本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬瘟活疫苗用稀釋液。
背景技術(shù)：
豬瘟是由豬瘟病毒 (Classical swine fever virus，CSFV) 引起的一種高度接觸性傳染病，以出血和發(fā)熱為主要特征，可呈急性或慢性，是一種對豬危害性極大的傳染病。不同年齡、性別和品種的豬均能感染該病，死亡率高達80-90％。豬瘟被世界動物衛(wèi)生組織劃分為A類疾病，我國將其劃分為一類疾病，目前，疫苗接種是世界許多國家和地區(qū)控制豬瘟的重要手段。
豬瘟活疫苗在使用時需要用疫苗稀釋劑進行稀釋，目前通常選用注射用水或生理鹽水，但這樣稀釋出的疫苗，免疫效價整齊度不高，不同批次疫苗間的差異較大，且接種發(fā)病豬后存在應(yīng)激反應(yīng)和過敏反應(yīng)，大大降低了豬瘟活疫苗的免疫效果。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種豬瘟活疫苗用稀釋液，該稀釋液可有效減少不同批次疫苗間的差異，提高疫苗抗體效價整齊度，減少接種發(fā)病豬的應(yīng)激反應(yīng)和過敏反應(yīng)。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明每1000ml pH=7的磷酸鹽緩沖液中包含：姬松茸多糖：5-10g、穿心蓮提取物：1-5g、人參皂苷Rh2：0.1-2g和姜黃素：2-6g。
進一步的，本發(fā)明中每1000ml pH=7的磷酸鹽緩沖液中包含：姬松茸多糖：5-8g、穿心蓮提取物：2-4g、人參皂苷Rh2：0.5-1.5g和姜黃素：3-5g。
進一步的，本發(fā)明中每1000ml PH=7的磷酸鹽緩沖液中包含：姬松茸多糖：6g、穿心蓮提取物：3g、人參皂苷Rh2：1g和姜黃素：4g。
其中，本發(fā)明所述姬松茸多糖的制備包括以下步驟：
（1）粉碎姬松茸，得姬松茸粉末，按料液比：1:70-90g/ml向姬松茸粉末中加入蒸餾水并調(diào)節(jié)pH至7.0；
（2）微波提?。涸O(shè)定微波功率為500-700W，提取8-12min，收集提取液；
（3）重復(fù)步驟（2），收集提取液；
（4）將步驟（2）和（3）中所得濾液混合，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1/4體積，加入80%的乙醇，于4 ℃靜置12 h，離心收集沉淀；
（5）步驟（4）中所得沉淀依次經(jīng)無水乙醇和丙酮洗滌后，真空干燥，即可得姬松茸多糖。
其中，本發(fā)明所述穿心蓮提取物的制備包括以下步驟：向稱取穿心蓮粗粉中加入8-12體積的70%-80%乙醇，以600-800W的功率超聲提取50-70min，過濾，減壓除去溶劑后，置于60℃下減壓干燥至恒重，即可得穿心蓮粗提取物。
其中，本發(fā)明所述pH=7的磷酸鹽緩沖液的制備方法如下：
a．稱取下列原料組分：氯化鈉6-10g、氯化鉀0.05-0.5g、磷酸氫二鈉1-1.2g、磷酸二氫鉀0.05-0.5g、氯化鈣0.05-0.2g和六水氯化鎂0.05-0.2g，混合均勻備用；
b．向步驟a中所得原料組分的混合物中加入1000ml的雙蒸水，充分溶解后，在116℃條件下高壓滅菌30min，即得pH=7的磷酸鹽緩沖液。
進一步的，所述步驟（2）中的微波提取過程為間歇式微波提取，即提取2min后暫停1min，同時補加損失的水分使提取液體積保持相對恒定。
本發(fā)明中人參皂苷Rh2和姜黃素由百靈威科技有限公司生產(chǎn)銷售。
本發(fā)明的有益效果：
中藥免疫增強劑主要為補益類藥物，可以通過激活一種或多種免疫活性細胞，增強機體的免疫功能，使低下的免疫功能上調(diào)至正常水平。還可以作為輔助藥物與一些疫苗合用，增強免疫應(yīng)答，提高免疫效應(yīng)。本發(fā)明所提供的稀釋液中添加有姬松茸多糖、穿心蓮提取物、人參皂苷Rh2和姜黃素，均為中藥免疫增強劑，通過各組分科學合理的配比，可有效激活機體免疫活性細胞，增強免疫性能。本發(fā)明不僅可以降低疫苗批間差異性，提高整體免疫水平，還可以提高疫苗的免疫效果，延長疫苗保護期。此外，本發(fā)明易生產(chǎn)，成本低廉，且使用方便。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步具體說明。本發(fā)明中所述實施例僅用于說明解釋本發(fā)明而不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。
實施例1:
1、制備姬松茸多糖，包括以下步驟：
（1）粉碎姬松茸，得姬松茸粉末，按料液比：1:70g/ml向姬松茸粉末中加入蒸餾水并調(diào)節(jié)PH至7.0；
（2）微波提?。涸O(shè)定微波功率為500W，提取8min，收集提取液，該微波提取過程為間歇式微波提取，即提取2min后暫停1min，同時補加損失的水分使提取液體積保持相對恒定；
（3）重復(fù)步驟（2），收集提取液；
（4）將步驟（2）和（3）中所得濾液混合，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1/4體積，加入80%的乙醇，于4 ℃靜置12 h，離心收集沉淀；
（5）步驟（4）中所得沉淀依次經(jīng)無水乙醇和丙酮洗滌后，真空干燥，即可得姬松茸多糖。
2、制備穿心蓮提取物，包括以下步驟：
向稱取穿心蓮粗粉中加入8體積的80%乙醇，以600的功率超聲提取50min，過濾，減壓除去溶劑后，置于60℃下減壓干燥至恒重，即可得穿心蓮粗提取物。
3、配制pH=7的磷酸鹽緩沖液：
a．稱取下列原料組分：氯化鈉6g、氯化鉀0.05g、磷酸氫二鈉1g、磷酸二氫鉀0.05g、氯化鈣0.05g和六水氯化鎂0.05g，混合均勻備用；
b．向步驟a中所得原料組分的混合物中加入1000ml的雙蒸水，充分溶解后，在116℃條件下高壓滅菌30min，即得pH=7的磷酸鹽緩沖液。
4、制備稀釋液
A．稱取原料組分：姬松茸多糖：5g、穿心蓮提取物：1g、人參皂苷Rh2：0.1g和姜黃素：2g。
B．將步驟A中所稱取的原料組分依次加入1000ml pH=7的磷酸鹽緩沖液中，振蕩水化，過濾除菌，即得豬瘟活疫苗用稀釋液。
實施例2：
1、制備姬松茸多糖，包括以下步驟：
（1）粉碎姬松茸，得姬松茸粉末，按料液比：1:80g/ml向姬松茸粉末中加入蒸餾水調(diào)節(jié)PH至7.0；
（2）微波提?。涸O(shè)定微波功率為700W，提取10min，收集提取液，該微波提取過程為間歇式微波提取，即提取2min后暫停1min，同時補加損失的水分使提取液體積保持相對恒定；
（3）重復(fù)步驟（2），收集提取液；
（4）將步驟（2）和（3）中所得濾液混合，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1/4體積，加入80%的乙醇，于4 ℃靜置12 h，離心收集沉淀；
（5）步驟（4）中所得沉淀依次經(jīng)無水乙醇和丙酮洗滌后，真空干燥，即可得姬松茸多糖。
2、制備穿心蓮提取物，包括以下步驟：
向稱取穿心蓮粗粉中加入12體積的70%乙醇，以800W的功率超聲提取70min，過濾，減壓除去溶劑后，置于60℃下減壓干燥至恒重，即可得穿心蓮粗提取物。
3、配制pH=7的磷酸鹽緩沖液：
a．稱取下列原料組分：氯化鈉10g、氯化鉀0.5g、磷酸氫二鈉1.2g、磷酸二氫鉀0.5g、氯化鈣0.2g和六水氯化鎂0.2g，混合均勻備用；
b．向步驟a中所得原料組分的混合物中加入1000ml的雙蒸水，充分溶解后，在116℃條件下高壓滅菌30min，即得pH=7的磷酸鹽緩沖液。
4、制備稀釋液
A．稱取原料組分：姬松茸多糖：10g、穿心蓮提取物：5g、人參皂苷Rh2：2g和姜黃素：6g。
B．將步驟A中所稱取的原料組分依次加入1000ml pH=7的磷酸鹽緩沖液中，振蕩水化，過濾除菌，即得豬瘟活疫苗用稀釋液。
實施例3：
1、制備姬松茸多糖，包括以下步驟：
（1）粉碎姬松茸，得姬松茸粉末，按料液比1:90g/ml向姬松茸粉末中加入蒸餾水并調(diào)節(jié)PH至7.0；
（2）微波提取：設(shè)定微波功率為600W，提取12min，收集提取液，該微波提取過程為間歇式微波提取，即提取2min后暫停1min，同時補加損失的水分使提取液體積保持相對恒定；
（3）重復(fù)步驟（2），收集提取液；
（4）將步驟（2）和（3）中所得濾液混合，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1/4體積，加入80%的乙醇，于4 ℃靜置12 h，離心收集沉淀；
（5）步驟（4）中所得沉淀依次經(jīng)無水乙醇和丙酮洗滌后，真空干燥，即可得姬松茸多糖。
2、制備穿心蓮提取物，包括以下步驟：
向稱取穿心蓮粗粉中加入8-12體積的75%乙醇，以700W的功率超聲提取60min，過濾，減壓除去溶劑后，置于60℃下減壓干燥至恒重，即可得穿心蓮粗提取物。
3、配制pH=7的磷酸鹽緩沖液：
a．稱取下列原料組分：氯化鈉8g、氯化鉀0.35g、磷酸氫二鈉1.1g、磷酸二氫鉀0.25g、氯化鈣0.12g和六水氯化鎂0.15g，混合均勻備用；
b．向步驟a中所得原料組分的混合物中加入1000ml的雙蒸水，充分溶解后，在116℃條件下高壓滅菌30min，即得pH=7的磷酸鹽緩沖液。
4、制備稀釋液
A．稱取原料組分：姬松茸多糖：69g、穿心蓮提取物：3g、人參皂苷Rh2：1g和姜黃素：4g。
B．將步驟A中所稱取的原料組分依次加入1000ml pH=7的磷酸鹽緩沖液中，振蕩水化，過濾除菌，即得豬瘟活疫苗用稀釋液。
免疫效果對比試驗：
利用本發(fā)明實施例1至3所制備的3種不同批次（a、b、c）的豬瘟活疫苗用稀釋液分別將豬瘟活疫苗稀釋至1頭份/ml，備用。利用PH=7的磷酸鹽緩沖液將豬瘟活疫苗稀釋至1頭份/ml，備用。將50頭28日齡健康斷奶仔豬分為五組，每組10頭，A組注射實施例1制得的稀釋液稀釋后的豬瘟活疫苗1.0ml/頭；B組注射實施例2制得的稀釋液稀釋后的豬瘟活疫苗1.0ml/頭；C組注射實施例3制得的稀釋液稀釋后的豬瘟活疫苗1.0ml/頭；D組注射用pH=7的磷酸鹽緩沖液稀釋后的豬瘟活疫苗1.0ml/頭；E組作為空白對照組，注射pH=7的磷酸鹽緩沖液1.0ml/頭。各組均在免疫后的第7、14和21d進行前腔靜脈采血抗凝，采用MTT法測定脾臟淋巴細胞轉(zhuǎn)化及增殖試驗，試驗結(jié)果如表1所示。各組均在免疫后7d、14d、21d、28d、35d采血并分離血清，用ELISA方法進行測定，測定結(jié)果如表2所示。
由表1和表2可以看出，本發(fā)明所制備的豬瘟活疫苗用稀釋液不僅可以提高淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，還可以降低疫苗批次間的差異性，提高整體免疫水平，提高豬瘟活疫苗的免疫效果。
需說明的是，本發(fā)明中所用芍藥苷購買于百靈威科技有限公司，人參皂苷Rh2和姜黃素均購于百靈威科技有限公司。本發(fā)明中未提及的具體實驗方法，按常規(guī)實驗方法進行。
表1 脾臟淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果
表2 28日齡健康斷奶仔豬免疫試驗結(jié)果