhì)酸和彈性纖維，不僅如此臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞還可以進(jìn)一步促進(jìn)血管化的發(fā)生，起到營養(yǎng)真皮及皮下相關(guān)細(xì)胞的作用，本發(fā)明實(shí)施例的方法用于提高細(xì)胞活性更加持久、有效。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為P1～P6代間充質(zhì)干細(xì)胞。發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大于P6代的間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞狀態(tài)不如早代次的細(xì)胞、分泌的細(xì)胞因子量也有所減少，P1～P6代間充質(zhì)干細(xì)胞本身狀態(tài)良好、細(xì)胞活性和因子分泌較強(qiáng)，用于提高細(xì)胞活性效果更佳。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述膠原蛋白刺激因子包括選自TGF-β1、bFGF的至少之一。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞預(yù)先與膠原蛋白刺激因子TGF-β1、bFGF的至少之一接觸，可刺激間充質(zhì)干細(xì)胞分泌膠原、纖維連接蛋白等，包括上述預(yù)先與膠原蛋白刺激因子接觸的間充質(zhì)干細(xì)胞的藥物組合物用于提高細(xì)胞活性，藥效更好。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述TGF-β1的濃度為2-20ng/m，任選地，所述bFGF的濃度為5-30ng/ml。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和bFGF在上述濃度下，刺激間充質(zhì)干細(xì)胞分泌膠原、纖維連接蛋白的效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述間充質(zhì)干細(xì)胞預(yù)先與所述膠原蛋白刺激因子進(jìn)行1～5天的接觸。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和bFGF在上述接觸時(shí)間下，刺激間充質(zhì)干細(xì)胞分泌膠原、纖維連接蛋白的效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一接觸后間充質(zhì)干細(xì)胞以懸浮于培養(yǎng)基、懸浮于生理鹽水或貼壁培養(yǎng)于培養(yǎng)基中的形式提供的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述間充質(zhì)干細(xì)胞以上述三種形式的其中一種提供，可保持間充干細(xì)胞的良好細(xì)胞狀態(tài)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一接觸后間充質(zhì)干細(xì)胞以懸浮于培養(yǎng)基或懸浮于生理鹽水中的形式提供，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的密度為0.1*10⁶-10*10⁶個(gè)/ml。發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)基或生理鹽水中的懸浮密度為0.1*10⁶-10*10⁶個(gè)/ml，可進(jìn)一步保證間充質(zhì)干細(xì)胞的良好狀態(tài)并提供合適大小的體積比，進(jìn)而使得本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物用于提高細(xì)胞活性的效果更佳。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述培養(yǎng)基或所述生理鹽水與所述軟組織填充劑的體積比為1:0.5～1:5。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，所述第一接觸后間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)基或生理鹽水中的懸浮密度為0.1*10⁶-10*10⁶個(gè)/ml，培養(yǎng)基或生理鹽水與軟組織填充劑的體積比為1:0.5～1:5，使得本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物用于提高細(xì)胞活性的效果更佳。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一接觸后間充質(zhì)干細(xì)胞以貼壁培養(yǎng)于培養(yǎng)基中的形式提供，所述第一接觸后間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁密度為1*10⁴～3*10⁴個(gè)/cm²。發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于培養(yǎng)基中，貼壁密度為1*10⁴～3*10⁴個(gè)/cm²，可進(jìn)一步保證間充質(zhì)干細(xì)胞的良好狀態(tài)，進(jìn)而使得本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物用于提高細(xì)胞活性的效果更佳。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述培養(yǎng)基與所述軟組織填充劑的體積比為1:0.5～1:5。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基與軟組織填充劑的體積比在1:0.5～1:5范圍內(nèi)，所述藥物組合物在提高細(xì)胞的活性上效果更加顯著。

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了前面所述藥物組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于抵抗衰老、消除皺紋。本發(fā)明實(shí)施例的藥物用于抵抗衰老、消除皺紋，具有見效快、藥效持久、免疫原性低、自然性和風(fēng)險(xiǎn)低的優(yōu)勢。

附圖說明

圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)圖；

圖2是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2的流式細(xì)胞鑒定圖；

圖3是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例3的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)前后的形態(tài)圖；以及

圖4是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例3的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后膠原合成量增高的半定量RT-PCR結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

藥物組合物

本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種藥物組合物，該藥物組合物用于提高細(xì)胞活性。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該藥物組合物包括：間充質(zhì)干細(xì)胞；以及軟組織填充劑，所述軟組織填充劑包括選自膠原蛋白、透明質(zhì)酸、鈣羥基磷灰石、聚乳酸、脂肪和富血小板血漿的至少之一，其中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞預(yù)先與膠原蛋白刺激因子接觸。利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物提高細(xì)胞活性、消除皺紋、美容，相比于現(xiàn)有技術(shù)，克服了自體成纖維細(xì)胞移植見效慢、效果不穩(wěn)定的缺陷，克服了自體脂肪移植的遠(yuǎn)期脂肪細(xì)胞成活率不穩(wěn)定，并且易受重力影響而下垂，脂肪吸收不均勻，治療效果不佳的缺陷，克服了脂肪干細(xì)胞移植手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高、應(yīng)用范圍受限等不利因素。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物，特殊因子的添加會刺激間充質(zhì)干細(xì)胞分泌膠原、纖維連接蛋白等，例如bFGF的低劑量添加就可以促進(jìn)細(xì)胞分泌Ⅰ型和Ⅲ型膠原，TGF-β1可以增加細(xì)胞中膠原的產(chǎn)生。通過單獨(dú)使用TGF-β1、單獨(dú)使用bFGF或者是兩者的聯(lián)合使用，對間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)刺激，將預(yù)刺激之后的間充質(zhì)干細(xì)胞，注射到真皮層與皮下脂肪層時(shí)更有利于膠原蛋白的分泌，更有效的活化自體細(xì)胞并刺激血管的發(fā)生，使得更多的營養(yǎng)物質(zhì)被運(yùn)送到皺紋部位的皮膚。所述軟組織填充劑，以透明質(zhì)酸為例，其具有吸水性、高負(fù)電荷性質(zhì)、生物相容性及在創(chuàng)傷愈合中的生物活性等，逐漸應(yīng)用于創(chuàng)面敷料和組織工程等皮膚創(chuàng)傷治療領(lǐng)域。透明質(zhì)酸參與皮膚創(chuàng)傷愈合的炎癥、增殖和重建期。其中在增殖期，短鏈透明質(zhì)酸(含6～20個(gè)單糖)可促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移至創(chuàng)傷組織，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原和糖胺聚糖(GAG)，構(gòu)建新的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)；此外，透明質(zhì)酸還可促進(jìn)血管生成和角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)一步促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷的愈合。本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物免疫原性低、效果更好；間充質(zhì)干細(xì)胞和包括選自膠原蛋白、透明質(zhì)酸、鈣羥基磷灰石、聚乳酸、脂肪和富血小板血漿的至少之一復(fù)合填充，塑型豐滿、見效快；其修復(fù)疤痕和皺紋，不破壞皮膚原本結(jié)構(gòu)，用間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的生長因子激活自體成纖維細(xì)胞的功能，并進(jìn)一步增加數(shù)量，達(dá)到填充改善皮膚活性狀態(tài)，具有自然性；此外，注射到皮膚缺陷處的括選自膠原蛋白、透明質(zhì)酸、鈣羥基磷灰石、聚乳酸、脂肪和富血小板血漿的至少之一具有除皺的效果，修復(fù)皮膚的平整、光澤和彈性，效果持久；最后，該藥物組合物可采用注射填充，規(guī)避了手術(shù)的失敗風(fēng)險(xiǎn)，是一種非常安全的藥物。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明公開的藥物組合物具有明顯優(yōu)于間充質(zhì)干細(xì)胞、軟組織填充劑兩者單獨(dú)使用的優(yōu)勢——軟組織填充劑可以將間充質(zhì)干細(xì)胞維持在一定的空間和體積范圍內(nèi)，不僅可以起到保護(hù)和潤滑細(xì)胞的作用，還能夠提高該范圍內(nèi)有效因子的作用濃度，更高效的促進(jìn)目標(biāo)細(xì)胞活性的增加。以透明質(zhì)酸為例，其與間充質(zhì)干細(xì)胞的聯(lián)合使用除了有上述優(yōu)勢之外，透明質(zhì)酸還可以起到保持間充質(zhì)干細(xì)胞水分，保護(hù)間充質(zhì)干細(xì)胞不受病原菌的侵害等作用。

根據(jù)本發(fā)明的另一具體實(shí)施例，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛，它可采用從醫(yī)療廢棄物——臍帶中分離間充質(zhì)干細(xì)胞，不需要從患者身上取材，免去患者手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)和痛苦，且臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫原性更低，更加安全，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可進(jìn)一步分泌包括SCF、bFGF、VEGF、IGF等在內(nèi)的因子，刺激真皮層中成纖維細(xì)胞存活與增殖并進(jìn)一步分泌膠原蛋白、透明質(zhì)酸和彈性纖維，不僅如此臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞還可以進(jìn)一步促進(jìn)血管化的發(fā)生，進(jìn)一步起到營養(yǎng)真皮及皮下相關(guān)細(xì)胞的作用，藥效更加有力。

根據(jù)本發(fā)明的具體示例，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為P1～P6代間充質(zhì)干細(xì)胞。發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，P6代以上的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)不如早代次的細(xì)胞、分泌的細(xì)胞因子量也有所減少，P1～P6代間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)佳，細(xì)胞活性和因子分泌能力較強(qiáng)，用于提高細(xì)胞的活性的效果更加顯著。所述膠原蛋白刺激因子的選擇不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述膠原蛋白刺激因子可包括選自TGF-β1、bFGF的至少之一。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞預(yù)先與膠原蛋白刺激因子TGF-β1、bFGF的至少之一接觸，可刺激間充質(zhì)干細(xì)胞分泌膠原、纖維連接蛋白等，包括上述預(yù)先與膠原蛋白刺激因子接觸的間充質(zhì)干細(xì)胞的藥物組合物用于提高細(xì)胞活性，藥效更好。

根據(jù)本發(fā)明的再一具體實(shí)施例，所述TGF-β1的濃度為2-20ng/m，任選地，所述bFGF的濃度為5-30ng/ml。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和bFGF在上述濃度下，刺激間充質(zhì)干細(xì)胞分泌膠原、纖維連接蛋白的效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述間充質(zhì)干細(xì)胞預(yù)先與所述膠原蛋白刺激因子進(jìn)行1～5天的接觸。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和bFGF在上述接觸時(shí)間下，刺激間充質(zhì)干細(xì)胞分泌膠原、纖維連接蛋白的效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的具體示例，所述第一接觸后間充質(zhì)干細(xì)胞以懸浮于培養(yǎng)基、懸浮于生理鹽水或貼壁培養(yǎng)于培養(yǎng)基中的形式提供的。發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)意外地發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞以懸浮于培養(yǎng)基、懸浮于生理鹽水或貼壁培養(yǎng)于培養(yǎng)基中的形式提供，可保證間充質(zhì)干細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述第一接觸后間充質(zhì)干細(xì)胞以懸浮于培養(yǎng)基或懸浮于生理鹽水中的形式提供，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的密度為0.1*10⁶-10*10⁶個(gè)/ml。有利于保持間充質(zhì)干細(xì)胞的活性，有利于保持間充質(zhì)干細(xì)胞較高的分泌生長因子以及膠原蛋白，進(jìn)而使得本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物用于提高細(xì)胞活性的效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述培養(yǎng)基或所述生理鹽水與所述軟組織填充劑的體積比為1:0.5～1:5。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞的在培養(yǎng)基或生理鹽水中的懸浮密度為0.1*10⁶-10*10⁶個(gè)/ml，培養(yǎng)基或生理鹽水與軟組織填充劑的體積比為1:0.5～1:5，既可以保證間充質(zhì)干細(xì)胞良好的細(xì)胞狀態(tài)，又可以保證軟組織填充劑有力的正向生理效應(yīng)，如體外模擬或者應(yīng)用于法令紋、嘴角凹紋、額眉間皺紋的填補(bǔ)，甚至可以用在修鼻尖鼻梁、豐唇、修下巴、青春痘與水痘凹疤修正，從而產(chǎn)生光滑、飽滿、有彈性的皮膚。培養(yǎng)基或生理鹽水與軟組織填充劑的體積比為1:0.5～1:5，使得本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物用于提高細(xì)胞活性的效果更佳。

根據(jù)本發(fā)明的一些具體實(shí)施例，所述第一接觸后間充質(zhì)干細(xì)胞以貼壁培養(yǎng)于培養(yǎng)基中的形式提供，所述間充質(zhì)干細(xì)胞在所述培養(yǎng)基中的密度為1*10⁴～3*10⁴個(gè)/cm²。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞生長有密度依賴效應(yīng)，過密或者過稀都會影響細(xì)胞狀態(tài)，密度小于1*10⁴個(gè)/cm²時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)差；高于3*10⁴個(gè)/cm²時(shí)，細(xì)胞沒有足夠的空間生長，培養(yǎng)基的過度消耗，細(xì)胞狀態(tài)差。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于培養(yǎng)基中，其貼壁密度為1*10⁴～3*10⁴個(gè)/cm²，有利于保持間充質(zhì)干細(xì)胞的活性，有利于保持間充質(zhì)干細(xì)胞較高的分泌生長因子以及膠原蛋白，進(jìn)而使得本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物用于提高細(xì)胞活性的效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的一些具體實(shí)施例，所述培養(yǎng)基與所述軟組織填充劑的體積比為1:0.5～1:5。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基與軟組織填充劑的體積比在1:0.5～1:5范圍內(nèi)，所述藥物組合物在提高細(xì)胞的活性上效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物組合物的劑型為注射劑。本發(fā)明的藥物組合物可以通過任何常見的途徑被給藥，只要它可以到達(dá)預(yù)期的組織，主要通過注射的途徑給藥。給藥的各種方式是可以預(yù)期的，包括皮下，皮層，局部，但是本發(fā)明不限于這些已舉例的給藥方式。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物以注射劑的劑型提供，本發(fā)明的藥物組合物能夠更加精準(zhǔn)地抵達(dá)待治療位點(diǎn)，藥物組合物的治療效果會更加有效、持久。此外，本發(fā)明的藥物組合物可以使用將活性成分傳送到靶細(xì)胞的特定器械來給藥。

本發(fā)明的藥物組合物的給藥頻率和劑量可以通過多個(gè)相關(guān)因素被確定，該因素包括要被處理的人的年齡，性別，體重和疤痕等的嚴(yán)重程度以及作為活性成分的藥物類型。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，劑量可分為適宜形式的1劑、2劑或多劑，以在整個(gè)時(shí)間段內(nèi)以1次、2次或多次給藥，只要達(dá)到美容有效量即可。

術(shù)語“美容有效量”是指藥物組合物足以顯著改善某些癥狀的量，也即為給定癥狀提供美容效果的量。例如，在美容中，減少、預(yù)防、延緩、抑制或阻滯任何癥狀的藥物應(yīng)當(dāng)是美容有效的。美容有效量的藥物不需要消除癥狀，但將為癥狀提供美容，使得個(gè)體癥狀的發(fā)作被延緩、阻止或預(yù)防，或者癥狀得以緩解，或者癥狀的期限被改變。術(shù)語“美容”用于指獲得期望的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果。所述效果就完全或部分預(yù)防癥狀而言可以是預(yù)防性的。本文使用的“美容”涵蓋哺乳動(dòng)物、特別是人的癥狀。本文使用的“美容”涵蓋將藥物給予個(gè)體以治愈、緩解、改善、減輕或抑制個(gè)體的癥狀的任何用藥，包括但不限于將含本文所述藥物組合物給予有需要的個(gè)體。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的藥物組合物可與常規(guī)美容方法和/或療法相結(jié)合使用，或者可與常規(guī)美容方法和/或療法分開使用。當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物在采用與其它藥物的聯(lián)合療法中給藥時(shí)，它們可序貫地或同時(shí)地給予個(gè)體?；蛘?，本發(fā)明的藥物組合物可包含藥學(xué)上可接受的載體或藥學(xué)上可接受的賦形劑以及本領(lǐng)域已知的其它美容藥的組合。

藥物組合物的用途

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了前面所述藥物組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于抵抗衰老、消除皺紋。本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物中的間充質(zhì)干細(xì)胞是可以分泌包括bFGF、VEGF、IGF等在內(nèi)的細(xì)胞因子，發(fā)揮營養(yǎng)、刺激真皮層中成纖維細(xì)胞存活與增殖，進(jìn)一步分泌膠原蛋白、透明質(zhì)酸和彈性纖維，充盈真皮層結(jié)構(gòu)，撫平皺紋，填補(bǔ)凹陷；本身就可以分泌產(chǎn)生膠原蛋白，進(jìn)一步增加皮膚的厚度和彈性，使凹陷部分得到舒展，填平皺紋和缺損，恢復(fù)皮膚的彈性和光澤。本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物中的間充質(zhì)干細(xì)胞為預(yù)先與膠原蛋白刺激因子接觸的間充質(zhì)干細(xì)胞，更有利于膠原蛋白的分泌，療效更好。同時(shí)進(jìn)一步復(fù)合包括膠原蛋白、透明質(zhì)酸、鈣羥基磷灰石(微晶瓷)、聚乳酸、脂肪和富血小板血漿的至少之一回輸?shù)交颊咂つw缺陷處可進(jìn)行有效的皺紋消除、疤痕修復(fù)、抵抗衰老等。本發(fā)明實(shí)施例的藥物用于抵抗衰老、消除皺紋，具有見效快、藥效持久、免疫原性低、自然性和風(fēng)險(xiǎn)低的優(yōu)勢。

提高細(xì)胞活性的方法

在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種提高細(xì)胞活性的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括：將間充質(zhì)干細(xì)胞與膠原蛋白刺激因子進(jìn)行第一接觸；以及將目標(biāo)細(xì)胞與第一接觸后間充質(zhì)干細(xì)胞以及軟組織填充劑進(jìn)行第二接觸，所述軟組織填充劑包括選自膠原蛋白、透明質(zhì)酸、鈣羥基磷灰石、聚乳酸、脂肪和富血小板血漿的至少之一。利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的提高細(xì)胞活性的方法，以用來消除皺紋、美容，相比于現(xiàn)有技術(shù)，克服了自體成纖維細(xì)胞移植見效慢、效果不穩(wěn)定的缺陷，克服了自體脂肪移植的遠(yuǎn)期脂肪細(xì)胞成活率不穩(wěn)定，并且易受重力影響而下垂，脂肪吸收不均勻，治療效果不佳的缺陷，克服了脂肪干細(xì)胞移植手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高、應(yīng)用范圍受限等不利因素。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法，特殊因子的添加會刺激間充質(zhì)干細(xì)胞分泌膠原、纖維連接蛋白等，例如bFGF的低劑量添加就可以促進(jìn)細(xì)胞分泌Ⅰ型和Ⅲ型膠原，TGF-β1可以增加細(xì)胞中膠原的產(chǎn)生。通過單獨(dú)使用TGF-β1、單獨(dú)使用bFGF或者是兩者的聯(lián)合使用，對間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)刺激，將預(yù)刺激之后的間充質(zhì)干細(xì)胞，注射到真皮層與皮下脂肪層時(shí)更有利于膠原蛋白的分泌，更有效的活化自體細(xì)胞并刺激血管的發(fā)生，使得更多的營養(yǎng)物質(zhì)被運(yùn)送到皺紋部位的皮膚。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法，見效更快、免疫原性低；間充質(zhì)干細(xì)胞和包括選自膠原蛋白、透明質(zhì)酸、鈣羥基磷灰石、聚乳酸、脂肪和富血小板血漿的至少之一復(fù)合填充，塑型豐滿、見效快；其修復(fù)疤痕和皺紋，不破壞皮膚原本結(jié)構(gòu)，用間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的生長因子激活自體成纖維細(xì)胞的功能，并進(jìn)一步增加數(shù)量，達(dá)到填充改善皮膚活性狀態(tài)，具有自然性；此外，注射到皮膚缺陷處的括選自膠原蛋白、透明質(zhì)酸、鈣羥基磷灰石、聚乳酸、脂肪和富血小板血漿的至少之一具有除皺的效果，修復(fù)皮膚的平整、光澤和彈性，效果持久；最后，該方法規(guī)避了手術(shù)的失敗風(fēng)險(xiǎn)，是一種非常安全的方法。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明公開的提高細(xì)胞活性的方法具有明顯優(yōu)于二者單獨(dú)使用的優(yōu)勢——軟組織填充劑可以將間充質(zhì)干細(xì)胞維持在一定的空間和體積范圍內(nèi)，不僅可以起到保護(hù)和潤滑細(xì)胞的作用，還能夠提高該范圍內(nèi)有效因子的作用濃度，更高效的促進(jìn)目標(biāo)細(xì)胞活性的增加。以透明質(zhì)酸為例，其與間充質(zhì)干細(xì)胞的聯(lián)合使用除了有上述優(yōu)勢之外，透明質(zhì)酸還可以起到保持間充質(zhì)干細(xì)胞水分，保護(hù)間充質(zhì)干細(xì)胞不受病原菌的侵害等作用。

根據(jù)本發(fā)明的另一具體實(shí)施例，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛，它可采用從醫(yī)療廢棄物——臍帶中分離間充質(zhì)干細(xì)胞，不需要從患者身上取材，免去患者手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)和痛苦，且臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫原性更低，更加安全，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可進(jìn)一步分泌包括SCF、bFGF、VEGF、IGF等在內(nèi)的因子，刺激真皮層中成纖維細(xì)胞存活與增殖并進(jìn)一步分泌膠原蛋白、透明質(zhì)酸和彈性纖維，不僅如此臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞還可以進(jìn)一步促進(jìn)血管化的發(fā)生，進(jìn)一步起到營養(yǎng)真皮及皮下相關(guān)細(xì)胞的作用，藥效更加有力。

根據(jù)本發(fā)明的具體示例，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為P1～P6代間充質(zhì)干細(xì)胞。發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，P6代以上的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)不如早代次的細(xì)胞、分泌的細(xì)胞因子量也有所減少，P1～P6代間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)佳，細(xì)胞活性和因子分泌能力較強(qiáng)，用于提高細(xì)胞的活性的效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述膠原蛋白刺激因子包括選自TGF-β1、bFGF的至少之一。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞預(yù)先與膠原蛋白刺激因子TGF-β1、bFGF的至少之一接觸，可刺激間充質(zhì)干細(xì)胞分泌膠原、纖維連接蛋白等，包括上述預(yù)先與膠原蛋白刺激因子接觸的間充質(zhì)干細(xì)胞的藥物組合物用于提高細(xì)胞活性，藥效更好。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述TGF-β1的濃度為2-20ng/m，任選地，所述bFGF的濃度為5-30ng/ml。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和bFGF在上述濃度下，刺激間充質(zhì)干細(xì)胞分泌膠原、纖維連接蛋白的效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述間充質(zhì)干細(xì)胞與所述膠原蛋白刺激因子進(jìn)行1～5天的所述第一接觸。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和bFGF在上述接觸時(shí)間下，刺激間充質(zhì)干細(xì)胞分泌膠原、纖維連接蛋白的效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的具體示例，所述第一接觸后間充質(zhì)干細(xì)胞以懸浮于培養(yǎng)基、懸浮于生理鹽水或貼壁培養(yǎng)于培養(yǎng)基中的形式提供的。發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)意外地發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞以懸浮于培養(yǎng)基、懸浮于生理鹽水或貼壁培養(yǎng)于培養(yǎng)基中的形式提供，可保證間充質(zhì)干細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述第一接觸后間充質(zhì)干細(xì)胞以懸浮于培養(yǎng)基或懸浮于生理鹽水中的形式提供，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的密度為0.1*10⁶-10*10⁶個(gè)/ml。有利于保持間充質(zhì)干細(xì)胞的活性，有利于保持間充質(zhì)干細(xì)胞較高的分泌生長因子以及膠原蛋白，進(jìn)而使得本發(fā)明實(shí)施例的方法用于提高細(xì)胞活性的效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述培養(yǎng)基或所述生理鹽水與所述軟組織填充劑的體積比為1:0.5～1:5。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞的在培養(yǎng)基或生理鹽水中的懸浮密度為0.1*10⁶-10*10⁶個(gè)/ml，培養(yǎng)基或生理鹽水與軟組織填充劑的體積比為1:0.5～1:5，既可以保證間充質(zhì)干細(xì)胞良好的細(xì)胞狀態(tài)，又可以保證軟組織填充劑有力的正向生理效應(yīng)，如體外模擬或者應(yīng)用于法令紋、嘴角凹紋、額眉間皺紋的填補(bǔ)，甚至可以用在修鼻尖鼻梁、豐唇、修下巴、青春痘與水痘凹疤修正，從而產(chǎn)生光滑、飽滿、有彈性的皮膚。培養(yǎng)基或生理鹽水與軟組織填充劑的體積比為1:0.5～1:5，使得本發(fā)明實(shí)施例的用于提高細(xì)胞活性的方法的效果更佳。

根據(jù)本發(fā)明的一些具體實(shí)施例，所述第一接觸后間充質(zhì)干細(xì)胞以貼壁培養(yǎng)于培養(yǎng)基中的形式提供，所述間充質(zhì)干細(xì)胞在所述培養(yǎng)基中的密度為1*10⁴～3*10⁴個(gè)/cm²。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞生長有密度依賴效應(yīng)，過密或者過稀都會影響細(xì)胞狀態(tài)，密度小于1*10⁴個(gè)/cm²時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)差；高于3*10⁴個(gè)/cm²時(shí)，細(xì)胞沒有足夠的空間生長，培養(yǎng)基的過度消耗，細(xì)胞狀態(tài)差。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于培養(yǎng)基中，其貼壁密度為1*10⁴～3*10⁴個(gè)/cm²，有利于保持間充質(zhì)干細(xì)胞的活性，有利于保持間充質(zhì)干細(xì)胞較高的分泌生長因子以及膠原蛋白，進(jìn)而使得本發(fā)明實(shí)施例的方法用于提高細(xì)胞活性的效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的一些具體實(shí)施例，所述培養(yǎng)基與所述軟組織填充劑的體積比為1:0.5～1:5。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基與軟組織填充劑的體積比在1:0.5～1:5范圍內(nèi)，所述方法在提高細(xì)胞的活性上效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述目標(biāo)細(xì)胞、所述第一接觸后間充質(zhì)干細(xì)胞的個(gè)數(shù)比為1:0.1～1：10。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)細(xì)胞、第一接觸后間充質(zhì)干細(xì)胞的個(gè)數(shù)比高于1:0.1，間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量相對較少，其分泌的因子量低，不足以促進(jìn)大量的目標(biāo)細(xì)胞活性的增加；目標(biāo)細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞的個(gè)數(shù)比低于1:10，目標(biāo)細(xì)胞的數(shù)量過少，造成間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子的飽和，在一定程度上造成一定的細(xì)胞和因子的浪費(fèi)。目標(biāo)細(xì)胞、所述間充質(zhì)干細(xì)胞的個(gè)數(shù)比為1:0.1～1：10內(nèi)，對提高目標(biāo)細(xì)胞的活性更加快速、有效。

需要說明的是，本申請所述“美容”“去皺”“疤痕修復(fù)”“創(chuàng)傷修復(fù)”等是以非治療為目的的。

需要說明的是，本申請中所述的“目標(biāo)細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞以及軟組織填充劑進(jìn)行接觸”，既可以是細(xì)胞個(gè)體與填充劑之間的接觸，也可以是間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子與目標(biāo)細(xì)胞及軟組織填充劑之間的接觸。

需要說明的是，本申請中所述的“細(xì)胞活性”是指細(xì)胞的生理狀態(tài)和功能，包括細(xì)胞基本狀態(tài)、細(xì)胞增殖能力(有時(shí)稱為活力)、分泌因子的能力以及常規(guī)細(xì)胞功能的維持。

需要說明的是，本申請所述的“細(xì)胞狀態(tài)良好”是指細(xì)胞維持正常培養(yǎng)時(shí)的形態(tài)好(以間充質(zhì)干細(xì)胞為例，細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈梭形，片狀生長)，細(xì)胞透亮、邊緣清楚，細(xì)胞折光性較好，整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過程中無污染物(包括支原體、細(xì)菌、真菌、黑膠充、原蟲等)出現(xiàn)。

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

在本實(shí)施例中，發(fā)明人篩選了包括不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞與膠原蛋白或透明質(zhì)酸或鈣羥基磷灰石(微晶瓷)或聚乳酸或脂肪或富血小板血漿的藥物組合物對提高細(xì)胞活性的影響，在本實(shí)施例中，所待提高活性的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞包括：臍帶血來源的、外周血來源的、臍帶來源的、胎盤來源的、羊膜來源的、骨髓來源的、骨膜來源的、脂肪來源的、牙齒來源的等。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞相比于其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，本身屬于醫(yī)療廢棄物，細(xì)胞免疫原性更低，具有一定的通用性，所獲得的細(xì)胞質(zhì)量高、數(shù)量多、純度也較高。進(jìn)而在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明人選擇包括臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞與膠原蛋白或透明質(zhì)酸或鈣羥基磷灰石(微晶瓷)或聚乳酸或脂肪或富血小板血漿的藥物組合物進(jìn)行后續(xù)檢測。以下，以間充質(zhì)干細(xì)胞與透明質(zhì)酸的藥物組合物為例，進(jìn)行詳細(xì)分析和描述。

實(shí)施例2

在本實(shí)施例中，發(fā)明人對所選用的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)和表型進(jìn)行了觀察和鑒定。結(jié)果如下所述：

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)表現(xiàn)為細(xì)胞貼壁，呈梭形，片狀生長。具體形態(tài)如圖1所示。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在如圖1的生長狀態(tài)下，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)，分泌包括bFGF、VEGF、IGF等在內(nèi)的細(xì)胞因子以及膠原蛋白的增殖能力強(qiáng)，適于選擇作為本發(fā)明藥物組合物的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

對所獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行流式鑒定，結(jié)果圖2所示，從圖2結(jié)果中可以看出，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD90(陽性細(xì)胞率：100％)、CD105(陽性細(xì)胞率：100％)，不表達(dá)造血和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記——CD34和CD31。

實(shí)施例3

在本實(shí)施例中，發(fā)明人進(jìn)一步對所獲得的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞采用TGF-β1、bFGF或者是兩者的聯(lián)合使用進(jìn)行預(yù)刺激。將預(yù)刺激之后的間充質(zhì)干細(xì)胞，注射到小鼠真皮層與皮下脂肪層。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這更有利于膠原蛋白的分泌，更有效的活化自體細(xì)胞并刺激血管的發(fā)生，使得更多的營養(yǎng)物質(zhì)被運(yùn)送到皺紋部位的皮膚。在本實(shí)施例中的具體使用劑量為2-20ng/ml的TGF-β1、5-30ng/ml的bFGF，或者是兩者同時(shí)添加使用對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理的時(shí)間為1-5天。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在添加TGF-β1和bFGF的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化3D的形態(tài)如下圖3所示，從結(jié)果中可以看出，與正常形態(tài)的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，誘導(dǎo)分化的細(xì)胞整體偏大，胞體呈梭形或三角形，細(xì)胞匯合后，排列緊密，呈典型的漩渦狀、放射狀走行。

進(jìn)一步地，發(fā)明人采用半定量RT-PCR檢測臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)前后Ⅰ型膠原mRNA水平的表達(dá)，結(jié)果如圖4所示，結(jié)果顯示：Ⅰ型膠原的α1鏈(COL1A1)在誘導(dǎo)前后的表達(dá)量未見明顯改變；Ⅰ型膠原的α2鏈(COL1A2)在誘導(dǎo)后的表達(dá)量是誘導(dǎo)前表達(dá)量的3倍。這表明誘導(dǎo)分化后，膠原合成有所增加。

實(shí)施例4

在本實(shí)施例中，發(fā)明人對所選用的經(jīng)過膠原蛋白刺激因子預(yù)刺激的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與透明質(zhì)酸的用量上進(jìn)行了篩選。

發(fā)明人進(jìn)行了間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞活率實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程如下所述：

1、消化臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞：將一瓶生長至80％～90％的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞使用胰酶消化，培養(yǎng)基中和后，在1200rpm的條件下離心5min；

2、重懸細(xì)胞：離心后棄上清，使用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行重懸；

3、接種細(xì)胞：將細(xì)胞按照同樣的體積(100μl)進(jìn)行接種(每孔2000個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞)，每個(gè)孔重復(fù)5次，一共開展實(shí)驗(yàn)3天，即每個(gè)孔有15個(gè)重復(fù)樣。之后將接種后的細(xì)胞于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

4、添加透明質(zhì)酸/膠原蛋白：待細(xì)胞過夜培養(yǎng)貼壁后棄舊的培養(yǎng)基，并添加入新鮮的培養(yǎng)基。其中，對照組只添加培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組按照如下體積比添加透明質(zhì)酸，其中培養(yǎng)基：透明質(zhì)酸的體積比為：1：0.01，1：0.1，1：0.5，1：1，1：5，1：10，總體積為100μl。

5、檢測：24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后用槍頭丟掉培養(yǎng)基和透明質(zhì)酸/膠原蛋白，之后PBS洗一次，加入100ul新鮮的培養(yǎng)基，并加入10ul CCK8，輕柔混勻，避免氣泡的產(chǎn)生，之后37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中靜置3-4小時(shí)，之后于OD560處檢測吸光光度值。全部時(shí)間點(diǎn)檢測完畢后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)基與透明質(zhì)酸的體積比在1：0.5-1:5的范圍內(nèi)均可保持間充質(zhì)干細(xì)胞的基本活性，間充質(zhì)干細(xì)胞的活性佳。在體積比為1：0.01和1：0.1時(shí)，透明質(zhì)酸過釋，影響透明質(zhì)酸的效果的發(fā)揮；體積比為1：10，則間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)變差，間充質(zhì)干細(xì)胞死亡率明顯上升。故優(yōu)選培養(yǎng)基與透明質(zhì)酸的體積比為1：0.5-1:5。

實(shí)施例5

在本實(shí)施例中，發(fā)明人利用經(jīng)過膠原蛋白刺激因子預(yù)刺激的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和透明質(zhì)酸與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，并對成纖維細(xì)胞的活性進(jìn)行了檢測。

實(shí)驗(yàn)過程如下所述：

1、消化成纖維細(xì)胞：將一瓶生長至80％～90％的成纖維細(xì)胞使用胰酶消化，培養(yǎng)基中和后，在1200rpm的條件下離心5min。

2、在消化成纖維細(xì)胞的同時(shí)，消化臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。具體操作如下所述：將一瓶生長至80％～90％的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞使用胰酶消化，培養(yǎng)基中和后，在1200rpm的條件下離心5min。

3、重懸細(xì)胞：離心后棄上清，使用培養(yǎng)基將細(xì)胞按照1*10⁵個(gè)/ml的密度進(jìn)行重懸。

4、接種細(xì)胞：將1*10⁴個(gè)成纖維細(xì)胞接種到24孔板中，每個(gè)孔重復(fù)3次(一共有3個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)，即每個(gè)孔有9個(gè)重復(fù)樣)，之后放置孔徑為1μm的Transwell小室(懸掛式細(xì)胞培養(yǎng)皿)并將0.7*10⁴個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞接種于小室，培養(yǎng)基總體積為接近小室上沿為最佳，之后將接種后的細(xì)胞于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

5、添加透明質(zhì)酸：待細(xì)胞過夜培養(yǎng)貼壁后棄舊的培養(yǎng)基，PBS洗1次后加入新鮮的無血清培養(yǎng)基。其中，對照組只添加培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組按照Transwell小室(懸掛式細(xì)胞培養(yǎng)皿)培養(yǎng)基體積與透明質(zhì)酸體積比為1：1添加透明質(zhì)酸。

6、檢測：12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)后僅保留成纖維細(xì)胞并使用PBS洗一次，加入1ml新鮮的無血清培養(yǎng)基，并加入100μl CCK8，輕柔混勻，避免氣泡的產(chǎn)生，之后37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中靜置3-4小時(shí)，之后于OD560處檢測吸光光度值。全部時(shí)間點(diǎn)檢測完畢后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)12和24小時(shí)后有間充質(zhì)干細(xì)胞以及軟組織填充劑所在的實(shí)驗(yàn)組，細(xì)胞狀態(tài)和檢測的OD值要明顯優(yōu)于單獨(dú)使用無血清培養(yǎng)基組；48小時(shí)后，由于細(xì)胞長期處于無血清培養(yǎng)的狀態(tài)下，整體狀態(tài)均不如12小時(shí)和24小時(shí)，但是也可觀察到實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果優(yōu)于對照組。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，經(jīng)過膠原蛋白刺激因子預(yù)刺激的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以及軟組織填充劑可以提高目標(biāo)細(xì)胞的活性，例如成纖維細(xì)胞。

實(shí)施例6

在本實(shí)施例中，發(fā)明人進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了本發(fā)明實(shí)施例的提高細(xì)胞活性的方法的效果。

將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以1×10⁶/mL的密度(懸浮于生理鹽水)與注射用玻尿酸(透明質(zhì)酸)(瑞藍(lán)2號)按照1：2的比例在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行混合，混合均勻后形成細(xì)胞-玻尿酸復(fù)合物。之后開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，具體操作為分組植入雄性BLAB/c裸鼠(體量約20g，購自維通利華，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2012-0001)。實(shí)驗(yàn)鼠自身即為對照組和實(shí)驗(yàn)組，分別將注射用玻尿酸(左側(cè))，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞-玻尿酸復(fù)合物(右側(cè))，按每一樣本0.3mL注射于裸鼠背部腰臀皮膚的左側(cè)和右側(cè)，每組各1個(gè)點(diǎn)，6-10周后再次觀察注射部位形態(tài)。

具體結(jié)果如下：

(1)未注射之前的觀察：準(zhǔn)備開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的雄性BLAB/c裸鼠在未注射前，其背部皮膚規(guī)整，沒有異常突起的形態(tài)。

(2)完成注射后的觀察：將裸鼠左側(cè)腰臀部皮膚皮內(nèi)注射300ul玻尿酸，右側(cè)腰臀部平行部位的皮膚注射300μl臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞-玻尿酸復(fù)合物。從形態(tài)上看，小鼠腰臀部左右各有一個(gè)大小相當(dāng)?shù)耐黄?，隆起高度約為0.5cm，半徑約為0.4cm左右的圓形(接近圓形，基本為橢圓形)用手感覺有一定的硬度，能夠維持一定形態(tài)。

(3)完成注射后6-10周的觀察：實(shí)驗(yàn)開展6-10周后，再次觀察動(dòng)物形態(tài)。左側(cè)單獨(dú)注射玻尿酸組形成的皮膚隆起狀態(tài)已逐漸降低(大小基本可以忽略)，但是右側(cè)注射臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞-玻尿酸復(fù)合物的一側(cè)還有一定的隆起形態(tài)，隆起高度約為0.3cm，半徑約為0.4cm左右的圓形(接近圓形，基本為橢圓形)，隆起幅度明顯高于單獨(dú)注射玻尿酸組。這表明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞-玻尿酸復(fù)合物對塑形后的維持更為長久。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。