技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種載甲氨蝶呤的腫瘤深度滲透多級靶向透明質(zhì)酸納米粒聚合物及其制備。

背景技術(shù)：
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聚酰胺-胺(polyamidoyamine，pamam)樹狀聚合物是一種新型高度分支的功能性材料，因其具有小粒徑、末端官能團可修飾、水溶性好、具有高度幾何對稱性及較大的內(nèi)部疏水空腔等優(yōu)勢，目前已經(jīng)在材料、分析化學、生物和醫(yī)學等諸多領(lǐng)域引起關(guān)注。尤其在醫(yī)藥領(lǐng)域，由于pamam在生理環(huán)境下荷正電，易與帶負電的腫瘤細胞膜相結(jié)合，因此具備良好的入胞能力，同時由于其pamam粒徑為5～10nm，有利于跨過腫瘤組織的屏障，從而介導藥物深入滲透腫瘤部位，直達腫瘤細胞而發(fā)揮療效，而被認為是最有前景的腫瘤靶向納米遞藥系統(tǒng)之一。然而，pamam也因為自身的缺點使得其應(yīng)用受到大大限制，主要是因為未經(jīng)修飾的pamam表面富集正電荷，易于與紅細胞結(jié)合從而導致血細胞的破壞，引起嚴重的毒副作用，且小粒徑的pamam在體循環(huán)過程中更易被巨噬細胞快速識別并吞噬。

納米給藥體系是指粒徑在1～1000nm的藥物遞送體系，包括粒徑較小的樹狀聚合物、納米碳管，以及粒徑相對較大的膠束、脂質(zhì)體、納米粒等。多級納米給藥系統(tǒng)的概念出現(xiàn)于2008年，由mauroferrari課題組最先提出。該課題組構(gòu)建了介孔硅膠包載量子點及單壁碳納米管多級納米給藥系統(tǒng)。在此之后，相繼出現(xiàn)了內(nèi)層結(jié)構(gòu)為金納米粒、聚合物膠束、脂質(zhì)體的多級納米給藥體系。多級納米給藥系統(tǒng)是指由不同尺寸的多種納米單元共同構(gòu)成的給藥體系，體系中每一種納米單元被設(shè)計用來跨過一個或多個生物屏障。與單一尺寸的腫瘤靶向納米體系相比，多級納米給藥系統(tǒng)由于各個單元的尺寸不同，導致其在體內(nèi)分布特性不同，從而發(fā)揮出多個納米單元的優(yōu)勢。

透明質(zhì)酸(hyaluronicacid，ha)是一種多聚陰離子聚合物，廣泛存在于體液，如細胞外基質(zhì)，身體連接組織，大部分細胞的細胞表面等。ha具有優(yōu)良的物理化學性質(zhì)如非免疫原性、生物相容性好及生物可降解性，因此被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。值得注意的是，在體液中性環(huán)境下，ha帶負電，通過包裹pamam，從而可以有效的掩蓋pamam表面的正電荷。此外，大部分腫瘤組織高度表達透明質(zhì)酸酶，且這種酶可以有效降解ha，從而釋放出內(nèi)部帶正電的pamam，隨后，pamam可以攜帶藥物實現(xiàn)進一步的腫瘤組織的深入滲透。

因此，本發(fā)明擬結(jié)合pamam樹狀聚合物的特點和多級納米體系的優(yōu)勢，以透明質(zhì)酸(hyaluronicacid，ha)為材料包裹pamam樹狀聚合物，構(gòu)建得到一種新型的以腫瘤深度滲透為目的的多級靶向透明質(zhì)酸納米粒。同時，作為一種腫瘤治療的藥物載體，本發(fā)明以甲氨蝶呤(mtx)作為抗腫瘤藥，制備了一種載甲氨蝶呤的腫瘤深度滲透多級靶向透明質(zhì)酸納米粒靜脈注射給藥制劑，既保留了pamam作為藥物載體的優(yōu)勢，又結(jié)合了酶敏感型多級納米粒給藥體系的優(yōu)勢。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種腫瘤間質(zhì)酶敏感型樹狀聚合物多級納米粒及其制備方法，該多級納米粒不僅可實現(xiàn)藥物至腫瘤組織的靶向遞送，降低腫瘤藥遞送過程中對正常組織的毒副作用，同時還能響應(yīng)腫瘤組織的酶降解，促進樹狀分子對腫瘤組織的深入滲透，從而增加藥物在腫瘤細胞內(nèi)的累積從而提高療效。

一種腫瘤間質(zhì)酶敏感型靶向樹狀聚合物，通式為：ha/pamam/x，其中，ha為透明質(zhì)酸，pamam為4代的陽離子pamam樹狀大分子，x為甲氨蝶呤，所述樹狀聚合物的粒徑為100～200nm。所述透明質(zhì)酸分子量為500～600kda。

上述載甲氨蝶呤的腫瘤深度滲透多級靶向透明質(zhì)酸納米粒的制備方法，包括以下步驟：

步驟1：稱取15mgpamam，將其溶于3ml純化水，超聲混勻得到pamam水溶液。pamam水溶液中逐漸加入mtx粉末25mg，室溫下1000rpm避光攪拌3h后，以0.45μm醋酸纖維素膜過濾除去未反應(yīng)的mtx粉末，所得濾液冷凍干燥72h得外觀黃色粉末，為載藥pamam內(nèi)核，即pamam/mtx。

步驟2：稱取10mg的透明質(zhì)酸，溶解于適量的純化水中，超聲使透明質(zhì)酸溶解。1mgpamam/mtx溶解成水溶液，逐滴加入到透明質(zhì)酸溶液中。向上述透明質(zhì)酸體系中逐滴加入6.8ml丙酮溶液，磁力攪拌15min。4mg己二酸二酰肼和2mg碳化二亞胺溶解于100μl水中，加入上述透明質(zhì)酸體系，磁力攪拌30min。6.55ml丙酮逐滴加入上述透明質(zhì)酸體系，繼續(xù)磁力攪拌3h。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮，將反應(yīng)液離心，取離心內(nèi)管液，冷凍干燥得黃色納米粒。

在正常生理環(huán)境(ph7.4)中，ha荷負電，通過納米沉淀法包裹在pamam樹狀聚合物大分子表面，從而降低陽離子聚合物pamam的毒性。一旦到達腫瘤間質(zhì)環(huán)境(ph6.5)中，外層ha會被腫瘤間質(zhì)高濃度的透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase，haase)降解，pamam恢復正電性，促進pamam粒子在腫瘤細胞的深入滲透，增強甲氨蝶呤的抗腫瘤作用。

本發(fā)明創(chuàng)造性的通過ha納米沉淀法方法，使其與pamam結(jié)合，能夠選擇性地在腫瘤間質(zhì)的酶環(huán)境下與pamam脫離，從而起到多級納米粒靶向選擇的特性。

本發(fā)明不僅可實現(xiàn)藥物至腫瘤組織的靶向遞送，降低腫瘤靶向載藥遞送系統(tǒng)對正常組織的毒副作用，同時還能促進樹形分子載體對腫瘤的深入滲透，增加藥物在腫瘤細胞內(nèi)的累積而提高療效。

附圖說明：

附圖1：具體實施例2所制備的載甲氨蝶呤多級靶向透明質(zhì)酸納米粒ha/pamam/mtx的透射電鏡圖。

附圖2：具體實施例1所制備的熒光標記多級靶向透明質(zhì)酸納米粒對a549細胞的攝取情況。

附圖3：具體實施例2所制備的載甲氨蝶呤多級靶向透明質(zhì)酸納米粒對h22荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤抑制情況。

具體實施方式：

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

具體實施例1

步驟1：熒光標記樹狀聚合物的制備

pamam本身不帶熒光，為了后續(xù)觀察其細胞攝取情況，我們設(shè)計在pamam上連接異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanateisomer，fitc)。簡單來說，6.7mgfitc溶解于5ml二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，dmso)，隨后緩慢加入到含pamam50.2mg的5ml二甲亞封溶液中。混合液攪拌12h，隨后反應(yīng)液在室溫下以去離子水為透析介質(zhì)避光透析48h。最后透析液冷凍干燥獲得純化產(chǎn)物pamam-fitc。

步驟2：熒光標記多級靶向透明質(zhì)酸納米粒的制備

稱取10mg的透明質(zhì)酸溶解于適量的去離子水中，超聲分散使透明質(zhì)酸溶解，逐滴加入含量為1mg的pamam-fitc溶液。透明質(zhì)酸體系中逐滴加入6.8ml丙酮溶液，磁力攪拌15min。4mg己二酸二酰肼和2mg碳化二亞胺溶解于100μl水中，加入上述透明質(zhì)酸體系，磁力攪拌30min。6.55ml丙酮逐滴加入上述透明質(zhì)酸體系，繼續(xù)磁力攪拌3h。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮，將反應(yīng)液倒入離心管中(ultrafree-cl@離心管，100nm)，3220×g轉(zhuǎn)速離心30min。棄去外管液，內(nèi)管液加去離子沖洗納米粒，繼續(xù)重復上述離心步驟離心，共離心3次。取內(nèi)管液，冷凍干燥得熒光標記的納米粒ha/pamam-fitc。

具體實施例2

步驟1：含藥樹狀聚合物的制備

稱取15mgpamam，將其溶于3ml純化水，超聲混勻得到pamam水溶液。pamam水溶液中逐漸加入mtx粉末25mg，室溫下1000rpm避光攪拌3h后，以0.45μm醋酸纖維素膜過濾除去未反應(yīng)的mtx粉末，所得濾液冷凍干燥72h得外觀黃色粉末，為載藥pamam內(nèi)核，即pamam/mtx。

步驟2：載甲氨蝶呤的腫瘤深度滲透多級靶向透明質(zhì)酸納米粒的制備

稱取10mg的透明質(zhì)酸，溶解于適量的純化水中，超聲使透明質(zhì)酸溶解。pamam/mtx溶解成水溶液，逐滴加入1mg的pamam/mtx溶液。向上述透明質(zhì)酸溶液中逐滴加入6.8ml丙酮溶液，磁力攪拌15min。4mg己二酸二酰肼和2mg碳化二亞胺溶解于100μl水中，加入上述體系，磁力攪拌30min。6.55ml丙酮逐滴加入上述透明質(zhì)酸體系，繼續(xù)磁力攪拌3h。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮，將反應(yīng)液倒入離心管中(ultrafree-cl@離心管，100nm)3220×g轉(zhuǎn)速離心30min。棄去外管液，內(nèi)管液加去離子，重復上述離心步驟，共離心3次。取內(nèi)管液，冷凍干燥得黃色納米粒。將新鮮制備的納米粒稀釋后進行透射電鏡觀察，詳見附圖1。

具體實施例3

熒光標記多級靶向透明質(zhì)酸納米粒對a549細胞的攝取情況，詳見附圖2。

取對數(shù)生長期的人肺癌細胞株a549細胞，胰酶消化后用含血清的rpmi1640培養(yǎng)基稀釋，轉(zhuǎn)移細胞至24孔板中培養(yǎng)，每個孔加入約5萬個細胞，貼壁培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)基，并分別加入pamam-fitc、ha/pamam-fitc和ha/pamam-fitc(培養(yǎng)基中加入haase，50u/ml)，使其最終濃度均為pamam15μm，于5％co²、37℃培養(yǎng)6h，棄去培養(yǎng)基，pbs洗滌3次，熒光倒置顯微鏡觀察細胞攝取情況。

具體實施例4

載甲氨蝶呤腫瘤深度滲透多級靶向透明質(zhì)酸納米粒載藥量和包封率的測定新鮮制備的ha/pamam/mtx納米粒溶液除去丙酮后，倒入離心管中(ultrafree-cl@離心管，100nm)，3220×g轉(zhuǎn)速離心30min。ha/pamam/mtx納米粒將留在離心管內(nèi)管，而游離藥物及水等小粒徑分子能夠存在于離心管外管，實現(xiàn)納米粒與游離藥物的分離。取離心管外管中的過濾液50μl至10ml容量瓶，以0.01mnaoh定容，以0.01mnaoh為空白對照，以去離子水為對照，使用紫外可見分光度計303nm處測定其吸光值，對照標準曲線方程計算出未包載進納米粒中mtx的含量，進而按照下式計算ha/pamam/mtx納米粒的載藥量(dle)和包封率(ee)，以上實驗重復3次。

具體實施例5

體內(nèi)藥效學腫瘤抑制實驗，以市售甲氨蝶呤溶液為對照，考察實施例2所得載甲氨蝶呤多級靶向透明質(zhì)酸納米粒的靶向性及小鼠體內(nèi)腫瘤抑制能力。詳見附圖3。

取h22細胞37℃復蘇，生理鹽水稀釋成細胞懸液，皮下注射至小鼠腹腔。7天后，選取腹部隆起明顯的腹水小鼠，處死后于超凈臺下用注射器抽取3ml小鼠抽取腹水，生理鹽水稀釋成1∶3細胞懸液，皮下注射接種至小鼠左前肢腋窩皮下0.2ml。腫瘤長至100～300mm³時，取生長較好的20只，隨機分為4組，以生理鹽水為陰性對照，甲氨蝶呤生理鹽水溶液為陽性對照，尾靜脈注射給藥，各組分別為：生理鹽水組、mtx組、ha/pamam/mtx組、pamam/mtx組，分別給藥0.2ml(給藥劑量按mtx5mg/kg)，每3天給藥一次，共給藥3次。每天用游標卡尺測量腫瘤體積，計算公式如下：小鼠腫瘤體積＝d1×(d2)²×0.5，d1為瘤長徑，d2為瘤短徑。