本發(fā)明涉及基因疫苗技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種Ii基因序列在豬流行性腹瀉病毒基因疫苗中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種急性腸道傳染性疾病，臨床癥狀以腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征。PEDV屬于冠狀病毒，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒。PEDV編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白S蛋白(spike protein)、E蛋白(small member protein)、M蛋白(member protein)和N蛋白(nucleoprotein)。S蛋白在受體結(jié)合、誘導(dǎo)中和抗體和促進(jìn)病毒和細(xì)胞融合等方面發(fā)揮著重要作用。

自2010年，PED在我國(guó)南方省份暴發(fā)，在短短一年內(nèi)導(dǎo)致上百萬(wàn)頭豬死亡并蔓延至全國(guó)，對(duì)我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失。另外，韓國(guó)、日本、越南、泰國(guó)甚至美國(guó)均出現(xiàn)PED暴發(fā)，導(dǎo)致仔豬大范圍死亡。PED暴發(fā)對(duì)仔豬損害最為嚴(yán)重，尤其是出生7d內(nèi)的仔豬，呈現(xiàn)傳播范圍廣、感染率和死亡率高等特點(diǎn)。但成年豬感染PEDV僅表現(xiàn)輕微的臨床癥狀。由于病程較短，仔豬體內(nèi)來(lái)不及產(chǎn)生主動(dòng)免疫應(yīng)答，目前主要采取的免疫方法是免疫母豬，產(chǎn)生含有抗體的初乳，仔豬通過(guò)吸允初乳獲得被動(dòng)性免疫。目前商品化疫苗主要是弱毒疫苗，包括我國(guó)的CV777、韓國(guó)的KPEDV-9和DR13、日本的P-5V，但這些疫苗的免疫效果均不理想。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究探索了各種形式的疫苗，包括轉(zhuǎn)基因植物疫苗、重組腺病毒疫苗和亞單位疫苗等，但是均不能誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)。研究人員證實(shí)PEDV流行毒株發(fā)生變異，尤其是免疫原性較好的S蛋白變異最大，這也許是以往疫苗不能有效防控目前PED的原因。

DNA疫苗也稱核酸疫苗，是通過(guò)重組DNA技術(shù)將具有保護(hù)性抗原基因克隆至真核表達(dá)載體，經(jīng)一定的途徑導(dǎo)入宿主體內(nèi)，通過(guò)宿主細(xì)胞表達(dá)外源蛋白并誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。目前通過(guò)美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的DNA疫苗包括艾滋病、腫瘤、埃博拉病毒和瘧疾等DNA疫苗。

DNA疫苗在接種宿主后，通過(guò)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)能夠正確表達(dá)外源蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，在靶器官和細(xì)胞持續(xù)表達(dá)抗原，可誘導(dǎo)全面的免疫應(yīng)答反應(yīng)。另外，DNA疫苗制備簡(jiǎn)便、成本較低、儲(chǔ)存方便，沒(méi)有毒力返強(qiáng)或者殘留的危險(xiǎn)，能夠避免免疫逃避現(xiàn)象。但是，DNA疫苗存在生物安全性問(wèn)題，如外源DNA與宿主基因組整合和免疫耐受的可能性；另外，質(zhì)粒導(dǎo)入宿主的效率低和外源基因在宿主細(xì)胞表達(dá)水平低導(dǎo)致了DNA疫苗免疫效果下降。如何提高DNA疫苗誘導(dǎo)的抗體水平是當(dāng)前研究DNA疫苗的重點(diǎn)。

MHCII類分子恒定鏈(Invariant chain,Ii)是MHCII類分子生物合成中的重要分子伴侶，屬于II型跨膜蛋白，呈非多肽性。Ii作為MHCII類分子的伴侶蛋白，在MHCII類分子復(fù)合物的形成、分選及內(nèi)化中起著重要作用，同時(shí)Ii能夠阻斷MHCII類分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)，防止其與內(nèi)源性抗原結(jié)合，起著保護(hù)未成熟MHCII類分子作用。尤為重要的是Ii能夠促進(jìn)B細(xì)胞成熟、T細(xì)胞分化及增強(qiáng)抗原遞呈，已被用于一種免疫載體。

至今沒(méi)有MHCII類分子恒定鏈融合蛋白在豬流行性腹瀉病毒基因疫苗中應(yīng)用的相關(guān)記載。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中DNA疫苗免疫效果低、至今沒(méi)有MHCII類分子恒定鏈融合蛋白在豬流行性腹瀉病毒基因疫苗中應(yīng)用的相關(guān)記載的問(wèn)題，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环NIi基因序列在豬流行性腹瀉病毒基因疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過(guò)以下步驟得到的：

Ii基因序列在豬流行性腹瀉病毒基因疫苗中的應(yīng)用，所述Ii基因堿基序列見(jiàn)序列表中序列8。

所述的應(yīng)用，優(yōu)選將Ii基因載體和豬流行性腹瀉病毒S1(m)基因載體混合或者將Ii基因與豬流行性腹瀉病毒S1(m)基因連接后用于豬流行性腹瀉病毒基因疫苗的制備，S1(m)基因堿基序列見(jiàn)序列表中序列10。

所述的應(yīng)用，優(yōu)選Ii基因與S1(m)基因通過(guò)2A基因連接，Ii-2A基因堿基序列見(jiàn)序列表中序列9。

所述的應(yīng)用，優(yōu)選Ii基因增強(qiáng)豬流行性腹瀉病毒S1(m)基因蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，提高ELISA抗體水平，促進(jìn)分泌IL-4的T細(xì)胞產(chǎn)生。

所述的應(yīng)用，優(yōu)選操作如下：

(1)設(shè)計(jì)并合成用于擴(kuò)增Ii基因的引物，見(jiàn)序列表中序列6和7，設(shè)計(jì)并合成用于擴(kuò)增豬流行性腹瀉病毒S1(m)基因的引物，見(jiàn)序列表中序列4和5；

(2)提取豬脾臟RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用序列表中序列6和7經(jīng)PCR擴(kuò)增得到Ii基因，堿基序列見(jiàn)序列表中序列8；以優(yōu)化合成的S1(m)基因?yàn)槟０澹眯蛄斜碇行蛄?和5經(jīng)PCR擴(kuò)增得到S1(m)基因，堿基序列見(jiàn)序列表中序列10；

(3)將Ii基因和S1(m)基因分別插入質(zhì)粒pVAX得到重組質(zhì)粒pVAX-Ii和pVAX-S1(m)，將兩種重組質(zhì)?；旌虾笫褂?。

所述的應(yīng)用，優(yōu)選操作如下：

(1)設(shè)計(jì)并合成用于擴(kuò)增Ii基因的引物，見(jiàn)序列表中序列6和7，設(shè)計(jì)并合成用于擴(kuò)增口蹄疫2A基因的Ii基因Ii-2A的引物，見(jiàn)序列表中序列1、2和3，設(shè)計(jì)并合成用于擴(kuò)增豬流行性腹瀉病毒S1(m)基因的引物，見(jiàn)序列表中序列4和5；

(2)提取豬脾臟RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用序列表中序列6和7經(jīng)PCR擴(kuò)增得到Ii基因，堿基序列見(jiàn)序列表中序列8；以得到的Ii基因?yàn)槟０?，分別用序列表中序列1和2、序列表中序列1和3經(jīng)PCR逐步擴(kuò)增得到Ii-2A基因，堿基序列見(jiàn)序列表中序列9；以優(yōu)化合成的S1(m)基因?yàn)槟０澹眯蛄斜碇行蛄?和5經(jīng)PCR擴(kuò)增得到S1(m)基因，堿基序列見(jiàn)序列表中序列10；

(3)將Ii-2A基因與S1(m)基因連接，并連接入質(zhì)粒pVAX得到重組質(zhì)粒VAX-Ii-2A-S1(m)。

所述的應(yīng)用，優(yōu)選PCR體系為2×primerSTAR Mix 12.5μl，F(xiàn)引物1.0μl，R引物1.0μl，模板0.2μl，ddH₂O 11.3μl，總計(jì)25.0μl。

所述的應(yīng)用，優(yōu)選PCR反應(yīng)程序是98℃1s；98℃10s，55℃30s，72℃2min 30s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃5min。

為了提高DNA疫苗的免疫效果，本實(shí)驗(yàn)嘗試了多種方法，如根據(jù)哺乳動(dòng)物密碼子偏嗜性進(jìn)行了S1基因修飾；加入分子佐劑Ii提高S1蛋白誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答；免疫前在小鼠腿部肌肉注射鹽酸利多卡因提高細(xì)胞攝入真核質(zhì)粒的效率。其中加入分子佐劑Ii提高S1蛋白誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答效果較理想。

本發(fā)明的有益效果：

1)本試驗(yàn)在經(jīng)密碼子優(yōu)化的S1基因的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-S1(m)和pVAX-Ii-2A-S1(m)，小鼠免疫試驗(yàn)驗(yàn)證S1蛋白的免疫原性和Ii作為分子佐劑在提高體液和細(xì)胞免疫中發(fā)揮的作用，首免后63d出現(xiàn)特異性抗體，首免后84d抗體明顯升高，

2)本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建融合表達(dá)密碼子優(yōu)化的S1蛋白和Ii蛋白的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)小鼠免疫試驗(yàn)驗(yàn)證DNA疫苗的免疫特性，為研制PEDV疫苗提出新的思路，為豬體試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為目的基因的PCR擴(kuò)增，A:M:1Kb DNA Marker；1:Negative control；2:S1(m)；B:M:DL2000DNA Marker；1:Negative control；2:Ii；C:M:DL2000DNA Marker；1:Negative control；2:Ii-2A；

圖2為重組載體的酶切鑒定，A:M:DL5000DNA Marker；1:pVAX-Ii(BamHI/EcoRV)；2:pVAX(BamHI/EcoRV)；B:M:DL5000DNA Marker；1:pVAX-S1(m)(EcoRV/XhoI)；2:pVAX(EcoRV/XhoI)；C:M:DL5000DNA Marker；1:pVAX-Ii-2A-S1(m)(BamHI/EcoRV/XhoI)；2:pVAX(BamHI/EcoRV/XhoI)；

圖3為IFA鑒定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞后蛋白表達(dá)；

圖4為Western blot鑒定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞蛋白表達(dá)，A:1:pVAX-Ii-2A-S1(m)；2:pVAX-S1(m)；3:HEK-293A.B:1:pVAX-Ii-2A-S1(m)；2:pVAX-Ii；3:HEK-293A；圖5為ELISA抗體檢測(cè)；

圖6為中和抗體檢測(cè)；

圖7為PEDV特異的淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答；

圖8為脾臟淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-4含量；

圖9為脾臟淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子IFN-γ含量。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明：

實(shí)施例1

1材料與方法

1.1毒株、質(zhì)粒和細(xì)胞

E.coil DH5α、PEDV弱毒株由本實(shí)驗(yàn)室保存。pVAX1質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。HEK-293A細(xì)胞、Vero細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。經(jīng)密碼子優(yōu)化的S1基因(S1(m))由上海捷瑞生物公司合成。

1.2試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Trizol Plus、Oligod(T)₁₈、dNTPs(10mM)、PrimerSTAR高保真酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Takara公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen。兔抗S1蛋白多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。兔抗CD74抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotech。DNA凝膠回收試劑盒、Plasmid Miniprep Kit購(gòu)自BIOMEGA公司。HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德公司。異丙醇和無(wú)水乙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。三氯甲烷購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。人外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)?yáng)生物制品有限公司。

Balb/c小鼠購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3目的基因的擴(kuò)增

1.3.1引物

根據(jù)GenBank發(fā)布的CD74基因(Ii)序列(GenBank:AK394321)設(shè)計(jì)并合成用于擴(kuò)增Ii基因及含有口蹄疫2A基因的Ii基因(Ii-2A)的引物，在上下游引物中分別引入BamHI和EcoRV；以GenBank發(fā)布的PEDV S基因序列(GenBank:KF453516)為標(biāo)準(zhǔn)，上海捷瑞生物公司通過(guò)密碼子優(yōu)化并合成S1(1-2379bp)基因，即S1(m)基因；設(shè)計(jì)并合成用于擴(kuò)增S1(m)基因的引物，在上下游引物中分別引入EcoRV和XhoI。引物序列如下表：

表用于擴(kuò)增不同S1和Ii片段的引物及其序列

1.3.2 PCR體系與程序

采取豬新鮮脾臟，提取總RNA，利用Oligod(T)₁₈反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板，引物Ii-F/Ii-R經(jīng)PCR擴(kuò)增Ii基因；以PCR產(chǎn)物Ii基因?yàn)槟０?，Ii-F/Ii-R-1、Ii-F/Ii-R-2經(jīng)PCR逐步擴(kuò)增Ii-2A基因；以優(yōu)化合成的S1(m)基因?yàn)槟０?，引物S1(m)-F/S1(m)-R經(jīng)PCR擴(kuò)增S1(m)基因。

PCR體系和程序如下：2×primerSTAR Mix 12.5μlμl，F(xiàn) 1.0μlμl，R 1.0μlμl，模板0.2μlμl，ddH₂O 11.3μlμl，總計(jì)25.0μlμl。

PCR反應(yīng)程序是98℃1s；98℃10s，55℃30s，72℃2min 30s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離，PCR產(chǎn)物S1(m)、Ii和Ii-2A均經(jīng)DNA片段膠回收試劑盒純化?；厥掌斡?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的S1(m)基因?yàn)槟０澹瑪U(kuò)增得到大小約2379bp的S1(m)片段(圖1中A)；提取脾臟總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA并以此為模板，擴(kuò)增得到大小約663bp的Ii片段(圖1中B)；以Ii片段為模板，經(jīng)過(guò)兩次PCR得到含有口蹄疫2A基因的Ii片段，即Ii-2A，大小約702bp(圖1中C)。

1.4重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

1.4.1重組質(zhì)粒pVAX-Ii和pVAX-Ii-2A的構(gòu)建

1.4.1.1 Ii、Ii-2A片段及pVAX質(zhì)粒酶切和回收

利用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRV分別酶切pVAX質(zhì)粒及片段Ii、Ii-2A，酶切體系如下：限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRV各1.0μlμl，10×K buffer 5.0μlμl，片段或質(zhì)粒各15ug和8ug，補(bǔ)水至50μlμl。在水浴鍋中37℃作用3h，1％瓊脂糖凝膠電泳分離，切下目的條帶經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收。

1.4.1.2目的片段與載體連接及轉(zhuǎn)化

連接反應(yīng)總體積為10μlμl。體系如下：10×Ligase Buffer 1.0μl，T4DNA連接酶0.5μl，片段7.5μl，pVAX 1.0μl。于小型連接儀上16℃連接過(guò)夜。同時(shí)制備E.coil DH5α感受態(tài)細(xì)胞。第二天將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有100ug/ml卡那霉素(K⁺)的LB平板，37℃培養(yǎng)14-16h，挑取單個(gè)菌落至含有100ug/ml K⁺液體LB培養(yǎng)基中，于搖床200rpm 37℃培養(yǎng)4-6h，吸取1μl菌液做模板，按照上述方法PCR擴(kuò)增進(jìn)行初步鑒定。

1.4.1.3重組質(zhì)粒的小量提取及鑒定

利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。酶切鑒定重組質(zhì)粒，酶切體系如下：限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRV各0.5μl，10×K buffer 1.0μl，重組質(zhì)粒2.0μl，補(bǔ)水至10μl。同時(shí)酶切pVAX質(zhì)粒做對(duì)照。在水浴鍋中37℃作用3h，1％瓊脂糖凝膠電泳分離并觀察結(jié)果。將鑒定為陽(yáng)性的兩種質(zhì)粒分別命名為pVAX-Ii和pVAX-Ii-2A，并送至Invitrogen公司測(cè)序。

1.4.2重組載體pVAX-S1(m)和pVAX-Ii-S1(m)的構(gòu)建

1.4.2.1 S1(m)片段、pVAX及pVAX-Ii-2A質(zhì)粒酶切和回收

利用限制性內(nèi)切酶EcoRV和XhoI分別酶切S1(m)片段、pVAX及pVAX-Ii-2A質(zhì)粒，酶切體系如下：限制性內(nèi)切酶EcoRV和XhoI各1.0μl，10×H buffer 5.0μl，片段或質(zhì)粒各15ug和8ug，補(bǔ)水至50μl。在水浴鍋中37℃作用3h，1％瓊脂糖凝膠電泳分離，切下目的條帶經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收。

1.4.2.2目的片段與載體連接及轉(zhuǎn)化

連接反應(yīng)總體積為10μl。體系如下：10×Ligase Buffer 1.0μl，T4DNA連接酶0.5μl，S1(m)片段3.5μl，質(zhì)粒1.0μl，補(bǔ)水至10μl。于小型連接儀上16℃連接過(guò)夜。同時(shí)制備E.coil DH5α感受態(tài)細(xì)胞。第二天將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有100ug/ml卡那霉素(K⁺)的LB平板，37℃培養(yǎng)14-16h，挑取單個(gè)菌落至含有100ug/ml K⁺液體LB培養(yǎng)基中，于搖床200rpm 37℃培養(yǎng)4-6h，吸取1μl菌液做模板，按照上述方法PCR擴(kuò)增進(jìn)行初步鑒定。1.4.2.3重組質(zhì)粒的小量提取及鑒定

利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。酶切鑒定重組質(zhì)粒，酶切體系如下：限制性內(nèi)切酶EcoRV和XhoI各0.5μl，10×H buffer 1.0μl，重組質(zhì)粒2.0μl，補(bǔ)水至10μl。同時(shí)酶切pVAX質(zhì)粒做對(duì)照。在水浴鍋中37℃作用3h，1％瓊脂糖凝膠電泳分離并觀察結(jié)果。將鑒定為陽(yáng)性的兩種質(zhì)粒分別命名為pVAX-S1(m)和pVAX-Ii-2A-S1(m)(簡(jiǎn)稱為pVAX-Ii-S1(m))，并送至Invitrogen公司測(cè)序。

利用BamHI/EcoRV酶切重組質(zhì)粒pAVX-Ii，得到與Ii基因預(yù)期大小相符的條帶(圖2中A)；利用EcoRV/XhoI酶切重組質(zhì)粒pAVX-S1(m)，得到與S1(m)基因預(yù)期大小相符的條帶(圖2中B)；利用BamHI/EcoRV/XhoI酶切重組質(zhì)粒pAVX-Ii-S1(m)，得到與S1(m)基因和Ii-2A基因預(yù)期大小相符的兩個(gè)條帶(圖2中C)。將重組質(zhì)粒送至Invitrogen測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示基因全部正確。

1.5重組質(zhì)粒的真核表達(dá)鑒定

1.5.1轉(zhuǎn)染

將四種質(zhì)粒pVAX、pVAX-Ii、pVAX-S1(m)和pVAX-Ii-S1(m)按照Lipofectamine 2000操作說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞。具體步驟如下：轉(zhuǎn)染前一天，將HEK-293A細(xì)胞均勻鋪于24孔和96孔細(xì)胞板，加入完全培養(yǎng)基后于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；第二天待細(xì)胞密度達(dá)到90-95％時(shí)，棄掉完全培養(yǎng)基，加入不含有抗生素的完全培養(yǎng)基。將1ug質(zhì)粒和3μl Lipofectamine2000分別稀釋于100μl不含有抗生素和血清的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5min；將上述兩種液體輕輕混合均勻，室溫靜置20min；棄掉24孔板中培養(yǎng)基，加入混合液，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6h；棄掉混合液，加入1ml完全培養(yǎng)基，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h。另外，按照上述步驟將0.3ug質(zhì)粒和0.8μl Lipofectamine混合作用后加入96孔細(xì)胞板中，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h。

1.5.2 IFA

取出轉(zhuǎn)染后72h的96孔細(xì)胞板，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗滌2次；棄去PBS，每孔加入甲醇:丙醇(1:1)100μl，置于-20℃靜置20min；棄去甲醇:丙醇，PBS洗滌3次；加入兔抗PEDV S1陽(yáng)性血清(1:20)或兔抗CD74多克隆抗體(1:100)100μl/孔，37℃孵育60min；棄去抗體，PBST洗滌6次，每次間隔5min；加入FITC-羊抗兔IgG(1:100)50μl/孔，37℃孵育45min；棄去抗體，PBST洗滌3次，每次間隔5min；于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。同時(shí)設(shè)置正常的HEK-293A作為對(duì)照。

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后72h，利用兔抗S1陽(yáng)性血清進(jìn)行IFA試驗(yàn)驗(yàn)證重組質(zhì)粒pVAX-S1(m)和pVAX-Ii-S1(m)在HEK-293A細(xì)胞中S1蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pVAX-S1(m)和pVAX-Ii-S1(m)轉(zhuǎn)染后的HEK-293A細(xì)胞均出現(xiàn)熒光，而pVAX轉(zhuǎn)染后的HEK-293A細(xì)胞和正常的HEK-293A細(xì)胞沒(méi)有熒光；利用兔抗CD74多抗進(jìn)行IFA試驗(yàn)驗(yàn)證重組質(zhì)粒pVAX-Ii和pVAX-Ii-S1(m)在HEK-293A細(xì)胞中Ii蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pVAX-Ii和pVAX-Ii-S1(m)轉(zhuǎn)染后的HEK-293A細(xì)胞均出現(xiàn)熒光，而pVAX轉(zhuǎn)染后的HEK-293A細(xì)胞和正常的HEK-293A細(xì)胞沒(méi)有熒光(圖3)。

1.5.3 Western blot

取出轉(zhuǎn)染后72h的24孔細(xì)胞板，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗滌2次；加入細(xì)胞裂解液100μl/孔，置于冰上作用30min；收集細(xì)胞，加入5×Loading Buffer并于100℃煮沸5min；利用10％蛋白膠進(jìn)行SDS-PAGE，分離蛋白。同時(shí)以相同的方法處理HEK-293A細(xì)胞做對(duì)照。SDS-PAGE結(jié)束后，將膠切成合適大小，半干轉(zhuǎn)印法進(jìn)行轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印條件是20V，35min。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將NC膜置于含有10％脫脂乳的PBST中，室溫作用3-5h；棄掉PBST，加入兔抗PEDV S蛋白陽(yáng)性血清(1:200)或者兔抗CD74多克隆抗體(1:1000)，抗體利用含有5％脫脂乳的PBST稀釋，于4℃靜置過(guò)夜。次日，棄去抗體，PBST洗滌4-6h；加入用PBST稀釋的羊抗兔IgG-HRP(1:15000)，室溫輕搖30min；棄去抗體，PBST洗滌1-2h；用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，在暗室進(jìn)行X光片暴光，經(jīng)顯影和定影后觀察結(jié)果。

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞后72h，收獲細(xì)胞并經(jīng)10％SDS-PAGE分離。利用兔抗S1陽(yáng)性血清進(jìn)行Western blot分析，發(fā)現(xiàn)pVAX-S1(m)和pVAX-Ii-S1(m)泳道在相應(yīng)大小處均出現(xiàn)條帶，而HEK-293A泳道沒(méi)有條帶；利用兔抗CD74多抗進(jìn)行Western blot分析，發(fā)現(xiàn)pVAX-Ii和pVAX-Ii-S1(m)泳道在相應(yīng)大小處均出現(xiàn)條帶，而HEK-293A泳道沒(méi)有條帶(圖4)。

1.6小鼠免疫試驗(yàn)

1.6.1質(zhì)粒的大量提取

將200μL菌種接種于6ml含有100ug/ml卡那霉素(K⁺)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日將6ml重組菌接種于500ml含有100ug/ml K⁺的LB液體培養(yǎng)基中,37℃200rpm振蕩培養(yǎng)16-20h。7500rpm 10min離心菌液，收集菌體并用300ml 4℃預(yù)冷的STE(0.1M NaCl、10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH 8.0)洗滌兩次。7500rpm 10min離心菌液，收集菌體并加入6ml 4℃預(yù)冷的溶液I(50mM葡萄糖、10mM EDTA、25mM Tris-Cl，PH 8.0)重懸細(xì)菌；加入6ml新配制的溶液II(0.2M NaOH；1％SDS)，輕輕上下顛倒離心管數(shù)次，置于冰上作用5min；加入8ml 4℃預(yù)冷的溶液III(冰乙酸11.5mL，5M乙酸鉀60mL，水28.5mL)，輕輕上下顛倒離心管數(shù)次至白色沉淀產(chǎn)生，置于冰上作用5min；4℃12000rpm離心15min，將上清移至新的離心管中并加入0.6倍體積的異丙醇，置于-20℃作用60min；4℃12000rpm離心15min，棄去上清并加入15ml 70％乙醇洗滌一次；4℃12000rpm離心10min，棄去上清，室溫干燥后加入4.5ml ddH₂O溶解；加入500μl RNase A(10mg/mL)，37℃作用60min；加入等體積的酚：氯仿，混勻后置于室溫作用5min；4℃12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管，加入等體積的氯仿，混勻后置于室溫作用5min；4℃12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管，加入等體積的無(wú)水乙醇，混勻后置于室溫作用25min；4℃12000rpm離心15min，棄去上清并加入10ml 70％乙醇洗滌一次；4℃12000rpm離心10min，棄去上清，室溫干燥后加入3ml ddH₂O溶解。分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度和純度，置于-20℃保存。

1.6.2小鼠分組與免疫

將60只清潔級(jí)小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，1、2和3組分別免疫pVAX-Ii+pVAX-S1(m)、pVAX-Ii-S1(m)和pVAX-S1(m)；4、5和6組分別免疫pVAX-Ii、pVAX和PBS，作為對(duì)照組。免疫劑量100μg/只，免疫前一天，腿部肌肉注射2％鹽酸利多卡因，50μμl/只。免疫途徑是腿部肌肉注射，免疫劑量為100ug/只。首免后21d、42d和63d以相同途徑和劑量加強(qiáng)免疫。

首免后63d和84d后，每組隨機(jī)取5只小鼠，眼球采血并分離血清用于ELISA抗體檢測(cè)和中和抗體檢測(cè)；無(wú)菌采集小鼠脾臟，分離淋巴細(xì)胞用于淋巴細(xì)胞增值試驗(yàn)。

1.6.3 ELISA抗體檢測(cè)

用經(jīng)超速離心純化的PEDV包被酶標(biāo)板，用抗原包被液將蛋白濃度調(diào)整為10μg/ml，每孔加入100μμl，37℃放置1h，4℃過(guò)夜，PBST洗滌3次，每次5min，拍干；每孔加入200μμl5％脫脂乳，37℃放置3h，PBST洗滌3次，拍干；用PBST從1:25開(kāi)始2倍比稀釋血清樣品，37℃放置1h，棄去樣品，PBST洗滌3次，每次5min，排干；每孔加入用PBST稀釋的HRP-羊抗小鼠IgG(1:10000)，37℃放置30min，棄掉樣品，PBST洗滌3次，每次5min，排干；避光環(huán)境中，將TMB顯色液A和B等體積混合，每孔加入100μμl，37℃作用10-15min；每孔加入50μl 2M H₂SO4終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取OD450值；計(jì)算樣品S/N值，以S/N值≥2.1的血清最大稀釋度為該血清的效價(jià)。

ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果顯示：首免后63d，1、2和3免疫組均能檢測(cè)到特異性抗體，但各組之間抗體水平差異不明顯(P＞0.05)；首免后84d，各免疫組抗體水平升高，且1、2和3免疫組抗體水平明顯高于其他三組(P＜0.05)，1和2免疫組抗體水平與3免疫組相比差異明顯(P＜0.05)，1和2免疫組之間抗體水平差異不明顯(P＞0.05)(圖5)。

1.6.4中和抗體檢測(cè)

病毒中和試驗(yàn)前測(cè)定PEDV病毒滴度。將Vero細(xì)胞均勻鋪于96孔細(xì)胞板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層進(jìn)行接毒。用維持液將病毒作10倍倍比稀釋，接種于細(xì)胞孔中，100μl/孔，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-5d。同時(shí)設(shè)置不接毒細(xì)胞做陰性對(duì)照。觀察CPE并記錄每個(gè)稀釋度的CPE孔數(shù)，按照Reed-Muench法計(jì)算PEDV TCID₅₀。

于病毒中和試驗(yàn)前1d將Vero細(xì)胞均勻鋪于96孔細(xì)胞板中。待檢血清經(jīng)56℃滅活30min，1200rpm離心5min，收集上清；取血清樣品250μμl加入到250μl的含有2％FBS的維持液中，將血清做1:2稀釋，混勻后從中吸取250μl加入到250μμl新的維持液中，做1:4稀釋，......，如此依次倍比稀釋；將PEDV用維持液稀釋至200TCID₅₀/100μμl，并將其和稀釋后血清等體積混合，于37℃作用1h；棄去96孔細(xì)胞板中培養(yǎng)基，加入病毒和血清混合液，100μμl/孔，每個(gè)血清稀釋度做4個(gè)重復(fù)，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-5d。同時(shí)設(shè)立陰性血清對(duì)照、空白對(duì)照、病毒-陰性血清對(duì)照。當(dāng)陰性血清對(duì)照和空白對(duì)照沒(méi)有出現(xiàn)CPE，而病毒-陰性血清對(duì)照出現(xiàn)CPE時(shí)，試驗(yàn)成立并記錄每個(gè)血清稀釋度的CPE孔數(shù)。以完全抑制CPE的血清的最大稀釋度為該血清的中和效價(jià)。

中和抗體檢測(cè)結(jié)果顯示：首免后63d，各免疫組之間中和抗體水平差異不明顯(P＞0.05)；首免后84d，1、2和3免疫組中和抗體水平明顯高于其他三組(P＜0.05)，但這1、2和3免疫組之間的中和抗體水平差異不明顯(P＞0.05)(圖6)。

1.6.5淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

1.6.5.1脾淋巴細(xì)胞的制備

將小鼠摘除眼球放血并頸椎脫臼處死，于75％酒精中浸泡5min；無(wú)菌剪開(kāi)小鼠腹部皮膚，打開(kāi)腹膜并小心取出脾臟；將脾臟放入200目銅網(wǎng)縫制的小袋中，用4號(hào)針頭在脾臟上扎針孔；用裝在注射器上的彎針頭輕輕刮取脾臟，使脾臟細(xì)胞溢出，加入少許PBS并用吸管吹打數(shù)次制備單細(xì)胞懸液；將脾細(xì)胞懸液輕輕加入到含有人外周血淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，2000rpm離心15min；用吸管吸取離心管中白色云霧層，移至含有5ml紅細(xì)胞裂解液的離心管中，2000rpm離心10min；棄去上清，加入5ml 1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，2000rpm離心10min；棄去上清，用含有10％FBS的1640重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度至5×10⁶個(gè)/ml，加入96孔細(xì)胞板，100μμl/孔。

1.6.5.2淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

將經(jīng)超速離心純化的PEDV作為刺激抗原，ConA為陽(yáng)性對(duì)照，終濃度為10ug/ml；37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)66h，吸取部分上清，加入20μlμl MTT(5mg/ml)，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6h；棄去培養(yǎng)基，每孔加入100μlμl DMSO，振蕩融解結(jié)晶，于酶標(biāo)儀讀取OD570數(shù)值；計(jì)算刺激指數(shù):SI＝刺激孔OD值/未刺激孔OD值。

分別在首免后63d和84d分離小鼠脾淋巴細(xì)胞，進(jìn)行PEDV特異性淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。結(jié)果顯示：首免后63d，1、2和3免疫組均出現(xiàn)特異性淋巴細(xì)胞增值，但與其他三組相比差異不明顯(P＞0.05)；首免后84d，1、2和3免疫組的刺激指數(shù)升高，且顯著高于其他三組(P＜0.05)(圖7)。

1.6.5.3細(xì)胞因子測(cè)定

收集首免后63d和84d小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增值試驗(yàn)中各組刺激孔刺激66h的細(xì)胞上清，檢測(cè)上清中IFN-γ和IL-4含量，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4含量檢測(cè)結(jié)果顯示：首免后63d，各免疫組之間IL-4含量差異不明顯(P＞0.05)；首免后84d，1、2和3免疫組的IL-4含量明顯升高，且顯著高于其他三組(P＜0.05)，1和2免疫組IL-4含量顯著高于3免疫組(P＜0.05)，1和2免疫組之間IL-4含量差異不明顯(P＞0.05)，(圖8)。

小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ含量檢測(cè)結(jié)果顯示：首免后63d，各免疫組之間IFN-γ含量差異不明顯(P＞0.05)；首免后84d，1、2和3免疫組的IFN-γ含量明顯升高，且顯著高于其他三組(P＜0.05)，1、2和3免疫組之間的IFN-γ含量差異不明顯(P＞0.05)(圖9)。1.6.5.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS軟件，對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行ANOVA及LSD多重分析，比較各組差異，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

本發(fā)明中，我們構(gòu)建了Ii和S1融合基因，中間用口蹄疫的2A基因相連接，Western blot結(jié)果表明重組質(zhì)粒均能正確表達(dá)蛋白，其中利用兔抗S陽(yáng)性血清驗(yàn)證重組質(zhì)粒pVAX-Ii-S1(m)蛋白表達(dá)時(shí)，出現(xiàn)大小約110kD和85kD兩個(gè)條帶，分別是Ii-S1(m)融合蛋白及S1蛋白的大小；利用兔抗Ii多抗驗(yàn)證時(shí)出現(xiàn)大小約110kD和25kD兩個(gè)條帶，分別是Ii-S1(m)融合蛋白及Ii蛋白的大小，造成這種現(xiàn)象的原因是2A蛋白發(fā)生自身裂解，使得Ii-S1(m)融合蛋白發(fā)生部分裂解。利用重組質(zhì)粒免疫小鼠驗(yàn)證DNA疫苗的免疫原性。結(jié)果表明首免后84d，1、2和3免疫組均能檢測(cè)到特異性抗體和中和抗體，并且明顯高于其他三組(P＜0.01)，另外1和2免疫組特異性抗體水平顯著高于3免疫組(P＜0.05)。這說(shuō)明Ii顯著提高了S1蛋白誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子含量檢測(cè)結(jié)果顯示，首免后84d，1、2和3免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4和IFN-γ含量顯著高于其他三組(P＜0.01)，并且1和2免疫組IL-4含量顯著高于3免疫組(P＜0.05)。這說(shuō)明Ii促進(jìn)了分泌IL-4的T細(xì)胞產(chǎn)生。小鼠免疫試驗(yàn)證實(shí)重組質(zhì)粒表達(dá)的S1蛋白能夠有效的誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且Ii顯著增強(qiáng)了體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

綜上所述，真核表達(dá)質(zhì)粒能夠正確表達(dá)Ii、S1及Ii-2A-S1(m)融合蛋白；小鼠免疫試驗(yàn)證實(shí)Ii能夠增強(qiáng)S1蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，為防控PEDV提供了新的方法。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受實(shí)施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡(jiǎn)化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> Ii基因序列在豬流行性腹瀉病毒基因疫苗中的應(yīng)用

<160> 11

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 1

TATAGGATCCGCCACCATGGAGGACCAGCGCGA 33

<210> 2

<211> 47

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 2

GACGTCGCCGGCCAACTTGAGAAGGTCAAAGTTCAGGATGACTTGGC 47

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 3

GCAGATATCGGGCCCTGGGTTGGACTCGACGTCGCCGGCCAACTTGAG 48

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 4

ATAGATATCGCCACCATGGAGAGCCTCACA 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 5

AGTCTCGAGTCAGATGCTCATGGAAAAGTT 30

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 6

TATAGGATCCGCCACCATGGAGGACCAGCGCGA 33

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213>人工合成

<400>7

GCAGATATCTTACAGGATGACTTGGCCGAG 30

<210> 8

<211> 645

<212> DNA

<213> CDS

<400> 8

atggaggacc agcgcgacct catctccaac catgagcagc tgcccatgct gggccagcgc 60

cccggggccc ccgagagcaa gtgcagccgt ggagctctgt acacaggctt ttctgtcctg 120

gtggctctgc tcctggctgg ccaggccacc accgcctact tcctgtacca gcagcagggc 180

cggctggaca agctgacggt cacctctcag aacttgcagc tggagagcct gcggatgaag 240

cttcccaagc cctccaagcc tttgagcaag atgcgggttt ccgcccccat gctgatgcag 300

gccctgccca tggaaggccc ggagcctatg cgcaacgcca ccaagtacgg caacatgacc 360

caggaccacg tgatgcacct gctcctgaag tctgaccccc tgggagtgta cccgaagctg 420

aaggggagcc tcccagaaaa tctgaagcac ctcaagaaca ccatggacgg tgtgaactgg 480

aagctctttg agaactggct gcgtcagtgg ctcttgtttg aaatgagcaa gaactcgctg 540

gaggagacac cctttgaggt tccgccaaaa gacccactgg agacggagga cctgtcgtcc 600

gggctgggcg tgaccaagca ggatctcggc caagtcatcc tgtaa 645

<210> 9

<211> 702

<212> DNA

<213> CDS

<400> 9

atggaggacc agcgcgacct catctccaac catgagcagc tgcccatgct gggccagcgc 60

cccggggccc cggagagcaa gtgcagccgt ggagctctgt acacaggctt ttctgtcctg 120

gtggctctgc tcctggctgg ccaggccacc accgcctact tcctgtacca gcagcagggc 180

cggctggaca agctgacggt cacctctcag aacttgcagc tggagagcct gcggatgaag 240

cttcccaagc cctccaagcc tttgagcaag atgcgggttt ccgcccccat gctgatgcag 300

gccctgccca tggaaggccc ggagcctatg cgcaacgcca ccaagtacgg caacatgacc 360

caggaccacg tgatgcacct gctcctgaag tctgaccccc tgggagtgta cccgaagctg 420

aaggggagcc tcccagaaaa cctgaagcac ctcaagaaca ccatggacgg tgtgaactgg 480

aagctctttg agaactggct gcgtcagtgg ctcttgtttg aaatgagcaa gaactcgctg 540

gaggagacac cctttgaggt tccgccaaaa gacccactgg agacggagga cctgtcgtcc 600

gggctgggcg tgaccaagca ggatctcggc caagtcatcc tgaactttga ccttctcaag 660

ttggccggcg acgtcgagtc caacccaggg cccgaattct gc 702

<210> 10

<211> 2379

<212> DNA

<213> mat_peptide

<400>10

atggagagcc tcacatactt ctggctcctg ctgcccgtgc tcagcacact cagcctgcca 60

caggatgtca cacgctgctc cgccaagacc aatttccgcc ggttcttcag caagtttaac 120

gtccaagctc ccgccgtggt ggtcctgggg ggctacctgc caatcgggga gaaccagggc 180

gtgaatagca cctggtactg cgccggacaa caccctaccg ccagcggggt ccatgggatt 240

ttcgtcagcc acattcgcgg aggccacggg ttcgaaatcg gcatcagcca ggagcctttc 300

gacccctccg ggtatcagct ctatctccac aaagccacaa acgggaacac caacgccacc 360

gcccggctgc gcatctgcca gttccccagc atcaagaccc tggggcccac agccaataac 420

gacgtgacca ccgggcgcaa ttgtctcttc aacaaggcca tcccagccca catgtccgag 480

cattccgtcg tggggatcac atgggacaat gaccgggtga ccgtgttcag cgataaaatc 540

tattatttca atttcaaaaa tgactggagc cgcgtcgcca ccaaatgcta caattccggc 600

gggtgcgcta tgcaatatgt gtatgagcct acctattaca tgctgaatgt gaccagcgcc 660

ggggaggacg ggatctccta ccagccctgc acagctaatt gcattgggta cgccgccaat 720

gtgtttgcca ccgaacccaa cggacacatc cccgaggggt tttccttcaa taactggttc 780

ctgctctcca acgacagcac cctcgtgcat ggcaaggtgg tgtccaatca acccctgctg 840

gtgaactgcc tcctcgctat tcctaagatt tatggactcg gccaattttt ctcctttaac 900

caaaccattg atggggtctg caatggcgcc gctgtccaac gcgctcccga ggccctgcgg 960

ttcaacatta acgataccag cgtgatcctc gccgagggct ccatcgtgct ccacacagct 1020

ctgggcacaa atttcagctt cgtctgctcc aactccagcg acccccatct cgctacattt 1080

gctatccccc tgggcgctat ccaggtcccc tactactgtt ttctcaaggt cgacacctac 1140

aatagcaccg tgtacaagtt tctggccgtc ctgcccccta cagtgcgcga gatcgtcatt 1200

accaagtacg gcgacgtgta tgtcaacgga ttcgggtacc tccacctcgg gctgctcgac 1260

gccgtgacaa ttaactttac cgggcacggc acagacgacg acgtctccgg cttttggaca 1320

atcgctagca caaacttcgt ggacgctctc atcgaattcc aaggaaccgc catccagcgc 1380

atcctctact gcgacgaccc tgtgagccaa ctgaagtgct cccaggtcag ctttgatctg 1440

gacgacggct tctaccctat cagcagcacc aacctgctgt cccacgagca acccacctcc 1500

tttgtgaccc tgcccagctt caacgaccac tccttcgtga acattacagt gagcgctgcc 1560

ttcggcggac atagcggggc caacctcatc gcctccgaca caaccatcaa cgggtttagc 1620

agcttttgcg tcgatacacg ccagtttacc atctccctct tctataatgt caccaatagc 1680

tacgggtacg tgagcaattc ccaggattcc aattgcccct tcacactcca gagcgtgaac 1740

gactacctga gcttctccaa gttctgcgtc agcacctccc tgctcgcttc cgcctgcacc 1800

atcgacctct ttggctaccc cgagttcggc agcggagtca aatttacaag cctgtacttt 1860

cagttcatta agggcgaact catcaccggc accccaaaac cactcgaagg cgtgaccgat 1920

gtgagcttta tgacactcga tgtctgtaca aagtatacaa tctatggctt caaaggggaa 1980

ggcattatta ccctgattaa ttccagcttt ctcgctgggg tgtactacac aagcgatagc 2040

ggccagctgc tggccttcaa gaacgtcaca tccggggctg tgtactccgt caccccctgt 2100

tccttttccg aacaagccgc ctacgtggat gacgacatcg tcggcgtgat ttccagcctc 2160

agcaacagca catttaactc cacccgcgag ctgcctgggt tcttttacca cagcaatgac 2220

ggaagcaact gcaccgagcc tgtgctggtc tactccaaca tcggggtgtg caagagcggc 2280

agcatcggct atgtgccctc ccaaagcggg caggtgaaga tcgccccaac agtcacagga 2340

aacatctcca tccctaccaa cttttccatg agcatctga 2379

<210> 11

<211> 3093

<220>

<221>CDS

<222>（1）...（702）

<220>

<221>mat_peptide

<222>（715）...（3093）

<400>11

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gtggctctgc tcctggctgg ccaggccacc accgcctact tcctgtacca gcagcagggc 180

cggctggaca agctgacggt cacctctcag aacttgcagc tggagagcct gcggatgaag 240

cttcccaagc cctccaagcc tttgagcaag atgcgggttt ccgcccccat gctgatgcag 300

gccctgccca tggaaggccc ggagcctatg cgcaacgcca ccaagtacgg caacatgacc 360

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aagctctttg agaactggct gcgtcagtgg ctcttgtttg aaatgagcaa gaactcgctg 540

gaggagacac cctttgaggt tccgccaaaa gacccactgg agacggagga cctgtcgtcc 600

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ttcaatttca aaaatgactg gagccgcgtc gccaccaaat gctacaattc cggcgggtgc 1320

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attgatgggg tctgcaatgg cgccgctgtc caacgcgctc ccgaggccct gcggttcaac 1680

attaacgata ccagcgtgat cctcgccgag ggctccatcg tgctccacac agctctgggc 1740

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accgtgtaca agtttctggc cgtcctgccc cctacagtgc gcgagatcgt cattaccaag 1920

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agcacaaact tcgtggacgc tctcatcgaa ttccaaggaa ccgccatcca gcgcatcctc 2100

tactgcgacg accctgtgag ccaactgaag tgctcccagg tcagctttga tctggacgac 2160

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