本申請涉及骨組織工程技術領域，具體而言，涉及一種超順磁性納米纖維膜支架材料及其制備方法和應用。

背景技術：

創(chuàng)傷、骨髓炎、骨腫瘤、骨囊腫等手術切除引起的大段骨缺損，嚴重影響了人體骨組織的生理功能，是目前骨科臨床最常見、最棘手的問題之一。當前對于合適的骨替代物的需求正與日俱增，骨修復再生材料及其相關醫(yī)療領域在全球市場從2000年的200億美元上升至2011年的600億美元，并逐年增加。自體骨是骨缺損治療的金標準，具有良好的組織相容性、骨誘導和骨傳導性能，但是容易出現供骨區(qū)疼痛、感染、創(chuàng)傷增加，獲取量受限制。異體骨移植存在免疫排斥反應，并且可能攜帶有潛在的病原體，如HIV病毒、肝炎病毒等。設計和開發(fā)新型人工骨修復材料具有重要的應用價值和社會意義。

骨組織工程是指將分離的自體高濃度成骨細胞、骨髓基質干細胞或軟骨細胞，經體外培養(yǎng)擴增后種植于一種天然或人工合成的、具有良好生物相容性、可被人體逐步降解吸收的細胞支架（scaffold）或稱細胞外基質（extracellular matrix，ECM）上，這種生物材料支架可為細胞提供生存的三維空間，有利于細胞獲得足夠的營養(yǎng)物質，進行氣體交換，排除廢料，使細胞在預制形態(tài)的三維支架上生長，然后將這種細胞雜化材料（hybrid material）植入骨缺損部位，在生物材料逐步降解的同時，種植的骨細胞不斷增殖，從而達到修復骨組織缺損的目的。

骨修復材料的生物學性能不僅與化學組成有關，而且還取決于孔結構、孔徑大小和孔隙率。研究表明，相互貫通的大孔結構有利于骨細胞及骨組織的生長，以及營養(yǎng)物質的輸送。當孔徑小于5μm時，無骨組織長入多孔支架中；當孔徑大于25μm時，纖維管狀組織開始滲透到多孔支架中；當孔徑大于50μm時，可以觀察到組織礦化；當孔徑大于75μm時，礦化組織會深入到孔深處500μm；當孔徑大于100μm時，生物骨礦化深入到孔深1000μm處，骨被確認重建?？紫堵试?0wt％～60wt％及以上，力學性能在10MPa或更高比較有利于密質組織生長。

自然骨是復雜的生物礦化系統(tǒng)之一，無機成分主要是羥基磷灰石，約占總質量的65％；有機成分主要是I型膠原纖維，約占總質量的34％，其余為水。羥基磷灰石屬于P63/m空間群，具有優(yōu)良的生物活性、生物相容性和生物降解性等優(yōu)點，在骨修復、藥物載體等領域中具有廣闊的應用前景。 植入體內后，羥基磷灰石能在短時間內與人體的軟硬組織形成緊密結合。 然而，單純的羥基磷灰石多孔支架的力學強度低、脆性大，不適用于承重部位的骨缺損修復。模仿自然骨的化學組成和孔結構制備羥基磷灰石/高分子多孔支架。羥基磷灰石多孔支架中填充殼聚糖、膠原蛋白、膠原蛋白及聚乳酸等生物活性高分子材料不僅可以提高生物學性能，而且還可以改善力學性能。

傳統(tǒng)的骨組織工程技術一般需要利用細胞因子，在制備支架過程中會將細胞因子預先載入支架材料中，這樣的方式就降低了細胞因子的可控性，細胞因子的有效負載和可控釋放都限制了細胞因子的生物學效應?；谝陨显?，本發(fā)明因此而來。

技術實現要素：

本申請旨在提供一種超順磁性納米纖維膜支架材料，以解決現有技術中的問題。

為了實現上述目的，根據本申請的一個方面，提供了一種超順磁性納米纖維膜支架材料，其特征在于所述支架材料包括：

作為支架主體的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料總重量的70~99%，且用于形成聚乳酸-羥基乙酸共聚物的乳酸單體與羥基乙酸單體摩爾比為0.1-6；

鐵摻雜的羥基磷灰石，占所述支架材料總重量的1~30%。

進一步的技術方案是，所述支架材料相互交織成多孔網狀結構，所述鐵摻雜的羥基磷灰石被覆于聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）內。

進一步的技術方案是，所述支架材料包括：

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料總重量的80~99%；

鐵摻雜的羥基磷灰石，占所述支架材料總重量的1~20%；

優(yōu)選的，所述支架材料包括：

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料總重量的80~97%；

鐵摻雜的羥基磷灰石，占所述支架材料總重量的3~20%；

優(yōu)選的，所述支架材料包括：

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料總重量的80~95%；

鐵摻雜的羥基磷灰石，占所述支架材料總重量的5~20%；

優(yōu)選的，所述支架材料包括：

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料總重量的80~93%；

鐵摻雜的羥基磷灰石，占所述支架材料總重量的7~20%；

優(yōu)選的，所述支架材料包括：

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料總重量的80~90%；

鐵摻雜的羥基磷灰石，占所述支架材料總重量的10~20%；

優(yōu)選的，所述支架材料包括：

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料總重量的85%；

鐵摻雜的羥基磷灰石，占所述支架材料總重量的15%。優(yōu)選的，支架材料中PLGA占所述支架材料總重量的85.71%，Fe-HA占所述支架材料總重量的14.39%。

進一步的技術方案是，所述鐵摻雜的羥基磷灰石中鐵的摻雜量為鐵摻雜的羥基磷灰石總重量的1~20%；

優(yōu)選的，所述鐵摻雜的羥基磷灰石中鐵的摻雜量為鐵摻雜的羥基磷灰石總重量的5~15%；

優(yōu)選的，所述鐵摻雜的羥基磷灰石中鐵的摻雜量為鐵摻雜的羥基磷灰石總重量的7~15%；

優(yōu)選的，所述鐵摻雜的羥基磷灰石中鐵的摻雜量為鐵摻雜的羥基磷灰石總重量的8~13%；

優(yōu)選的，所述鐵摻雜的羥基磷灰石中鐵的摻雜量為鐵摻雜的羥基磷灰石總重量的8~12%。

進一步的技術方案是，用于形成聚乳酸-羥基乙酸共聚物的乳酸單體與羥基乙酸單體摩爾比為0.1-6；

優(yōu)選的，用于形成聚乳酸-羥基乙酸共聚物的乳酸單體與羥基乙酸單體摩爾比為1~5；

優(yōu)選的，用于形成聚乳酸-羥基乙酸共聚物的乳酸單體與羥基乙酸單體摩爾比為2~4；

優(yōu)選的，用于形成聚乳酸-羥基乙酸共聚物的乳酸單體與羥基乙酸單體摩爾比為3。

進一步的技術方案是，所述鐵摻雜的羥基磷灰石呈現為針狀晶體，寬為5-20nm，長為50-80nm；其中鐵富集相的大小為5-10nm。

進一步的技術方案是，聚乳酸-羥基乙酸共聚物的分子量在5~20萬；優(yōu)選的，聚乳酸-羥基乙酸共聚物的分子量為5~15萬；優(yōu)選的，聚乳酸-羥基乙酸共聚物的分子量為10萬；優(yōu)選的，超順磁性納米纖維膜支架材料的水接觸角在50~85°；優(yōu)選的，超順磁性納米纖維膜支架材料的水接觸角在60~75°；優(yōu)選的，超順磁性納米纖維膜支架材料的水接觸角在55~85°；優(yōu)選的，超順磁性納米纖維膜支架材料的水接觸角在55~80°。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述的超順磁性納米纖維膜支架材料的制備方法，其特征在于，

所述方法包括以下步驟：

（1）以氫氧化鈣和磷酸為原料，混入鐵鹽，經中和反應后生成鐵摻雜的羥基磷灰石納米顆粒；

（2）將鐵摻雜的羥基磷灰石納米顆粒混入含有聚乳酸-羥基乙酸共聚物的電紡溶液中，經靜電紡絲方法，獲得超順磁性納米纖維膜支架材料。

本發(fā)明的又一目的在于提供一種所述的超順磁性納米纖維膜支架材料在骨質誘導材料方面的應用。

本發(fā)明的又一目的在于提供一種牙齒支架，所述支架包含所述的超順磁性納米纖維膜支架材料。

采用上述方案后，本發(fā)明與現有技術相比較具有以下突出的優(yōu)點和效果：

1、本發(fā)明得到的超順磁性納米纖維膜支架材料與一般的骨組織工程材料相比，無細胞因子摻入，避免了其負載及釋放的復雜問題。

2、本發(fā)明工藝利用靜電紡絲方法，獲得纖維膜性材料，具有良好的生物相容性及骨向誘導潛能。

附圖說明

構成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本申請的進一步理解，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構成對本申請的不當限定。在附圖中：

圖1示出了本申請一種典型實施方式提出的Fe-HA的透射電鏡圖，其中a、低倍放大下Fe-HA形貌，Fe-HA呈針狀晶體，大小各異，寬約5-20nm，長約50-80nm。b、高倍放大下Fe-HA形貌，可見磷酸鈣晶體中散在少量黑色圓點（箭頭處），大小約5-10nm。

圖2示出了本申請一種典型實施方式提出的Fe-HA、PLGA及PLGA/Fe-HA的X衍射分析圖譜，其中a、PLGA；b、PLGA/Fe-HA； c、Fe-HA；d、標準HA圖譜。* 表示磁鐵礦對應的峰值。

圖3 示出了本申請一種典型實施方式提出的PLGA及PLGA/Fe-HA膜的形貌及元素構成分析結果，其中a、PLGA；b、PLGA/Fe-HA.

圖4 示出了本申請一種典型實施方式提出的PLGA及PLGA/Fe-HA膜的水接觸角，其中a、PLGA；b、PLGA/Fe-HA；c、*** 表示p<0.001。a為PLGA的水接觸角檢測圖，水接觸角為117.2±1.04°；b為摻入Fe-HA納米顆粒后PLGA/Fe-HA的水接觸角檢測圖，水接觸角為68.5±2.32°；c對兩者進行統(tǒng)計學分析，發(fā)現p<0.0001。

圖5示出了本申請一種典型實施方式提出的合成材料的磁化強度-磁場強度曲線，其中a、Fe-HA，實線；b、PLGA/Fe-HA，虛線。a實線為Fe-HA納米顆粒的磁滯回線，其磁化強度隨著外界磁場的引入而增加，隨著外界磁場去除而消失，矯頑力較低為1.088Gs，Fe-HA納米顆粒的飽和磁化強度為7.61emu/g；b虛線為電紡膜PLGA/Fe-HA的磁滯回線，其飽和磁化強度可達到1.19emu/g。

圖6示出了本申請一種典型實施方式提出的RMSCs在PLGA和PLGA/Fe-HA支架表面的粘附與形貌。當共培養(yǎng)1天后，可見細胞呈梭形粘附于支架表面（a，d），形態(tài)無明顯差異。到達第3天時（b，e），細胞逐漸伸展，表面伸出偽足與纖維相連。細胞在支架表面生長7天時（c，f），細胞之間發(fā)生融合，連接成片，細胞表面有細胞外基質分泌。當將細胞-支架共培養(yǎng)置于300Gs靜磁場作用下時，當共培養(yǎng)1天后，可見細胞生長狀態(tài)與前基本相同（g，i），在3天時（h，k）較無磁場組細胞數量多，生長快，到7天時同樣可以融合成片（i，l）。

圖7示出了本申請一種典型實施方式提出的RMSCs在PLGA和PLGA/Fe-HA支架表面增殖情況。

圖8示出了本申請一種典型實施方式提出的PLGA和PLGA/Fe-HA支架表面受靜磁場作用RMSCs骨化分化因子表達。a中，在3天時，四個組的ALP活性均比較低，彼此間無差異，隨著共培養(yǎng)時間延長，7天時ALP活性有大幅提高，并且外加靜磁場的引入都上調ALP活性（p<0.05），比較PLGA/Fe-HA支架與PLGA支架，ALP活性同樣明顯上調（p<0.05）。在共培養(yǎng)14天時，檢測ALP活性仍有進一步上升，但兩支架材料間無明顯差異（p>0.05）。b中可見PLGA/Fe-HA支架隨著外加靜磁場引入，OPN表達量明顯上調（p<0.05），在同一靜磁場作用下，PLGA/Fe-HA支架表面OPN表達與PLGA相比有明顯上調（p<0.05）。c中，Runx2表達情況與OPN基本相同，外加靜磁場引入上調了兩種支架表面的Runx2表達量（p<0.05），但兩者間無明顯差異（p>0.05）。

具體實施方式

應該指出，以下詳細說明都是例示性的，旨在對本申請?zhí)峁┻M一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術和科學術語具有與本申請所屬技術領域的普通技術人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據本申請的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數形式也意圖包括復數形式，此外，還應當理解的是，當在本說明書中使用術語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

需要說明的是，本申請的說明書和權利要求書及上述附圖中的術語“第一”、“第二”等是用于區(qū)別類似的對象，而不必用于描述特定的順序或先后次序。應該理解這樣使用的數據在適當情況下可以互換，以便這里描述的本申請的實施方式例如能夠以除了在這里圖示或描述的那些以外的順序實施。此外，術語“包括”和“具有”以及他們的任何變形，意圖在于覆蓋不排他的包含，例如，包含了一系列步驟或單元的過程、方法、系統(tǒng)、產品或設備不必限于清楚地列出的那些步驟或單元，而是可包括沒有清楚地列出的或對于這些過程、方法、產品或設備固有的其它步驟或單元。

為了便于描述，在這里可以使用空間相對術語，如“在……之上”、“在……上方”、“在……上表面”、“上面的”等，用來描述如在圖中所示的一個部件或者模塊或特征與其他部件或者模塊或特征的空間位置關系。應當理解的是，空間相對術語旨在包含除了部件或者模塊在圖中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附圖中的部件或者模塊被倒置，則描述為“在其他部件或者模塊或構造上方”或“在其他部件或者模塊或構造之上”的部件或者模塊之后將被定位為“在其他部件或者模塊或構造下方”或“在其他部件或者模塊或構造之下”。因而，示例性術語“在……上方”可以包括“在……上方”和“在……下方”兩種方位。該部件或者模塊也可以其他不同方式定位（旋轉90度或處于其他方位），并且對這里所使用的空間相對描述作出相應解釋。

正如背景技術所介紹的，現有技術中的骨缺損修復技術均是集中在制備支架過程中會將細胞因子預先載入支架材料中，這種方式具有細胞因子的可控性不能保證，細胞因子的有效負載和可控釋放均難以有效控制等難題。

本發(fā)明提出了一種超順磁性納米纖維膜支架材料，使用磁性納米顆粒，即利用磁性納米顆粒與磁場間的磁力作用促進組織再生。經實驗證實，磁性材料表面的成骨細胞在外界磁場協(xié)同作用下具有較強的成骨反應，體內實驗也表明磁性納米顆粒與磁場間的協(xié)同作用可有效加速新骨形成的進程。這些結果都說明磁性納米顆粒具有一定的骨向誘導潛能。另外，由于裸露的磁性納米顆粒比如四氧化三鐵存在一定的細胞毒性，且應用及操作不便，本發(fā)明采用靜電紡絲技術制備具有骨向誘導潛能的超順磁性納米纖維膜PLGA/Fe-HA，通過無序堆疊可以形成孔隙率高、比表面積大的支架結構，另一優(yōu)勢在于可方便地將無機材料和有機材料結合起來，通過纖維包裹納米顆粒，避免裸露的納米顆粒。

本申請一種典型的實施方式中，如圖1~8所示，提出了一種磁性纖維膜性材料，即超順磁性納米纖維膜支架材料PLGA/Fe-HA，可以作為一種具有骨向誘導潛能的臨床應用型生物材料。

在一些實施例中，本發(fā)明的超順磁性納米纖維膜支架材料，所述支架材料包括：

作為支架主體的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料總重量的70~99%，且用于形成聚乳酸-羥基乙酸共聚物的乳酸單體與羥基乙酸單體摩爾比為0.1-6；

鐵摻雜的羥基磷灰石，占所述支架材料總重量的1~30%。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA是生物相容的并且生物可降解的、乳酸與乙醇酸的共聚物，并且多種形式的PLGA可以通過乳酸:乙醇酸的比率來表征。乳酸可以是 L-乳酸、D-乳酸或D，L-乳酸?？梢酝ㄟ^改變乳酸-乙醇酸的比率調整PLGA的降解速率。在一些實施例中，PLGA可以通過約85:15、約75:25、約60:40、約50:50、約40:60、約25:75、或約 15:85的乳酸:乙醇酸比率來表征。在一些實施例中，作為支架主體的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）中乳酸與乙醇酸單體的比率，可以根據不同參數如吸水量和/或聚合物降解動力學等進行優(yōu)化。

在一個實施例中，可以將PLGA的分子量(或例如，如聚合物的不同嵌段的分子量的比率)針對骨向誘導或者鐵摻雜的羥基磷灰石或者工藝進行優(yōu)化。例如，聚合物的分子量可以影響顆粒降解速率(如當生物可降解聚合物的分子量可以被調節(jié)時)、溶解度、吸水量。例如，該聚合物的分子量(或例如，如共聚物的不同嵌段的分子量的比率)可以被調節(jié)，這樣使得該顆粒在正被骨向誘導的受試者中在合理的一段時期(范圍是從幾小時至1-2周、 3-4周、5-6周、7-8周等)內生物降解。所披露的顆?？梢岳绨≒EG和PL(G)A的二嵌段共聚物，其中，例如該 PLGA可以具有數均分子量為約5，000至約20，000、或約5，000-100，000，例如約20，000-70，000，例如約15，000-50，000；例如約50，000-200，000。

實施例1 鐵摻雜的羥基磷灰石納米顆粒的制備和表征

（1）鐵摻雜的羥基磷灰石納米顆粒的制備

稱取25g Ca(OH)₂溶解于200mL水中，轉移至1000mL三口燒瓶中，磁力攪拌并加熱至60℃。稱取6.37g FeCl₂·4H₂O溶解于37.5mL水中，稱取8.39g FeCl₃·6H₂O溶解于37.5mL水中，將兩溶液作為Fe²⁺和 Fe³⁺離子的來源同時加入Ca(OH)₂懸濁液中后，再緩慢滴加磷酸溶液（22.2g磷酸溶于150mL水中），持續(xù)加熱及攪拌，2h滴完。反應產物繼續(xù)加熱攪拌1h后結束反應，置于室溫下老化24h，以900rpm的速度離心獲得沉淀，用蒸餾水清洗沉淀3次，冷凍干燥并在150nm下篩分。

（2）鐵摻雜的羥基磷灰石納米顆粒的表征

透射電子顯微鏡(TEM)觀察納米顆粒的形貌及粒徑；用粉末X射線衍射（XRD，CuKα 掃描速度 5°/min)測定樣品的結晶狀況；用用Lakeshore 7407振動樣品磁強計對合成納米顆粒的磁學性能進行檢測。

如圖1所示為Fe-HA的透射電鏡圖，其中a、低倍放大下Fe-HA形貌，可見Fe-HA是一種針狀晶體，大小各異，寬約5-20nm，長約50-80nm。b、高倍放大下Fe-HA形貌，可見磷酸鈣晶體中散在少量黑色圓點，大小約5-10nm，進一步放大下可見鐵的富集相分布在白色的HA晶體中；從XRD結果可以看到少量Fe₃O₄的存在，但大部分為Fe-HA，其中Fe離子置換晶格中的Ca離子。。

實施例2 超順磁性納米纖維膜支架材料的制備和表征

（1）磁性纖維膜性材料的制備

采用由75%乳酸和25%羥基乙酸單體聚合而成的分子量為10萬的PLGA（polylactic-co-glycolic acid）（75/25）作為支架材料的主體成份，以氯仿（CHCl₃）和二甲基甲酰胺（DMF）按體積比為1:1混合作為溶劑，以18%PLGA（w/v）配制電紡溶液，電紡溶液制備過程中，摻入3% Fe-HA（w/v）獲得混合電紡溶液，將制好的電紡溶液注入10mL注射器中，置于注射泵調控器內并控制電紡溶液的流速為2.5mL/h ，注射器尖端連接平頭毛細針頭（內徑0.34mm），將高壓電源一端連接在針頭上，一端連接在鋁箔覆蓋的接收板上，其間接收距離為15cm，設置紡絲電壓為17kV，整個紡絲過程約為4h以獲得納米纖維膜材料。

（2）磁性纖維膜性材料的表征

1）掃描電子顯微鏡(SEM)觀察及元素構成檢測

剪取約1cm²的膜材料用黑色導電膠固定于測試使用的銅盤上，將表面進行噴金處理以提高材料的導電性。采用Siron掃描電子顯微鏡觀察PLGA，PLGA/Fe-HA的表面形貌以及纖維直徑，采用能量色散X射線光譜分析儀檢測兩種材料的元素構成。結果如圖2所示。

圖2為PLGA及PLGA/Fe-HA膜的形貌及元素構成分析 a、PLGA；b、PLGA/Fe-HA.圖3a（左側）為18% PLGA（w/v）的SEM圖，圖中電紡纖維光滑連續(xù)，互相交織形成多孔網狀結構，未見到明顯的串珠樣結構；纖維直徑大體上較為一致。圖3b（左側）為加入Fe-HA后的電紡膜SEM圖，可見Fe-HA顆粒均勻分布于纖維膜上，Fe-HA顆粒明顯包裹于纖維表面。右側圖對兩材料的元素構成進行分析，檢測了C、O、Ca、P、Fe等元素的比例，發(fā)現在PLGA/Fe-HA膜內部明顯存在Ca、P、Fe元素，這與SEM結果保持一致。

2）X射線衍射分析：將膜材料剪取約5mm²用X射線衍射儀進行檢測，管電壓為40kV，管電流為40mA，在銅耙射線下從2θ=10°進行到70°。結果如圖3所示。

圖3為Fe-HA、PLGA及PLGA/Fe-HA的X衍射分析圖譜，其中a、PLGA；b、PLGA/Fe-HA；c、Fe-HA；d、標準HA圖譜。*表示磁鐵礦對應的峰值。對不同材料進行X射線衍射分析，對其晶型及結晶度進行分析，結果如圖2所示。標準HA圖譜(PDF#09-0432)，Fe-HA的XRD圖譜中在2θ＝25.9°(002)，31.8°(211)，32.9°(300)，49.5°(213)位置出現HA的特征衍射峰，表明形成物為HA晶體。比較兩者發(fā)現在2θ＝30.0°(220)，35.5°(311)位置出現峰，這些峰對應的晶相為磁鐵礦，說明形成物中有部分磁鐵礦晶體形成。圖2a中在16°左右出現一饅頭峰，為PLGA特征表現，在圖2b中相同位置也有出現，說明電紡得到的支架材料中Fe-HA的晶體結構未發(fā)生明顯變化，但結晶度有所減弱。

3）材料的親/疏水性能檢測

將PLGA，PLGA/Fe-HA材料剪成1cm²大小，并平鋪于玻璃板上，采用上海中晨數字技術設備有限公司的接觸角測量儀檢測去離子水對膜的接觸角，使用微量加樣針滴加去離子水，水滴直徑約為4mm，每個樣品取3個測試點，取其平均值。結果如圖4所示。

圖4 為PLGA及PLGA/Fe-HA膜的水接觸角，其中a、PLGA；b、PLGA/Fe-HA； c、*** 表示p<0.001。支架材料的親水性能對細胞的粘附有一定的影響，實驗中通過對材料的水接觸角進行檢測，來反映其親水性能。圖4a為PLGA的水接觸角檢測圖，水接觸角為117.2±1.04°，當摻入Fe-HA納米顆粒后，材料的水接觸角減小為68.5±2.32°（圖4b），圖4c對兩者進行統(tǒng)計學分析，發(fā)現p<0.0001，表明Fe-HA可以提高材料的親水性能。

4）PLGA/Fe-HA膜的磁學性能分析

為保證樣品不超過振動桿樣品室的尺寸，取10mg PLGA/Fe-HA膜材料剪成2-3mm的小塊，置于振動桿樣品室內，進行檢測，記錄數據。結果如圖5所示。

圖5為合成材料的磁化強度-磁場強度曲線，其中a、Fe-HA，實線； b、PLGA/Fe-HA，虛線。對合成材料的磁學性能檢測結果如圖5所示，圖5a實線為Fe-HA納米顆粒的磁滯回線，其磁化強度隨著外界磁場的引入而增加，隨著外界磁場去除而消失，矯頑力較低為1.088Gs，表現出了超順磁性的特性。Fe-HA納米顆粒的飽和磁化強度為7.61emu/g，圖5b虛線為電紡膜PLGA/Fe-HA的磁滯回線，同樣具有超順磁性的特性，飽和磁化強度可達到1.19emu/g。說明電紡過程并不會影響材料的超順磁性。

實施例3 磁性纖維膜性材料的生物相容性及骨向誘導潛能

（1）掃描電鏡觀察支架表面細胞形貌

將PLGA、PLGA/Fe-HA膜剪成直徑為14mm的圓形，使其能夠放置于24孔細胞培養(yǎng)板的底部。實驗分為四組，分別為PLGA、PLGA/Fe-HA、PLGA+SMF、PLGA/Fe-HA+SMF。75%乙醇浸泡30min，紫外線照射1.5h滅菌后，以PBS清洗支架膜3次，在每個孔內加入500μLDMEM中37℃孵育過夜。取第3代RMSCs，以5×10⁴個/孔的數量接種于支架表面，每3天換液。培養(yǎng)1d、3d、7d后，將膜用PBS清洗2次，浸泡于2.5%戊二醛固定，進入制樣過程：將膜轉入0.18M蔗糖沖洗液，4℃放置2h，以1%鋨酸固定2h，梯度乙醇脫水（30%、50%、70%、90%、95%、100%）10min×3，乙酸異戊醋室溫置換20min，二氧化碳臨界點干燥，噴金處理，SEM下觀察。

圖6為RMSCs在PLGA和PLGA/Fe-HA支架表面的粘附與形貌。在細胞-支架共培養(yǎng)的最初階段（共培養(yǎng)1天），可見細胞呈梭形粘附于支架表面（a，d），形態(tài)無明顯差異。隨著培養(yǎng)時間延長，到達第3天時（b，e），細胞逐漸伸展，表面伸出偽足與纖維相連。細胞在支架表面生長7天時（c，f），細胞之間發(fā)生融合，連接成片，細胞表面有細胞外基質分泌。這說明兩種材料均具有較好的生物相容性，適合細胞粘附與生長。當將細胞-支架共培養(yǎng)置于300Gs靜磁場作用下時，可見細胞生長狀態(tài)與前基本相同，在3天時（h，k）較無磁場組細胞數量多，生長快，到7天時同樣可以融合成片（i，l）。對比靜磁場作用下兩種材料表面的細胞，發(fā)現3天時，PLGA/Fe-HA支架表面細胞（k）可以跨越纖維進入支架內部生長。

（2） CCK-8試劑盒檢測細胞在材料表面增殖情況

將PLGA、PLGA/Fe-HA膜剪成直徑為7mm的圓形，使其能夠放置于96孔細胞培養(yǎng)板的底部。實驗分為四組，分別為PLGA、PLGA/Fe-HA、PLGA+SMF、PLGA/Fe-HA+SMF。材料接種細胞前的處理與前相同。取第3代RMSCs，以1500個/孔的數量接種于支架表面，每3天換液。培養(yǎng)1d、3d、5d、7d后，將膜用PBS清洗2次，更換新鮮培養(yǎng)基100μL，每個孔加入10μL WST-8，置于37℃環(huán)境下孵育2h。將孵育后的溶液吸取至新的96孔板中，用酶聯免疫檢測儀在450nm波長下測定吸光度值，SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

圖7為RMSCs在PLGA和PLGA/Fe-HA支架表面增殖情況。隨著培養(yǎng)時間延長，細胞呈現穩(wěn)定增殖趨勢，說明兩種材料對于細胞生長無明顯毒性。但在同一培養(yǎng)時間，兩種材料及磁場作用對細胞增殖無明顯差異。

（3）堿性磷酸酶試劑盒檢測細胞ALP活性

將PLGA、PLGA/Fe-HA膜剪成直徑為35mm的圓形，使其能夠放置于6孔細胞培養(yǎng)板的底部。實驗分組為PLGA、PLGA/Fe-HA、PLGA+SMF、PLGA/Fe-HA+SMF。材料接種細胞前的處理與前相同。取第3代RMSCs，以1.2×10⁵個/孔的數量接種于支架表面，每3天換液。分別在培養(yǎng)3d、7d、14d時，采用200μL NP-40裂解液裂解細胞，離心獲得上清，用于堿性磷酸酶的檢測。按試劑盒說明書設定p-nitrophenol標準品用量（分別為4、8、16、24、32和40μL），樣品加入量為25μL，加入一定量顯色底物，搖床輔助混勻，37℃孵育35min，每孔加入100μL反應終止液終止反應，此時，標準品或有堿性磷酸酶活性的孔會呈現不同深淺的黃色。在405nm波長下測定吸光度值，SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

（4）實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測材料表面細胞骨化分化情況

細胞按1.2×10⁵個/孔的數量接種于6孔板支架表面，培養(yǎng)7d后，提取 各組樣品的總RNA，取等量的RNA為模板，逆轉錄獲得cDNA。以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR檢測，反應體系為20μL：2×SYBR Green supermix 10μL，Forward and reverse primers 2μL，DNA template 2μL，H₂O 6μL。反應程序為：Stage 1：變性，95℃，10min；Stage 2：擴增40個循環(huán)），95℃，15s；60℃，60min；Stage 3：溶解曲線反應（自動生成）。利用StepOne軟件采用2^-ΔΔCT方法分析實驗組與對照組。檢測成骨相關基因（OPN，Runx2，）的表達，以β-actin作為內參照。

圖8為PLGA和PLGA/Fe-HA支架表面受靜磁場作用RMSCs骨化分化因子表達。RMSCs在PLGA和PLGA/Fe-HA表面的骨化分化相關因子表達如圖8所示。細胞-支架共培養(yǎng)3，7，14天后，比較ALP活性的改變（圖8a）。在3天時，四個組的ALP活性均比較低，彼此間無差異，隨著共培養(yǎng)時間延長，7天時ALP活性有大幅提高，并且外加靜磁場的引入都上調ALP活性（p<0.05），比較PLGA/Fe-HA支架與PLGA支架，ALP活性同樣明顯上調（p<0.05）。在共培養(yǎng)14天時，檢測ALP活性仍有進一步上升，但兩支架材料間無明顯差異（p>0.05）。

為了分析RMSCs骨化分化情況，用q-PCR檢測了細胞-支架共培養(yǎng)7天時OPN和Runx2的表達量。b是四組OPN表達情況，可見PLGA/Fe-HA支架隨著外加靜磁場引入，OPN表達量明顯上調（p<0.05），在同一靜磁場作用下，PLGA/Fe-HA支架表面OPN表達與PLGA相比有明顯上調（p<0.05）。Runx2表達情況與OPN基本相同，外加靜磁場引入上調了兩種支架表面的Runx2表達量（p<0.05），但兩者間無明顯差異（p>0.05）。

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