本發(fā)明涉及柚子葉的開發(fā)利用，具體涉及一種蜜柚葉提取物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

我國柚子資源豐富，分布廣泛，主要分布于廣東、廣西、福建、云南等地，因其清爽的口感，獨特的芳香而倍受人們青睞。目前，人們對柚子葉的研究主要集中于柚子葉精油的提取，對柚子葉多酚、黃酮的研究鮮有報道。多酚、黃酮是廣泛存在于植物皮、根、葉、果實中的一類天然有機化合物，具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、抑菌、調(diào)節(jié)免疫、抗炎抗過敏、止血鎮(zhèn)痛等，已被列為保健食品的一類功能因子。

自由基導(dǎo)致的氧化損傷與許多疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系，植物中安全有效的抗氧化劑是現(xiàn)階段研究的熱點，但柚子葉抗氧化性還鮮有報道。黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase,XOD)是體內(nèi)核酸代謝中重要的酶，可催化黃嘌呤和次黃嘌呤氧化生成尿酸，同時產(chǎn)生過氧化物自由基，尿酸濃度過高會引起高尿酸血癥，導(dǎo)致痛風(fēng)發(fā)作，因此，抑制XOD的活性可有效減少體內(nèi)尿酸的生成，阻止或延緩?fù)达L(fēng)的發(fā)作，減少機體損傷。

隨著人們生活方式的改變，大量高嘌呤食物被攝入，導(dǎo)致痛風(fēng)發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已成為我國次于糖尿病的第二大代謝類疾病。但目前其治療藥物往往治標(biāo)不治本，且伴有不良反應(yīng)，因此天然安全有效的抗痛風(fēng)藥物越來越受到人們的關(guān)注。近年來，諸多研究關(guān)注中草藥提取物對黃嘌呤氧化酶抑制的效果，但柚子葉提取物對黃嘌呤氧化酶活性方面的探究鮮有報道。本實驗主要研究柚子葉活性成分多酚與黃酮的提取工藝，并首次研究提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制活性，探討其作為降尿酸功能因子的可能性，同時為柚子葉的綜合開發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有抗氧化和降尿酸功效的蜜柚葉提取物及其制備方法，該蜜柚葉提取物可用于開發(fā)具有預(yù)防或治療痛風(fēng)類疾病功效的保健品及藥品。

本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)。

一種蜜柚葉提取物的制備方法，包括如下步驟：

(1)將蜜柚葉烘干去梗，粉碎后過篩；

(2)過篩后的蜜柚葉粉末用乙醇進行熱提取，得到蜜柚葉乙醇提取液；

(3)將蜜柚葉乙醇提取液濃縮后凍干，得到蜜柚葉提取物。

進一步地，步驟(1)中，所述過篩為過60～80目篩。

進一步地，步驟(2)中，所述乙醇為體積分?jǐn)?shù)50～80％的乙醇。

進一步地，步驟(2)中，蜜柚葉粉末與乙醇的料液比為1:15～1:30g/mL。

進一步地，步驟(2)中，所述熱提取是：在40～80℃溫度下提取6～10h，重復(fù)三次，合并濾液。

進一步地，步驟(3)中，所述濃縮是濃縮至相對于水的密度為1.15～1.30。

由上述任一項所述制備方法得到的蜜柚葉提取物。

進一步地，所述蜜柚葉提取物的主要成分為黃酮和多酚。

進一步地，所述蜜柚葉提取物具有抗氧化性和降尿酸活性。

更進一步地，所述抗氧化性體現(xiàn)為對DPPH·自由基、羥自由基、超氧陰離子和ABTS·+的活性清除。

更進一步地，所述對DPPH·自由基、羥自由基、超氧陰離子和ABTS.+的活性清除的IC50值分別為1.24mg/mL、1.04mg/mL、1.49mg/mL和3.31mg/mL。

更進一步地，所述降尿酸活性體現(xiàn)為體外降尿酸活性，體外降尿酸活性的檢測采用比色法。

更進一步地，所述降尿酸活性體現(xiàn)為抑制黃嘌呤氧化酶的活性，對黃嘌呤氧化酶活性抑制的IC50值為4.8mg/mL。

所述蜜柚提取物用作包括痛風(fēng)疾病的輔助治療藥物或用于制備具有以降尿酸為功能因子的保健食品及藥品。

所述蜜柚葉提取物用于制備降尿酸、促進尿酸腎排泄、修復(fù)腎損傷的藥物；將蜜柚葉提取物與藥學(xué)上可接受的載體制成保健食品。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果；

(1)本發(fā)明提取方法簡單，方便快捷；

(2)本發(fā)明通過乙醇熱提取的方式獲得蜜柚葉提取物，得到的蜜柚葉提取物有顯著的降尿酸活性，可以進一步用于篩選制備和開發(fā)降尿酸藥物和保健食品。

附圖說明

圖1為實施例1中蜜柚葉提取物對DPPH·自由基的活性清除作用曲線圖；

圖2為實施例2中蜜柚葉提取物對羥自由基的活性清除作用曲線圖；

圖3為實施例3中蜜柚葉提取物對超氧陰離子的活性清除作用曲線圖；

圖4為實施例4中蜜柚葉提取物對ABTS﹒+的活性清除作用曲線圖；

圖5為實施例1～4蜜柚葉提取物對各自由基離子活性清除的IC50值的柱狀圖；

圖6為實施例5中蜜柚葉提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制活性曲線圖。

具體實施方式

下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，均按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇，如下實施例中的原料均為市售。

實施例1

蜜柚葉提取物對DPPH·自由基的清除作用

1、蜜柚葉提取物的提取

(1)將蜜柚葉烘干去梗，粉碎后過60目篩；

(2)過篩后的蜜柚葉粉末用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇在80℃下熱提取6h，重復(fù)三次，合并濾液，得到蜜柚葉乙醇提取液；蜜柚葉粉末與乙醇的料液比為1:30g/mL；

(3)將蜜柚葉乙醇提取液濃縮至相對于水的密度為1.15后凍干，得到蜜柚葉提取物。

2、實驗樣品及試劑制備

蜜柚葉提取物溶液：準(zhǔn)確稱取20mg蜜柚葉提取物，用蒸餾水配成2.5mg/ml溶液，分別稀釋成0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml的蜜柚葉提取物溶液，備用。

0.2mmol/L的DPPH·溶液：準(zhǔn)確稱取DPPH·0.00788g溶解于100ml 95％乙醇，避光保存。

3、實驗過程

將2mLDPPH·溶液(0.2mmol/L)置于試管中，加入2mL蜜柚葉提取物溶液，震蕩均勻，室溫放置30min后在517nm處測定吸光值(Ai)；

以2mL95％乙醇加入2mL蒸餾水調(diào)零；

對照為：2mL DPPH·溶液加上2mL95％乙醇在517nm處測定波長下的吸光值(Ac)，2mL蜜柚葉提取物溶液和2mL95％乙醇混合后在517nm處測定波長的吸光值(Aj)。

提取物對DPPH·的清除能力用抑制率R表示：R＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100％。

以不同濃度的Vc及沒食子酸溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，并以同樣的實驗方法測定不同濃度的Vc及沒食子酸溶液對DPPH·自由基的活性清除。

4、實驗結(jié)果

得到的對DPPH·自由基的清除作用的實驗結(jié)果如圖1，由圖1可知，蜜柚葉提取物對DPPH·自由基的活性清除的IC50值為1.24mg/mL。

實施例2

蜜柚葉提取物對羥自由基的清除作用

1、蜜柚葉提取物的提取

(1)將蜜柚葉烘干去梗，粉碎后過60目篩；

(2)過篩后的蜜柚葉粉末用體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇在80℃下熱提取8h，重復(fù)三次，合并濾液，得到蜜柚葉乙醇提取液；蜜柚葉粉末與乙醇的料液比為1:15g/mL；

(3)將蜜柚葉乙醇提取液濃縮至相對于水的密度1.15后凍干，得到蜜柚葉提取物。

2、實驗樣品及試劑制備

蜜柚葉提取物溶液：準(zhǔn)確稱取20mg蜜柚葉提取物，用蒸餾水配成2.5mg/ml溶液，分別稀釋成0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml的蜜柚葉提取物溶液，備用。

5mmol/L鄰二氮菲溶液：0.0991g鄰二氮菲固體，加入2ml無水乙醇溶解后加入98ml去離子水。

pH 7.4磷酸鹽緩沖液：3.12g NaH₂PO₄·2H₂O定容到100ml，得溶液A；7.16g Na₂HPO₄·12H₂O定容到100ml，得溶液B；取9.5ml溶液A及40.5ml溶液B混合于燒杯中，調(diào)節(jié)pH至7.4。

15mmol/L EDTA溶液：1.0959g EDTA固體用去離子水定容到250ml容量瓶中，備用。

5mmol/L硫酸亞鐵溶液：0.1390g硫酸亞鐵固體，加入100ml去離子水(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

0.1wt％過氧化氫溶液：0.335ml的30％H2O2加入100ml去離子水(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

3、實驗過程

樣品管3組(編號①②③)：取1.2mL鄰二氮菲溶液(5mmol/L)加入0.8mL磷酸鹽緩沖液(0.2M，pH 7.4)混勻后，加入1.2mL蜜柚葉提取物溶液和1.2mLEDTA(15mmol/L)溶液，再次混勻。

損傷管、未損傷管(編號④⑤)：取1.2mL鄰二氮菲溶液(5mmol/L)加入0.8mL磷酸鹽緩沖液(0.2M，pH 7.4)混勻后，加入1.2mL去離子水和1.2mL EDTA(15mmol/L)。

試管①～⑤分別加入1.2ml 5mmlol/L硫酸亞鐵溶液，充分混勻后，試管①②③④分別加入1.6ml 0.1wt％過氧化氫溶液，試管⑤加入1.6ml去離子水；試管①～⑤置于37℃恒溫水浴鍋保溫1h，測定536nm處吸光值，記錄數(shù)據(jù)。

以不同濃度的Vc及沒食子酸溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，并以同樣的實驗方法測定不同濃度的Vc及沒食子酸溶液對羥自由基離子的活性清除。

4、實驗結(jié)果

得到的蜜柚葉提取物對羥自由基的清除作用的實驗結(jié)果如圖2，由圖2可知，蜜柚葉提取物對羥自由基的活性清除的IC50值為1.04mg/mL。

實施例3

蜜柚葉提取物對超氧陰離子的清除活性

1、蜜柚葉提取物的提取

(1)將蜜柚葉烘干去梗，粉碎后過70目篩；

(2)過篩后的蜜柚葉粉末用體積分?jǐn)?shù)為60％的乙醇在40℃下熱提取6h，重復(fù)三次，合并濾液，得到蜜柚葉乙醇提取液；蜜柚葉粉末與乙醇的料液比為1:25g/mL；

(3)將蜜柚葉乙醇提取液濃縮至相對于水的密度1.30后凍干，得到蜜柚葉提取物。

2、實驗樣品及試劑制備

蜜柚葉提取物溶液：準(zhǔn)確稱取20mg提取物，用蒸餾水配成2.5mg/ml溶液，分別稀釋成0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml的蜜柚葉提取物溶液，備用。

3、實驗過程

黃嘌呤氧化酶在有氧的條件下，可以催化黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸，同時產(chǎn)生超氧陰離子自由基(·O₂-)，·O₂-與NBT結(jié)合后呈藍(lán)色；蜜柚葉提取物清除能力越大，與NBT結(jié)合的·O₂-越少，溶液顏色就會越淺。

測定方法為：20μL 3mmol/L黃嘌呤加入180μL 0.6mmol/L NBT和20μL蜜柚葉提取物溶液，于37℃反應(yīng)5min；之后加入20μL 0.1u/mL的黃嘌呤氧化酶于96孔板中37℃保溫30min后，于560nm處測定吸光值，記為Asample。

以磷酸鹽緩沖液(pH＝7.5，濃度為0.2mol/L)代替蜜柚葉提取物溶液作為空白對照，560nm處測定吸光值，記為Acontrol。

清除率(％)＝(Acontrol-Asample)/Acontrol×100

以不同濃度的Vc及沒食子酸溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，并以同樣的實驗方法測定不同濃度的Vc及沒食子酸溶液對超氧陰離子自由基的活性清除。

4、實驗結(jié)果

實驗結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，蜜柚葉提取物對超氧陰離子的活性清除的IC50值為1.49mg/mL。

實施例4

蜜柚提取物對ABTS﹒+的清除活性

1、蜜柚葉提取物的提取

(1)將蜜柚葉烘干去梗，粉碎后過80目篩；

(2)過篩后的蜜柚葉粉末用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇在60℃下熱提取10h，重復(fù)三次，合并濾液，得到蜜柚葉乙醇提取液；蜜柚葉粉末與乙醇的料液比為1:30g/mL；

(3)將蜜柚葉乙醇提取液濃縮至相對于水的密度1.20后凍干，得到蜜柚葉提取物。

2、實驗樣品及試劑制備

ABTS儲備液(7.4mmol/L，0.4mL)：取ABTS 3mg，加蒸餾水0.735mL。(MW＝548.7)

K₂S₂O₈儲備液(2.6mmol/L，1.43mL)：取K₂S₂O₈ 1mg，加蒸餾水1.43mL。(MW＝270.32)

蜜柚葉提取物溶液：準(zhǔn)確稱取20mg提取物，用蒸餾水配成2.5mg/ml溶液，分別稀釋成0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml的蜜柚葉提取物溶液，備用。

3、實驗過程

配制ABTS+·儲備液：以2.6mmol/L的過硫酸鉀儲備液溶解7.4mmol/L的ABTS儲備液，配成7mmol/L的ABTS+·儲備液，在室溫、避光條件下靜置12h。

配制ABTS+·測定液：以磷酸鹽緩沖液(10mmol/L，pH7.4)稀釋ABTS+·儲備液，使其吸光度在734nm波長處達到0.700±0.020。

測定：取0.8mLABTS+·測定液，加入0.2ml蜜柚葉提取物溶液，準(zhǔn)確振蕩10s，靜置6分鐘，測定734nm波長處的吸光度A。

空白：取0.8mLABTS+·測定液，加入0.2ml95％乙醇，準(zhǔn)確振蕩10s，靜置6分鐘，測定734nm波長處的吸光度A₁。

清除率＝(A₁-A)/A₁×100％

以不同濃度的Vc及沒食子酸溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，并以同樣的實驗方法測定不同濃度的Vc及沒食子酸溶液對ABTS+·的活性清除。

4、測定結(jié)果

蜜柚提取物對ABTS﹒+的清除活性結(jié)果如圖4所示，由圖4可知，蜜柚葉提取物對ABTS+·的活性清除的IC50值為3.31mg/mL。

圖5為實施例1～4中，蜜柚葉提取物對各自由基離子清除活性的IC50值的柱狀圖；由圖5可知，蜜柚葉提取物對DPPH·自由基、羥自由基、超氧陰離子和ABTS·+的活性清除的IC50值分別為1.24mg/mL、1.04mg/mL、1.49mg/mL和3.31mg/mL。

實施例5

蜜柚葉提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制活性

1、蜜柚葉提取物的提取

(1)將蜜柚葉烘干去梗，粉碎后過75目篩；

(2)過篩后的蜜柚葉粉末用體積分?jǐn)?shù)為75％的乙醇在50℃下熱提取8h，重復(fù)三次，合并濾液，得到蜜柚葉乙醇提取液；蜜柚葉粉末與乙醇的料液比為1:20g/mL；

(3)將蜜柚葉乙醇提取液濃縮至相對于水的密度1.18后凍干，得到蜜柚葉提取物。

2、實驗樣品及試劑制備

蜜柚葉提取物溶液：將蜜柚葉提取物配制成2、4、6、8、10mg/mL蜜柚葉提取物溶液。

陽性對照品溶液：別嘌呤醇先用1mol/L的NaOH溶解配制成50μg/mL溶液，再用0.2mol/L磷酸緩沖液(pH＝7.5)稀釋成2.5、7.5、14、20、27.5μg/mL別嘌呤醇溶液，備用。

3、實驗過程

將50μL濃度為0.1U/mL的黃嘌呤氧化酶溶液、50μL濃度為0.2mol/L(PH＝7.5)的磷酸鹽緩沖液、蜜柚葉提取物溶液依次加入到96微孔版中，振搖30s后37℃保溫15min(平衡時間對結(jié)果有影響，此時間保證操作可行性)，采用多道移液器快速向96微孔板加入150μL濃度為0.2mM的黃嘌呤，在酶標(biāo)儀中記錄反應(yīng)30min；后加入50μL濃度為1M的HCl終止反應(yīng)，于290nm處測定吸光值。

4、按照公式計算提取物樣品對XOD的抑制活性

抑制率(％)＝[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100％

A:50μL 0.1U/mL黃嘌呤氧化酶+50μL 0.2mol/L(PH＝7.5)的磷酸鹽緩沖液+150μL 0.2mM的黃嘌呤

B:50μL0.2mol/L(PH＝7.5)的磷酸鹽緩沖液+50μL 0.2mol/L(PH＝7.5)的磷酸鹽緩沖液+150μL0.2mM的黃嘌呤

C:50μL 0.1U/mL黃嘌呤氧化酶+50μL蜜柚葉提取物溶液+150μL 0.2mM的黃嘌呤

D:50μL0.2mol/L(PH＝7.5)的磷酸鹽緩沖液+50μL蜜柚葉提取物溶液+150μL0.2mM的黃嘌呤

以不同濃度的別嘌呤醇溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，并以同樣的實驗方法測定不同濃度的別嘌呤醇溶液對黃嘌呤氧化酶活性抑制。

5、測定結(jié)果

對黃嘌呤氧化酶的抑制活性結(jié)果如圖6所示，由圖6可知，蜜柚葉提取物具有較好的黃嘌呤氧化酶抑制活性，對黃嘌呤氧化酶活性抑制的IC50值為4.8mg/mL。