本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種多房棘球蚴疫苗的設(shè)計、制備方法和相關(guān)應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：包蟲病(echinococcosis)是一種人畜共患型寄生蟲疾病，又稱棘球蚴病,包括由細粒棘球絳蟲引起的幼蟲?。簡畏?細粒棘球蚴病(cysticechinococcosis,ce)和多房棘球絳蟲引起的幼蟲病：多房棘球蚴?。╝lveolarechinocococosis,ae）。多房棘球蚴在中間宿主肝內(nèi)以出芽的方式生長或浸潤式增殖，產(chǎn)生新囊泡，長入肝組織，囊壁外角皮層很薄且常不完整，囊體與周圍組織間無明顯界限，囊液持續(xù)滲漏可與肝組織接觸，引起局部肝組織病變、增生、肝纖維化、萎縮、變性和壞死，晚期似肝癌樣轉(zhuǎn)移能轉(zhuǎn)移至肺、腦、乳腺等臟器，臨床有“蟲癌”之稱，預(yù)后極差。青海省是多房棘球蚴病的高發(fā)區(qū)，已被列為重點防治寄生蟲病之一。多房棘球蚴病具有發(fā)病范圍廣、惡性程度高、預(yù)后效果差的特點。在高原地域，大多數(shù)牧區(qū)患者出現(xiàn)癥狀時就醫(yī)往往已是晚期，不能手術(shù)切除，即使進行肝部分或半葉切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率也很高。甲苯達唑、阿苯達唑等抗生素療法有一定的治療效果，但是由于需長期連續(xù)治療導(dǎo)致該療法具有耐藥性的出現(xiàn)及治療后復(fù)發(fā)率高等缺限。表位疫苗具免疫特異性高、穩(wěn)定、無毒、分子結(jié)構(gòu)小而簡單等優(yōu)勢，并且表位疫苗可通過組合不同的th1、th2及b細胞表位可有效防止免疫逃避現(xiàn)象的發(fā)生，故已被應(yīng)用于抗細菌、病毒等感染與抗腫瘤中。表位疫苗與全菌疫苗、基因工程亞單位疫苗和dna疫苗相比，具有以下優(yōu)點：（1）表位疫苗一般穩(wěn)定、無毒，具有更高的安全性。（2）抗原表位肽的分子結(jié)構(gòu)小而簡單，不會引起免疫抑制或者自身免疫性疾病。（3）表位疫苗可對抗原表位進行精確定位，具有更高的免疫針對性和特異性。（4）表位疫苗具有十分靈活的設(shè)計性，可組合不同th、b細胞抗原表位，制成針對多種病原體的疫苗。（5）表位疫苗選用高保守性的抗原表位肽，可有效防止病原體快速基因突變所形成的免疫逃避機制。研究發(fā)現(xiàn)emy162具有很強的免疫作用，并穩(wěn)定表達于棘球蚴生命周期的各階段（原頭節(jié)、培養(yǎng)的棘球蚴、未成熟成蟲與成熟成蟲），在棘球蚴的粘附及運動生理學(xué)中發(fā)揮重要的作用。sugimotoc發(fā)現(xiàn)多房棘球蚴表面抗原tsp3具有良好的免疫原性；但是okuy等人在最新的研究中發(fā)現(xiàn)tsp3以及tsp3融合fbp在免疫老鼠的后期發(fā)生th1型向th2型的免疫類型的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致多房棘球蚴免疫逃逸的發(fā)生，抑制率僅為60%，因此以emy162制備多房棘球蚴亞單位基因工程疫苗，存在不易表達、提取、純化等問題。故傳統(tǒng)藥物及疫苗在預(yù)防和治療包蟲病在臨床應(yīng)用中的效果確實不盡如人意。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的在于提供一種針對多房棘球蚴的多表位疫苗。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種多房棘球蚴多表位疫苗的制備方法。本發(fā)明的第三個目的在于提供多房棘球蚴多表位疫苗的用途。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae，該多房棘球蚴多表位疫苗主要由大腸桿菌不耐熱性腸毒素（ltb）和emy162、tsp3的t細胞表位和b細胞表位構(gòu)成，多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae的整體氨基酸序列如序列1所示，多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae的核苷酸序列如序列2所示；多表位肽ae的氨基酸序列如序列3所示；多房棘球蚴多表位肽ae的核苷酸序列如序列4所示。所述多房棘球蚴多單位疫苗ltb-ae包含核苷酸序列的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系及宿主菌；大腸桿菌不耐熱毒素b亞基（ltb）和多房棘球蚴多表位肽ae之間的間隔序列為dprvpss。所述多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae具有以下優(yōu)點：（1）多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae將emy162及tsp3的優(yōu)勢抗原表位和黏膜免疫佐劑ltb科學(xué)合理地整合在一起，可激發(fā)針對多房棘球蚴抗原emy162及tsp3的t細胞免疫應(yīng)答和特異性體液免疫應(yīng)答。（2）tsp3是多房棘球蚴表面抗原，被公認(rèn)為是多房棘球蚴疫苗的理想候選抗原能夠取得良好的保護作用；emy162蛋白表達在多房棘球蚴的多個時期，是良好的候選抗原。（3）由于以emy162制備多房棘球蚴亞單位基因工程疫苗，存在不易表達、提取、純化等問題，多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae含有這4種emy162及tsp3的優(yōu)勢th和b細胞抗原表位或區(qū)段，相對分子量較小，易于表達、提取及純化。（4）ltb-ae抗原表位肽的分子量很小，免疫原性很低，而所述多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae采取“偶聯(lián)分子內(nèi)免疫佐劑”的設(shè)計思路來增強表面抗原ae的免疫原性，從而誘發(fā)高滴度的特異性抗體產(chǎn)生。本發(fā)明的第二個目的是提供所述多房棘球蚴多表位疫苗的制備方法，其技術(shù)路線詳述如下：（1）新型多房棘球蚴多表位疫苗抗原分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計根據(jù)機體對多房棘球蚴的免疫保護性機制，合理選擇多房棘球蚴抗原蛋白emy162和tsp3的th、b細胞優(yōu)勢抗原表位，通過生物信息學(xué)對抗原表位的連接順序、間隔序列和多重拷貝數(shù)，加以分析和確定，并與黏膜免疫佐劑大腸桿菌不耐熱性腸毒素（ltb）相偶聯(lián)設(shè)計出一個科學(xué)合理、結(jié)構(gòu)新穎的多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae。（2）重組表達質(zhì)粒pczn1-ltb-ae（含有融合基因ltb-ae）的構(gòu)建采用基于pas(pcr-basedaccuratesynthesis)的方法合成基因ltb-ae，通過雙酶切連接至pczn1載體的ndei和xbai之間，獲得的重組質(zhì)粒pczn1-ltb-ae。（3）融合蛋白ltb-ae的原核表達及純化將重組表達載體pczn1-ltb-ae轉(zhuǎn)化進大腸桿菌arcticexpress中，構(gòu)建重組基因工程菌株arcticexpress/pczn1-ltb-ae。利用iptg誘導(dǎo)表達，并通過ni-ida鎳離子親和層析獲得電泳純度的融合蛋白ltb-ae，即為多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae。本發(fā)明的第三個目的是提供多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae的用途。多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae可用于預(yù)防和治療多房棘球蚴感染相關(guān)性疾病。本發(fā)明以大腸桿菌不耐熱毒素b亞基（ltb）作為分子內(nèi)佐劑。大腸桿菌不耐熱腸毒素（lt）是由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（enteroxigenicescherichiacoli,etec）分泌的一種外毒素。lt是大腸桿菌質(zhì)粒的編碼產(chǎn)物，天然狀態(tài)下分泌于大腸桿菌質(zhì)周腔。已有報道顯示，ltb具有復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)功能，是很強的粘膜免疫原和粘膜免疫佐劑，是開發(fā)粘膜免疫佐劑的研究熱點對象，ltb還具有免疫調(diào)節(jié)作用，用于某些自身免疫病的防治研究。本發(fā)明通過采用分子克隆技術(shù)通過對抗原表位的連接順序、間隔序列和多重拷貝數(shù)的分析設(shè)計泡型包蟲多表位疫苗，并經(jīng)原核系統(tǒng)表達并純化獲得重組蛋白ltb-ae；繼而將多表位疫苗ltb-ae免疫小鼠后經(jīng)elisa、小鼠脾淋巴細胞增殖實驗、gm1特異性elisa等技術(shù)考察多表位疫苗ltb-ae的免疫原性及生物活性。確認(rèn)該多房棘球蚴多表位疫苗能夠誘發(fā)機體產(chǎn)生針對多房棘球蚴t細胞及b細胞免疫應(yīng)答和高滴度特異性抗體體液免疫應(yīng)答，可用于預(yù)防和治療多房棘球蚴感染相關(guān)性疾病。附圖說明圖1：多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計特點；圖2：重組表達載體pczn1-ltb-ae的雙酶切鑒定，泳道1：dnamarker；泳道2：pczn1-ltb-ae酶切前質(zhì)粒；泳道3：pczn1-ltb-ae/ndei+xbai；圖3：重組表達載體pczn1-ltb-ae載體構(gòu)建圖譜；圖4：多房棘球蚴多表位肽融合蛋白ltb-ae的原核表達，泳道m(xù)：蛋白質(zhì)marker；泳道1：未加iptg誘導(dǎo)菌液蛋白；泳道2：加iptg誘導(dǎo)后菌液蛋白；泳道3：加入0.5mmiptg37℃誘導(dǎo)后菌液離心后上清；泳道4：加入0.5mmiptg37℃誘導(dǎo)菌液離心后沉淀；圖5：多房棘球蚴多表位肽融合蛋白ltb-ae的ni-ida親和層析純化，泳道m(xù)：蛋白質(zhì)marker；泳道1：ltb-ae未純化蛋白；泳道2：20mm咪唑洗脫的雜蛋白和部分目的蛋白；泳道3：純化后的ltb-ae蛋白樣品；圖6：多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae誘發(fā)抗emy162igg抗體的檢測，多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae能誘發(fā)產(chǎn)生一定滴度抗emy162的igg抗體，并具有較高的抗體效價，而rltb不能引起抗emy162的igg抗體；圖7：多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae誘發(fā)抗多房棘球蚴總蛋白igg抗體的檢測，多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae能夠產(chǎn)生一定滴度抗多房棘球蚴總蛋白的igg抗體；圖8：多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae致敏小鼠脾臟淋巴細胞對抗原刺激的增殖反應(yīng)；圖9：多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae免疫特異性的免疫印跡（westernblot）鑒定；圖10：多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae與神經(jīng)節(jié)苷脂gm1的結(jié)合活性檢測。具體實施方式材料：1、iptg溶液：稱取1.2giptg置于50ml離心管中，加入40ml無菌水，充分混勻溶解后，定容至50ml；用0.22μm濾器過濾除菌，小份分裝，-20℃保存。2、氨芐青霉素（amp）貯液（100mg/ml）：稱取100mg氨芐青霉素（amp）溶于1ml無菌水，制得濃度為100mg/ml的貯存液，通過0.22μm細菌濾器過濾除菌，溶液分裝保存于-20℃冰箱中。3、培養(yǎng)基：（1）lb液體培養(yǎng)基：稱取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5gnacl，加蒸餾水至1000ml，調(diào)整ph至7.4，高壓蒸氣滅菌；（2）lb固體培養(yǎng)基：1.5g瓊脂粉/100mllb培養(yǎng)液，高壓滅菌后，傾倒平板。4、dna電泳緩沖液（50xtae）：稱取242gtris、37.2gna2edta·2h2o和57.1ml冰乙酸，加水至1000ml，使用時稀釋50倍。5、sds-page電泳緩沖液（5x）：稱取tris粉末15.1g、甘氨酸94g、sds5.0g；加入約800ml的去離子水，攪拌溶解；加去離子水定容至1l，室溫保存；注意：加水時應(yīng)讓水延著壁緩緩流下，以避免由于sds的原因產(chǎn)生很多泡沫。6、考馬斯亮藍蛋白染色試劑：（1）考馬斯亮藍g-250染液（蛋白質(zhì)定量用）：考馬斯亮藍g-250100mg溶解在50ml95%乙醇中，然后加入86%磷酸100ml，用蒸餾水稀釋至1000ml。（2）脫色液：250ml乙醇、80ml冰醋酸用蒸餾水稀釋至1000ml。8、實驗動物：balb/c小鼠：為spf級，雄性，6～8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：scxk（京）2012-0001。9、elisa試劑：（1）包被液：1.6gna2co3，2.9gnahco3，0.2gnan3，加雙蒸水至1l，調(diào)ph值至9.6。（2）洗滌液：分別稱取0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4?12h2o，8.0gnacl，0.2gkcl，0.5mltween-20，加入ddh2o定容至1000ml（pbst）。（3）封閉液：稱取3.0gbsa溶解于100ml洗滌緩沖液中，過濾除菌后4℃保存。（4）底物液：可溶性單組份tmb底物溶液。（5）終止液：量取蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸21.7ml（1mh2so4）。10、淋巴細胞增殖實驗主要試劑（1）小鼠脾臟淋巴細胞分離液（購于cedarlane公司，cl5031）（2）rpmi-1640完全培養(yǎng)液：在rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液加入10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素。（3）rpmi-1640不完全培養(yǎng)液：稱取10.4grpmi-1640干粉、2.4ghepes、0.75gnahco3，加去離子水至1000ml，ph7.4，超濾除菌，分裝。實施例1：多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計根據(jù)“機體對多房棘球蚴的免疫保護性機制”和“表位疫苗構(gòu)建理論”，使用多房棘球蚴抗原蛋白emy162的表位emy16236-48、emy1627-13及tsp3抗原表位tsp333-42、tsp380-90用于多房棘球蚴多表位疫苗的構(gòu)建。在多房棘球蚴多表位疫苗的設(shè)計中，本發(fā)明將th細胞表位放在b細胞表位的前端，有助于b細胞表位的有效遞呈，再經(jīng)過生物信息學(xué)dnastar和rankpep軟件的分析和評價，抗原表位順序確定為tsp380-90-emy16236-48-tsp333-42-emy1627-13；選擇kk作為相鄰th抗原表位的間隔序列，選擇gs作為相鄰b抗原表位的間隔序列；將emy162和tsp3抗原表位emy16236-48、emy1627-13、tsp333-42和tsp380-90分別拷貝兩次；選擇大腸桿菌不耐熱腸毒素b亞基（ltb）作為分子內(nèi)免疫佐劑，融合在多表位肽（ae）的n端，增強多表位肽（ae）的免疫原性。結(jié)果：多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計特點和思路如圖1所示。實施例2：重組表達載體pczn1-ltb-ae（含有融合基因ltb-ae）的構(gòu)建將前期設(shè)計的多表位肽ltb-ae的氨基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏愛性原則轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的核苷酸序列，采用基于pas(pcr-basedaccuratesynthesis)的方法，設(shè)計全長拼接引物，在引物的兩端各設(shè)計了保護性堿基合成基因ltb-ae，通過克隆位點ndei和xbai連入表達載體pczn1。結(jié)果：利用ndei和xbai雙酶切待檢重組質(zhì)粒pczn1-ltb-ae，37℃反應(yīng)2h，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)雙酶切的dna片段約為620bp，與融合基因ltb-ae的理論大小一致，如圖2所示。重組表達載體pczn1-ltb-ae的載體構(gòu)建圖譜如圖3所示。將獲得的重組質(zhì)粒pczn1-ltb-ae轉(zhuǎn)入top10克隆菌株，挑取陽性克隆子測序，測序結(jié)果與預(yù)期序列完全一致，且無移碼突變。實施例3：多表位肽融合蛋白ltb-ae的原核表達將驗證正確的重組表達質(zhì)粒pczn1-ltb-ae轉(zhuǎn)入到大腸桿菌arcticexpress菌株中。在預(yù)先制備好的含50μg/mlamp的lb平板上，接種環(huán)劃線基因工程菌株pczn1-ltb-ae/arcticexpress，倒置于37℃培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)后，挑取單個菌落，接種于含50μg/mlamp的lb培養(yǎng)基中，37℃，220rpm，培養(yǎng)過夜。以2%接種量分別接種重組菌于含50μg/mlamplb培養(yǎng)基中，37℃，220rpm，培養(yǎng)至至菌體od600為0.6-0.8(約2h)，加入iptg使終濃度達到1mmol/l，37℃，220rpm誘導(dǎo)表達4h，以未加iptg誘導(dǎo)的載體菌pczn1-ltb-ae/arcticexpress作為陰性對照。結(jié)果：與對照菌株對比，基因工程重組菌株pczn1-ltb-ae/arcticexpress在約26kd處出現(xiàn)目的蛋白條帶，與多表位肽融合蛋白ltb-ae的理論大小相符合，如圖4所示。多表位肽融合蛋白ltb-ae在包涵體蛋白中存在。實施例4：多表位肽融合蛋白ltb-ae的純化（1）包涵體蛋白的變復(fù)性將菌體沉淀重懸于20mllysisbuffer(20mmtris-hclcontaining1mmpmsfandbacteriaproteaseinhibitorcocktail,ph8.0)，超聲破碎(功率400w，工作4sec，間歇8sec，共20min)；將超聲破碎的細胞裂解液4℃、10000g離心20min，收集沉淀；使用包涵體洗滌液(20mmtris，1mmedta，2m尿素，1mnacl，1％tritonx-100，ph8.0)洗滌包涵體3次；用溶解緩沖液(20mmtris，5mmdtt，8m尿素ph8.0)，按一定比例溶解包涵體，4℃放置過夜；室溫，15000rpm離心15min；將上述溶液滴加20mmtris-hcl5mmedtabufferph7.8緩沖液中，逐步成倍梯度稀釋緩慢攪拌，將蛋白溶液裝入透析袋于pbsph7.4溶液中透析過夜。（2）ni-ida鎳離子親和層析柱的純化利用低壓層析系統(tǒng)，蛋白溶液以0.5ml/min流速上樣至ni-idabinding-buffer預(yù)平衡的ni-ida-sepharosecl-6b親和層析柱；用ni-idabinding-buffer以0.5ml/min流速沖洗，至流出液od280值到達基線；用ni-idawashing-buffer(20mmtris-hcl，20mm咪唑，0.15mnacl，ph8.0)以1ml/min流速沖洗，至流出液od280值到達基線；用ni-idaelution-buffer(20mmtris-hcl，250mm咪唑，0.15mnacl，ph8.0)以1ml/min流速洗脫目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用pbs（ph7.4）進行透析過夜。結(jié)果：經(jīng)ni-ida鎳離子親和層析柱的純化后，收集的各個蛋白峰進行sds-page分析，可以發(fā)現(xiàn)目的蛋白集中在250mm咪唑洗脫產(chǎn)生的蛋白峰。通過凝膠成像檢測儀分析在250mm咪唑洗脫的目的蛋白純度可達電泳純，如圖5所示。實施例5：多表位疫苗ltb-ae的免疫原性和免疫特異性研究（1）balb/c小鼠的免疫實驗分組：將spf級balb/c小鼠隨機分為3組，分別為多表位融合蛋白ltb-ae免疫組、重組霍亂毒素b亞基（rltb）免疫組和pbs免疫組。每組6只balb/c小鼠，共18只，詳細分組如下圖所示：表1：spf級balb/c小鼠分組及免疫方案實驗組數(shù)目免疫方式免疫次數(shù)免疫劑量免疫佐劑ltb-ae6腹腔注射3次50μg/只弗氏佐劑rltb6腹腔注射3次50μg/只弗氏佐劑pbs6腹腔注射3次50μg/只弗氏佐劑免疫方式：用75%酒精對小鼠腹部消毒，然后腹部多點皮下注射表位融合蛋白ltb-ae和弗氏完全佐劑的混合乳化劑；每隔一周加強免疫一次，第2、3周加弗氏不完全佐劑，第4周直接注射表位融合蛋白溶液加強免疫?？寡宓牟杉涸谀┐蚊庖吆蟮谖逄?，摘小鼠眼球采血，收集血液，放置待血清完全分離，3000rpm離心5分鐘分裝血清，－80℃凍存?zhèn)溆?。?）抗血清中特異性抗體的elisa檢測將抗原（emy162和多房棘球蚴總蛋白）分別用包被液稀釋成10μg/ml，100μl/孔包被elisa板，4℃過夜。用洗滌液洗4次后，每孔加入300μl封閉液，37℃封閉2h。用洗滌液洗4次后，將抗血清（鼠抗ltb-ae抗血清和鼠抗rltb抗血清）和小鼠陰性血清倍比稀釋后加入elisa板，100μl/孔，在37℃下孵育60min。用洗滌液洗4次后，加入hrp標(biāo)記的羊抗鼠igg（1:10000），100μl/孔，在37℃下孵育1h。用洗滌液洗4次后，加入100μl/孔tmb底物顯色液，室溫避光反應(yīng)10min，加50μl終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定各孔od450值。結(jié)果：emy162的包被濃度為10μg/ml，通過elisa檢測，多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae能夠產(chǎn)生針對emy162的特異性igg抗體，而rltb免疫組不能產(chǎn)生抗emy162抗體，如圖6所示；多房棘球蚴總蛋白的包被濃度為10μg/ml，通過elisa檢測，多表位疫苗ltb-ae能夠產(chǎn)生抗多房棘球蚴總蛋白的抗體，而pbs免疫組不能產(chǎn)生抗多房棘球蚴總蛋白的特異性igg抗體，如圖7所示。（3）小鼠脾臟淋巴細胞增殖實驗將經(jīng)抗原免疫的小鼠脫臼處死，泡75%酒精5min后，移入超凈工作臺。用剪刀小心剪開小鼠的腹部外皮，再剪開小鼠的腹腔，用鑷子取出小鼠脾臟（暗紅色）。在小平皿中放入2-3mllympholyte?-m淋巴細胞分離液；用鑷子固定尼龍網(wǎng)，然后用注射器活塞輕輕研磨小鼠脾臟，使得分散的單細胞透過尼龍網(wǎng)進入淋巴細胞分離液中；把懸有脾臟細胞的分離液立即轉(zhuǎn)移到離心管中，離心前再覆蓋上大約1ml的1640培養(yǎng)基；1000g-1500g離心20min。離心結(jié)束后淋巴細胞會在1640培養(yǎng)基下層懸浮。用含10%小牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基制備成一定濃度的細胞懸液（5x105/ml）。在96孔平底培養(yǎng)板中，每孔加入100μl細胞，同時加入ltb-ae和emy162各20μg/ml、emy162抗原表位肽（emy16236-48和emy1627-13）、tsp3抗原表位肽（tsp333-42和tsp380-90）和生理鹽水各100μl，終體積為200μl/孔，每組做3個平行孔。將加好的96孔平底培養(yǎng)板放置37℃5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60h后，向各孔中加入mts溶液40μl，繼續(xù)培養(yǎng)2h后用酶標(biāo)儀讀取od570值。刺激指數(shù)（si）≥2時，判斷為陽性；刺激指數(shù)計算公式如下：結(jié)果：多表位疫苗ltb-ae致敏過的小鼠脾臟淋巴細胞經(jīng)ltb-ae、emy162、emy162抗原表位肽（emy16236-48和emy1627-13）、tsp3抗原表位肽（tsp333-42和tsp380-90）刺激均能夠發(fā)生明顯的淋巴細胞增殖反應(yīng)，而pbs免疫組的小鼠脾臟淋巴細胞接受上述抗原刺激時均未發(fā)生淋巴細胞增殖反應(yīng)，說明多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae中emy162抗原表位肽及tsp3抗原表位肽均保持有其免疫學(xué)特性，能夠刺激機體產(chǎn)生針對各自th抗原表位的細胞免疫應(yīng)答，如圖8所示。（4）蛋白免疫印跡（westernblot）取蛋白樣品ltb-ae進行15%sds-page電泳。用半干式電轉(zhuǎn)移法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到pvdf膜上，恒流1ma/cm2，2h；將pvdf膜洗凈后用10%脫脂牛奶封閉液28℃搖床封閉2h；pbst洗膜3次，每次10min。分別加入按1:2500倍數(shù)稀釋好的抗血清（鼠抗ltb-ae血清），4℃過夜；第二天用pbst洗膜3次，每次10min。加入按1:10000倍數(shù)稀釋好的二抗（hrp酶標(biāo)羊抗鼠igg），28℃搖床孵育1h；用pbst洗膜3次，每次10min。在暗室(允許紅色光源)中，將pvdf膜蛋白面朝上，放在保鮮膜上，吸水紙吸掉多余的pbst溶液，向膜上均勻滴加事先混合好的ecl發(fā)光液，反應(yīng)1min；將pdvf膜包裹在保鮮膜中，剪下一塊等大的x光膠片（膠片也作剪角處理以區(qū)分條帶順序），放置夾片盒曝光0.5~30min；取出x光膠片，在顯影劑中漂至條帶出現(xiàn)，放到停影液（1.5%冰醋酸）中停影1min，用流水沖洗1min后在定影劑中漂至背景部分透明，最后流水沖洗20min固定影像。結(jié)果：鼠抗ltb-ae血清能夠與純化的ltb-ae蛋白發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，說明多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae，能夠激發(fā)機體產(chǎn)生針對ltb-ae的高特異性抗體，如圖9所示。實施例5：gm1-elisa檢測多表位疫苗ltb-ae中l(wèi)tb組分的分子免疫佐劑活性將神經(jīng)節(jié)苷脂gm1或者牛血清白蛋白（bsa）用包被液稀釋至10μg/ml，100μl/孔，包被elisa板，4℃過夜。用pbst洗滌4次；每孔加入300μl封閉液，37℃封閉2h；用洗滌液pbst洗4次后，4℃保存。將多表位肽融合蛋白ltb-ae和重組霍亂毒素b亞基（rltb）按照一定比例稀釋（100μg/ml到0.78μg/ml），加入100μl/孔，37℃放置60min。用洗滌液pbst洗4次，加入鼠抗ltb多克隆抗體（1:1000），100μl/孔，37℃溫育60min。洗滌4次；加入hrp標(biāo)記羊抗鼠igg（1:10000），100μl/孔，37℃放置30min。洗滌4次后，加入100μl/孔tmb底物顯色液，37℃孵育10min，50μl終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀檢測各孔od450值。結(jié)果：通過gm1-elisa檢測多表位肽融合蛋白ltb-ae和rltb是否具有形成五聚體和神經(jīng)節(jié)苷脂gm1結(jié)合的活性。多表位肽融合蛋白ltb-ae和rltb的od450都顯著高于陰性對照組（包被bsa），證明多表位肽融合蛋白ltb-ae和rltb均具有形成五聚體和神經(jīng)節(jié)苷脂gm1結(jié)合的活性，也說明新型多表位疫苗ltb-ae和rltb組分具有較好的分子免疫佐劑活性，如圖10所示。序列表序列1<110>青海大學(xué)<120>一種多房棘球蚴多表位疫苗ltb-ae的設(shè)計、制備方法和應(yīng)用<130>1<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>208<212>prt<213>人工序列<400>1metthralaproglnthrilethrgluleucysserglutyrargasn151015thrglniletyrthrileasnasplysileleusertyrthrgluser202530metalaglylysargglumetvalileilethrphelysserglyglu354045thrpheglnvalgluvalproglyserglnhisileaspserglnlys505560lysalailegluargmetlysaspthrleuargilethrtyrleuthr65707580gluthrlysileasplysleucysvaltrpasnasnlysthrproasn859095serilealaalailesermetgluasnaspproargvalproserser100105110lysprotyrproalasercyscyslysserglylyslyslysprotyr115120125proalasercyscyslysserglylyslysthrleuprogluhisphe130135140argtrpilehisvalglyserlyslysthrleuprogluhisphearg145150155160trpilehisvalglyserlyslysleuvalglylysglumetglnarg165170175gluileglyserleuvalglylysglumetglnarggluileglyser180185190leuileleuleualathrserglyserleuileleuleualathrser195200205序列2<210>2<211>648<212>dna<213>人工序列<400>2atgacagcacctcagacgattaccgaattgtgtagcgaatatcgcaatacccagatctat60actatcaatgacaaaattctcagctacacagaatccatggccggtaaacgcgagatggta120atcattacttttaagtcgggcgaaacctttcaagtggaagtccccggcagccaacatatt180gactcgcagaaaaaagcgattgaacgcatgaaagataccctccgtatcacctatctgacc240gagactaagatcgataagctgtgtgtatggaacaacaagacaccgaacagtattgcggcg300atcagcatggaaaacgatcctcgtgttcccagtagtaaaccgtatccagccagttgttgc360aaaagcggcaaaaaaaaaccgtacccggcgagctgctgtaaatcggggaaaaaaactctg420ccggagcatttccgctggattcatgttggatctaaaaaaaccctcccggagcattttcgc480tggattcatgtggggtcaaagaaacttgttggcaaagaaatgcagcgcgaaattggctca540cttgtcggtaaagaaatgcagcgcgagattggctctctgattctgcttgcgacaagtggc600agtctgatcttgttagcaacgtctctgatcttgttagcaacgtcttaa648序列3<210>3<211>96<212>prt<213>人工序列<400>3lysprotyrproalasercyscyslysserglylyslyslysprotyr151015proalasercyscyslysserglylyslysthrleuprogluhisphe202530argtrpilehisvalglyserlyslysthrleuprogluhisphearg354045trpilehisvalglyserlyslysleuvalglylysglumetglnarg505560gluileglyserleuvalglylysglumetglnarggluileglyser65707580leuileleuleualathrserglyserleuileleuleualathrser859095序列4<210>4<211>288<212>dna<213>人工序列<400>4aaaccgtatccagccagttgttgcaaaagcggcaaaaaaaaaccgtacccggcgagctgc60tgtaaatcggggaaaaaaactctgccggagcatttccgctggattcatgttggatctaaa120aaaaccctcccggagcattttcgctggattcatgtggggtcaaagaaacttgttggcaaa180gaaatgcagcgcgaaattggctcacttgtcggtaaagaaatgcagcgcgagattggctct240ctgattctgcttgcgacaagtggcagtctgatcttgttagcaacgtct288當(dāng)前第1頁12