本發(fā)明涉及制備疫苗的技術領域，特別是涉及一種在制備獸用凍干布氏菌病活疫苗過程中的濃縮工藝及該獸用凍干布氏菌病活疫苗的制備工藝。
背景技術：
布病即布魯氏菌病(brucellosis)，又稱地中海弛張熱，馬耳他熱，波浪熱或波狀熱，是由布魯氏菌引起的人畜共患性全身傳染病。該病呈慢性經(jīng)過,一年四季均有發(fā)病,一般以4-8月發(fā)病居多。發(fā)熱、多汗、乏力、關節(jié)痛是布病患者最常見的四大癥狀，發(fā)熱以不規(guī)則熱為主，關節(jié)痛表現(xiàn)為典型的多發(fā)性和游走性，以膝關節(jié)、腰關節(jié)、肩關節(jié)為主；臨診主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、睪丸炎、腱鞘炎和關節(jié)炎。我國動物防疫法中將布魯氏菌病定為二類傳染病。
隨著畜牧業(yè)快速發(fā)展,奶牛、羊、豬存欄量呈大幅增長。通過對流產(chǎn)牛、羊進行布病監(jiān)測發(fā)現(xiàn),近幾年布病陽性率呈上升的趨勢。據(jù)人類布病監(jiān)測發(fā)現(xiàn),近幾年人的布病陽性率也呈上升趨勢,尤其是牛、羊飼養(yǎng)人員和皮毛加工人員。這不但給畜牧業(yè)造成一定的損失,更為嚴重的是給人們的身體健康構成威脅。動物布病是人類布病的主要傳染源，因此生產(chǎn)高質(zhì)量的布氏菌病活疫苗、加強免疫是是我國控制與消滅布病的重要途徑。
目前獸用布氏菌病活疫苗的制備過程依次為培養(yǎng)菌種——發(fā)酵得到菌液——菌液濃縮——配苗——分裝——凍干——包裝。其中菌液濃縮過程是使用羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)沉降發(fā)酵后得到的布魯氏菌菌液，沉降時間一般為48-72h，沉降后棄掉上清，便得到濃縮菌液。然后在濃縮菌液中添加一定量的凍干保護劑完成配苗，分裝后經(jīng)冷凍真空干燥制成布氏菌病活疫苗。然而，采用羧甲基纖維素鈉沉降濃縮菌液，沉降時間長，濃縮倍數(shù)相對固定，菌體死亡率高，導致濃縮后菌數(shù)偏低，這樣就需要進行二次、三次、甚至更多次地沉降濃縮，而無法通過根據(jù)發(fā)酵后活菌數(shù)和使用要求靈活調(diào)整濃縮倍數(shù)解決，多次濃縮的操作又會增加污染的風險。
申請?zhí)枮?01210112283.X的專利申請中公開了一種口蹄疫疫苗濃縮純化方法；申請?zhí)枮?00610129404.6的專利申請中公開了一種雞ND-IB-AI-EDS四聯(lián)油乳劑滅活疫苗抗原濃縮技術。以上兩種濃縮技術均是用來濃縮抗原(是病毒)，而非疫苗(是細菌)，兩者在粒徑上差別很大，無法轉用，且用此濃縮技術對細菌進行高倍的濃縮時，無法得到活菌濃度數(shù)量合格的疫苗。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中存在的技術缺陷，第一方面，提供一種濃縮倍數(shù)可控、菌體存活率高的獸用凍干布氏菌病活疫苗的濃縮工藝，用中空纖維超濾系統(tǒng)濃縮發(fā)酵完成的菌液，所述中空纖維超濾系統(tǒng)中包含若干支中空纖維柱，其中中空纖維的孔徑大于750KD，超濾溫度為2～8℃，超濾時間不超過6.0h，濃縮倍數(shù)不小于5倍(尤其是濃縮5-15倍時，濃縮后得到的濃縮菌液中活菌損失率不超過4.0％；其中濃縮5倍時，濃縮后得到的濃縮菌液中活菌損失率不超過2.0％；濃縮10倍時，濃縮后得到的濃縮菌液中活菌損失率不超過3.6％；濃縮15倍時，濃縮后得到的濃縮菌液中活菌損失率不超過4.0％)。
所述中空纖維的孔徑為0.1μm，中空纖維柱的整體膜面積不小于10m2，超濾時間不超過3.0h。
所述中空纖維柱的膜面積為2.5-5m2/支，濃縮倍數(shù)達到20倍以上(具體可為20-25倍)，濃縮后得到的濃縮菌液中活菌損失率不超過4.5％。
所述中空纖維柱為2-4支(優(yōu)選3支)，膜面積為4.4m2/支，所述濃縮菌液中活菌數(shù)為(2-10)×1011CFU/mL。
具體為：先用生理鹽水沖洗中空纖維超濾系統(tǒng)至中性，再將發(fā)酵完成的菌液注入中空纖維超濾系統(tǒng)中進行濃縮，濃縮至所需的體積，即得到濃縮菌液。
第二方面，本發(fā)明提供一種獸用凍干布氏菌病活疫苗的制備工藝，包括培養(yǎng)菌種、發(fā)酵、濃縮、配苗、凍干，所述濃縮為上述濃縮工藝。
具體包括以下步驟：
一、培養(yǎng)菌種
(1)、開菌種靜止培養(yǎng)
取菌種，用1wt％無菌蛋白胨水溶解后接種于大管胰蛋白胨大豆瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37℃恒溫靜止貼壁培養(yǎng)72～120h；所述1wt％無菌蛋白胨水優(yōu)選由1g蛋白胨、0.5g氯化鈉加入100g水中溶解后滅菌所得；
(2)、菌種擴繁
培養(yǎng)完畢后，用1wt％無菌蛋白胨水洗下大管胰蛋白胨大豆瓊脂斜面培養(yǎng)基上的菌苔得到菌懸液，轉移至扁瓶胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上進行擴增繁殖，37℃恒溫靜止貼壁培養(yǎng)72～120h(優(yōu)選31～36h)，擴繁至活菌濃度≥4×109CFU/ml，菌懸液不少于300mL時結束擴繁；
二、發(fā)酵
1)、50L種子罐通氣培養(yǎng)
用1wt％無菌蛋白胨水洗下扁瓶胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上的菌苔，轉移至盛放有500mL液體培養(yǎng)液的轉移瓶內(nèi)，混勻得到菌種液，再將轉移瓶內(nèi)的菌種液接種至50L種子罐內(nèi)，設定細菌發(fā)酵溫度：37±0.5℃，pH：7.20±0.1，溶氧：60％-80％，轉速：100-350rpm，發(fā)酵時長為36-55h，得到初步菌種液；
2)、1500L發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)
將步驟1)得到的初步菌種液加入800～900L的液體培養(yǎng)液中，混合均勻后在1500L發(fā)酵罐中通氣培養(yǎng)，設定細菌發(fā)酵溫度：37±0.5℃，pH：7.20±0.1，溶氧：60％-80％，轉速：100-350rpm，發(fā)酵時長為36-55h，得到菌液；
三、濃縮
將步驟2)中得到的菌液注入中空纖維超濾系統(tǒng)中濃縮至所需的體積，所述中空纖維超濾系統(tǒng)中有2-4支中空纖維柱，膜面積為2.5-5m2/支，中空纖維的孔徑為300KD-700KD或0.1μm；超濾溫度為2～8℃，超濾時間不超過3h，即得到濃縮菌液；最好先用生理鹽水沖洗中空纖維超濾系統(tǒng)至中性，再將發(fā)酵完成的菌液注入中空纖維超濾系統(tǒng)；
四、凍干
向步驟三得到的濃縮菌液中加入凍干保護劑，定量分裝后迅速進行冷凍真空干燥，得到所述獸用凍干布氏菌病活疫苗。
所述獸用凍干布氏菌病活疫苗中活菌數(shù)為(1.2-1.6)×1010CFU/mL，活菌損失率不超過4.5％。
第三方面，本發(fā)明提供一種獸用凍干布氏菌病活疫苗，制備所述獸用凍干布氏菌病活疫時經(jīng)上述濃縮工藝對發(fā)酵后的菌液進行濃縮；或是由上述制備工藝得到的。
本發(fā)明通過考察中空纖維柱的孔徑和膜面積等多項參數(shù)對活菌回收率的影響后，篩選出了一種中空纖維超濾系統(tǒng)對細菌進行濃縮，使用本發(fā)明中空纖維超濾系統(tǒng)濃縮發(fā)酵后得到的菌液，可根據(jù)發(fā)酵后活菌數(shù)和使用要求靈活調(diào)整濃縮倍數(shù)，濃縮時間短，菌體死亡率低，回收率高，可實現(xiàn)高質(zhì)量、定量配制布氏菌病活疫苗。采用本發(fā)明濃縮工藝制備獸用凍干布氏菌病活疫苗，培養(yǎng)體積可達1500L，濃縮后的活菌數(shù)可達(2～10)×1011CFU/mL。該制備工藝中可根據(jù)發(fā)酵后菌液的活菌數(shù)和使用要求進行不同倍數(shù)的濃縮，縮短生產(chǎn)周期、減少菌體死亡數(shù)量，回收率高，實現(xiàn)定量配制，提升產(chǎn)品質(zhì)量，滿足市場個性化需求。
具體實施方式
本發(fā)明提出的獸用凍干布氏菌病活疫苗的制備工藝，包括培養(yǎng)菌種——發(fā)酵得到菌液——菌液濃縮——配苗——分裝——凍干——包裝等步驟；具體操作為：
1、培養(yǎng)菌種
(1)、開菌種靜止培養(yǎng)
從超低溫冰箱中取出一支菌種，核對菌種信息，檢查菌種的完好性，用1wt％無菌蛋白胨水(由購買的蛋白胨配制、滅菌所得，250g/瓶，總氮≥14.5％，氨基氮≥2.5％，購自北京奧博星生物技術有限公司)溶解后接種于大管胰蛋白胨大豆瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37℃溫箱靜止貼壁培養(yǎng)72～120h。1wt％無菌蛋白胨水由1g蛋白胨、0.5g氯化鈉加入100g水中溶解后滅菌所得。
(2)、菌種擴繁
培養(yǎng)完畢后，用1-2mL 1wt％無菌蛋白胨水洗下大管胰蛋白胨大豆瓊脂斜面培養(yǎng)基上的菌苔得到菌懸液，轉移至扁瓶胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上進行擴增繁殖，37℃溫箱靜止貼壁培養(yǎng)72～120h(優(yōu)選31～36h)，擴繁至活菌濃度≥40億CFU/ml，菌懸液不少于300mL時結束擴繁。
2、發(fā)酵
1)、50L種子罐通氣培養(yǎng)
用1wt％無菌蛋白胨水洗下扁瓶胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上的菌苔，轉移至盛放有500mL液體培養(yǎng)液(液體培養(yǎng)液由購買的胰蛋白胨大豆肉湯配制、滅菌所得，每升含胰化酪蛋白17g、大豆消化湯3g、葡萄糖2.5g、鈉鹽5g、鉀鹽2.5g)的轉移瓶內(nèi)，混勻得到菌種液，進行取樣、活菌計數(shù)、純粹檢驗；若活菌數(shù)≥4×109CFU/ml且無雜菌，再將轉移瓶內(nèi)的菌種液接種至50L種子罐內(nèi)，種子罐的培養(yǎng)體積為30L，設定細菌發(fā)酵溫度：37±0.5℃，pH：7.20±0.1，DO(dissolved oxygen，即溶氧)：60％-80％，轉速：100-350rpm，轉速隨著培養(yǎng)時間、培養(yǎng)體積、攪拌方式、通氣量大小的不同而不同；一般隨著發(fā)酵時間的延長逐漸增大通氣量；根據(jù)種子罐不同接種菌數(shù)和不同菌株的發(fā)酵時間，發(fā)酵時長為36-55h，得到初步菌種液。
2)、1500L發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)
將步驟1)得到的初步菌種液加入800～900L的液體培養(yǎng)液中，混合均勻后在1500L發(fā)酵罐中通氣培養(yǎng)，設定細菌發(fā)酵溫度：37±0.5℃，pH：7.20±0.1，DO(dissolvedoxygen，即溶氧)：60％-80％，轉速：100-350rpm，轉速隨著培養(yǎng)時間、培養(yǎng)體積、攪拌方式、通氣量大小的不同而不同；一般隨著發(fā)酵時間的延長逐漸增大通氣量；根據(jù)種子罐不同接種菌數(shù)和不同菌株的發(fā)酵時間，發(fā)酵時長為36-55h，得到菌液。
3、濃縮
當菌液的活菌濃度≥2×1010CFU/ml，且純粹檢驗結果無雜菌生長后，將步驟2發(fā)酵過程2)中得到的菌液采取中空纖維超濾系統(tǒng)進行菌液的濃縮：
用0.9％生理鹽水沖洗中空纖維超濾系統(tǒng)至中性，將發(fā)酵罐的出口與中空纖維超濾系統(tǒng)的進口連接，中空纖維超濾系統(tǒng)的透過液出口與透過液儲液罐進口連接，根據(jù)發(fā)酵活菌數(shù)與使用要求濃縮至最終所需的體積，得到濃縮菌液。
待濃縮菌液的體積為500L-1000L時，所用中空纖維超濾系統(tǒng)中中空纖維的孔徑為300-700KD或0.1μm，2-4支中空纖維柱，總膜面積不小于10m2；優(yōu)選3支中空纖維柱，膜面積為4.4m2/支。超濾的溫度為2～8℃，超濾時間不超過3h。
4、凍干
在濃縮菌液中加凍干保護劑(如明膠蔗糖保護劑)，定量分裝。分裝后迅速進行冷凍真空干燥。
凍干過程如下：
產(chǎn)品預凍階段：-20℃入箱，1h將制品降至-36℃并維持3.5h。
升華干燥階段：3.5h將制品從-36℃升至2℃并維持3.5h。
解吸干燥階段：7.5h將制品從2℃升至32℃并維持9h，凍干結束，得到獸用凍干布氏菌病活疫苗。
以下結合具體實施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容，并對本發(fā)明作進一步闡述，但這些實施例絕非對本發(fā)明進行限制。
按照上述獸用凍干布氏菌病活疫苗的制備工藝，制備得到一系列的獸用凍干布氏菌病活疫苗，其中步驟2發(fā)酵中，過程1)結束后，取樣進行活菌計數(shù)、純粹檢驗。停止通氣后給種子罐降溫至2-8℃保存?zhèn)溆谩z測結果見表1。
表1 50L種子罐活菌計數(shù)(S2株)
過程2)結束后，取樣進行活菌計數(shù)、純粹檢驗。檢測結果見表2。
表2 1500L發(fā)酵罐活菌計數(shù)(S2株)
表1和表2的結果表明發(fā)酵后得到的菌液符合要求，可用于下一步濃縮工藝。
用本發(fā)明步驟3的濃縮工藝處理步驟2中過程2)得到的菌液，僅是調(diào)整步驟3中的工藝參數(shù)，具體見表3。其中，實施例1-6為本發(fā)明步驟3的濃縮工藝，比較例1-4為不在本發(fā)明的工藝參數(shù)范圍內(nèi)，但過程同本發(fā)明；比較例5(表3中未示出)為現(xiàn)有CMC-Na沉降法濃縮工藝，濃縮前體積為800L，濃縮溫度為2～8℃。
表3步驟3的工藝參數(shù)
由表3的數(shù)據(jù)可知，比較例3和4在同樣選擇了孔徑為0.1μm的中空纖維柱后，在膜面積小于10的情況下，濃縮用時較長；比較例1和2的孔徑更小，濃縮耗時更長，可能導致濃縮后活菌數(shù)少。
實驗一：
對實施例1-6和比較例5處理過的濃縮菌液取樣，并進行活菌計數(shù)，純粹檢驗，將得到的濃縮菌液降溫至2-8℃保存?zhèn)溆?，以實施?為例，檢測結果見表4-表5。
表4實施例1和比較例5的濃縮結果
從表4的結果可以看出采用兩種不同的濃縮方法濃縮同樣的倍數(shù)，比較例5濃縮前后活菌的損失率很高，不低于10％，而本發(fā)明實施例1的活菌損失率則不高于4.5％。
表5比較例1-2的濃縮結果
從表5的結果可以看出比較例1、比較例2濃縮前后的活菌損失率也很高，活菌損失率都在8％以上，按照濃縮相同倍數(shù)比較，比較例1、比較例2的活菌損失率顯著高于本發(fā)明實施例1；并且比較例1、比較例2不能實現(xiàn)20倍及以上濃縮。將表4和表5的活菌損失率數(shù)據(jù)進行總結，并統(tǒng)計以上方法的濃縮用時，結果見表6。
表6對表4和表5數(shù)據(jù)的總結結果
本發(fā)明的濃縮工藝得到的濃縮菌液比現(xiàn)有CMC-Na沉降法得到的濃縮菌液的菌株存活率更高，濃縮后活菌的回收率能夠達到95％以上，而CMC-Na沉降法濃縮后活菌的回收率還不到77％，且濃縮用時是本發(fā)明的近30倍。比較例1、比較例2由于中空纖維柱膜孔徑相對實施例1小，濃縮用時也較實施例1長，且對于20倍及以上倍數(shù)的濃縮中空纖維柱會發(fā)生堵塞，無法實現(xiàn)高倍濃縮。
其它實施例也有類似效果，不再一一贅述。
實驗二：
將實驗一得到的實施例1-6的濃縮菌液和比較例1-5的濃縮菌液進行步驟4，得到獸用凍干布氏菌病活疫苗，并對其進行成品檢驗。
對成品苗進行以下項目的檢測：物理性狀、純粹檢驗、變異檢驗、活菌計數(shù)、安全檢驗、剩余水分測定、真空度測定。相關檢測方法及標準符合《中華人民共和國獸藥典2005版第三部》之規(guī)定，以實施例1為例，檢測結果見表7，比較例的檢測結果見表8。
a)物理性狀：微黃色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。
b)純粹檢驗：每批抽樣10瓶，每瓶檢驗應純粹。
c)變異檢驗：取樣，將疫苗適當稀釋后接種胰蛋白大豆瓊脂平板，在37℃培養(yǎng)至少72小時，用布氏菌菌落結晶紫染色法檢查，粗糙型菌落應不超過5.0％。
d)活菌計數(shù)：將3瓶樣品按瓶簽注明頭份分別用蛋白胨水稀釋，每一樣品吸取最終稀釋度的菌液接種胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基平板5個，分別活菌計數(shù)，每頭份含活菌數(shù)應不少于1.10×1010CFU(以布魯氏菌S2株為例)。
e)安全檢驗：將疫苗稀釋成每1ml含活菌10億，皮下注射體重18～20g的小白鼠5只，每只0.25ml，6日內(nèi)應全部健活。
f)剩余水分測定：用真空烘干法對樣品進行剩余水分測定，各樣品剩余水分均應不超過4.0％
g)真空度測定：用高頻火花真空測定器進行密封后容器內(nèi)的真空度測定，應出現(xiàn)白色、粉色或紫色輝光。
表7實施例1的成品疫苗檢測結果
表8比較例的成品疫苗檢測結果
綜合表7和表8的結果來看，全自動發(fā)酵收獲的布魯氏菌菌液，采取本發(fā)明中空纖維超濾系統(tǒng)進行不同倍數(shù)濃縮，可以降低活菌損失率，縮短生產(chǎn)周期，實現(xiàn)定量配制，提升產(chǎn)品質(zhì)量等方面都起到非常重要的作用。尤其是當今市場逐漸根據(jù)實際動物量定制所需要頭份的疫苗，如某農(nóng)場需要25頭份的疫苗，或者12頭份的疫苗，用現(xiàn)有方法就無法實現(xiàn)，現(xiàn)有方法只能實現(xiàn)15倍以下的濃縮，即只能生產(chǎn)15頭份以下的疫苗，且疫苗產(chǎn)品只能是5頭份、10頭份、15頭份固定規(guī)格的，而用本發(fā)明方法既可以生產(chǎn)多頭份的疫苗(20倍及以上)，又可以按照客戶需要生產(chǎn)特定頭份的疫苗。
其它實施例也有類似效果，不再一一贅述。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出的是，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的內(nèi)容。