本發(fā)明涉及一種中藥制劑，具體涉及一種栝樓桂枝滴丸及其檢測方法。

背景技術(shù)：

栝樓桂枝湯出自東漢末年張仲景《金匱要略》，主要由栝樓、桂枝、白芍、生姜、大棗、甘草等組成，具有解肌調(diào)營、養(yǎng)營生津、柔潤筋脈的功效[1]。

已有研究報道栝樓桂枝湯和栝樓桂枝顆粒具有良好的腦保護作用[2-7]。但是，其服藥劑量相對較大，適從性不高。為了減少患者服用劑量，提高療效，有必要對其進行進一步地改進。

[1]田文熙.《金匱要略》中桂枝湯類方調(diào)和陰陽的作用[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志,2010,08:646-647.

[2]張玉琴,李煌,許文,徐偉,黃枚,褚克丹,陳立典.栝樓桂枝顆粒對腦缺血再灌注損傷大鼠的血腦屏障通透性及神經(jīng)保護作用[J].中華中醫(yī)藥雜志,2015,05:1410-1417.

[3]朱曉勤,李鉆芳,毛敬潔,胡海霞,林如輝,陳立典.栝樓桂枝湯對谷氨酸所致的PC12細胞損傷的保護作用[J].福建中醫(yī)藥,2015,02:35-36.

[4]林羽,徐偉,張玉琴,李煌,許文.栝樓桂枝顆粒抗缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)元及原代海馬神經(jīng)元凋亡研究[J].康復學報,2015,01:38-43.

[5]Huang J,Tao J,Xue X,Yang S,Han P,Lin Z,Xu W,Lin J,Peng J,Chen L.Gua Lou Gui Zhi decoction exerts neuroprotective effects on post-stroke spasticity via the modulation of glutamate levels and AMPA receptor expression.Int J Mol Med.2013Apr；31(4):841-8.

[6]Hu H,Li Z,Zhu X,Lin R,Lin J,Peng J,Tao J,Chen L.Gua Lou Gui Zhi decoction suppresses LPS-induced activation of the TLR4/NF-κB pathway in BV-2murine microglial cells.Int J Mol Med.2013Jun；31(6):1327-32.

[7]Hu H,Li Z,Zhu X,Lin R,Peng J,Tao J,Chen L.GuaLou GuiZhi decoction inhibits LPS-induced microglial cell motility through the MAPK signaling pathway.Int J Mol Med.2013Dec；32(6):1281-6.11.

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種栝樓桂枝滴丸，它是包含下述原料制備而成的制劑：栝樓桂枝湯浸膏粉和基質(zhì)；所述基質(zhì)由3-5重量份的聚乙二醇4000和0-2重量份的聚乙二醇6000組成。

進一步地，所述基質(zhì)由3重量份的聚乙二醇4000和2重量份的聚乙二醇6000組成。

進一步地，所述栝樓桂枝湯浸膏粉與基質(zhì)重量比為4～6:1，優(yōu)選4～5:1，更優(yōu)選4:1。

進一步地，栝樓桂枝湯浸膏粉是通過下述方法制備得到的：處方：栝樓30重量份，桂枝9重量份，白芍9重量份，生姜9重量份，大棗9重量份，甘草6重量份；取處方比例的各味藥材，水提取，經(jīng)大孔樹脂柱分離純化后，濃縮，干燥，粉碎得到栝樓桂枝湯浸膏粉。

更進一步地，所述栝樓桂枝湯浸膏粉是通過下述方法制備得到的：處方：栝樓30重量份，桂枝9重量份，白芍9重量份，生姜9重量份，大棗9重量份，甘草6重量份；取處方比例的各味藥材，加10倍量的水，煎煮2次，每次1.5h，合并煎液，濾過，濃縮至溶液濃度0.3g生藥/mL，離心30min，離心轉(zhuǎn)速為3000r·min^-1，濾過，即得上樣液；取上樣液經(jīng)HPD-100型大孔樹脂柱分離純化，純化工藝為：最大上樣量為2.5g生藥·g^-1，吸附流速為2BV(resin bed volume樹脂床體積)·h^-1，洗脫劑為70％乙醇，洗脫流速為3BV·h^-1，洗脫劑用量為6BV；合并收集70％乙醇洗脫液，濃縮，減壓干燥，粉碎，即得栝樓桂枝湯浸膏粉。

本發(fā)明還提供了一種制備前述栝樓桂枝滴丸的方法，按前述配方取樓桂枝湯浸膏粉和基質(zhì)，混合均勻，加熱熔融，滴制成丸；

所述滴制中，滴速為20滴·min^-1、滴距為2cm、滴制溫度為90℃、冷凝劑溫度為10℃。

本發(fā)明還提供了所述栝樓桂枝滴丸在制備腦保護或腦卒中后肌肉痙攣藥物中用途。

本發(fā)明還提供了一種栝樓桂枝類制劑，它是以前述的栝樓桂枝滴丸為活性成分，加入藥學上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。

本發(fā)明的栝樓桂枝滴丸，療效顯著優(yōu)于栝樓桂枝顆粒，有效減少了患者的服用劑量，提高了患者的適從性。并且，本發(fā)明的栝樓桂枝滴丸圓整度高，外觀質(zhì)量好，滴丸質(zhì)量差異系數(shù)和溶散時限均較小，質(zhì)量穩(wěn)定性高。

為進一步監(jiān)控本發(fā)明栝樓桂枝滴丸的質(zhì)量，本發(fā)明還提供了一種栝樓桂枝滴丸中7種成分的含量測定方法，所述7種成分為芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、肉桂酸、6-姜酚、甘草苷、甘草酸和甘草，包括以下步驟：

(1)7種成分標準曲線的建立：

a、對照品溶液的制備：

取芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、肉桂酸、6-姜酚、甘草苷、甘草酸和甘草素對照品，混合，加甲醇配制成混合對照品溶液；

b、對照品溶液的測定：

配制系列濃度的混合對照品溶液，分別注入HPLC色譜儀，梯度洗脫，測定各色譜峰峰面積，得到芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、肉桂酸、6-姜酚、甘草苷、甘草酸和甘草素的標準曲線；

色譜條件如下：

檢測波長：236nm；

色譜柱：C18色譜柱；

流動相：流動相A為乙腈水，流動相B為0.1％的磷酸水溶液；

梯度洗脫程序如下：

(2)待測樣品中7種成分的含量測定：

c、供試品溶液的制備：

取待測栝樓桂枝滴丸粉末，加甲醇提取，過濾得供試品溶液；優(yōu)選超聲提?。?/p>

d、供試品溶液的測定：

取供試品溶液，注入HPLC色譜儀，以步驟b相同的色譜條件檢測，根據(jù)步驟(1)的標準曲線得到待測樣品中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、肉桂酸、6-姜酚、甘草苷、甘草酸和甘草素的含量。

現(xiàn)代藥理研究表明，芍藥苷可能通過改善缺血側(cè)大腦血流供應(yīng)、提高機體消除自由基能力等對缺血大腦產(chǎn)生神經(jīng)保護作用；芍藥內(nèi)酯苷可透過血腦屏障進入腦組織，對腦缺血再灌注損傷的大鼠起到神經(jīng)保護作用；肉桂酸為栝樓桂枝湯入血成分，提示其可能與復方在體內(nèi)抗腦卒中后肢體痙攣有一定關(guān)系；6-姜酚可能通過抑制腦組織脂質(zhì)過氧化、抗血小板聚集等起到神經(jīng)保護作用；甘草苷可能通過抑制髓過氧化物酶和細胞間黏附因子-1表達等抗腦缺血再灌注損傷；甘草酸的腦保護作用可能是其抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡等基本藥理作用綜合的結(jié)果；甘草素較易通過血腦屏障，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

因此，本發(fā)明方法通過準確可靠、簡便快速地測定栝樓桂枝滴丸中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、肉桂酸、6-姜酚、甘草苷、甘草酸和甘草素的含量，為全面監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量提供了有效的保障。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1上圖為混合對照品的HPLC，下圖為樣品液的HPLC，1:芍藥內(nèi)酯苷；2:芍藥苷；3:甘草苷；4:甘草素；5:肉桂酸；6:甘草酸；7:6-姜酚。

圖2為栝樓桂枝滴丸滴丸體外溶出曲線。

具體實施方式

實施例1活性組分(栝樓桂枝湯浸膏粉)的制備

處方：栝樓30g，桂枝9g，白芍9g，生姜9g，大棗9g，甘草6g。

取處方比例的各味藥材，加10倍量(720mL)的水，煎煮2次，每次1.5h，合并煎液，濾過，濃縮至溶液濃度0.3g生藥/mL，離心30min，離心轉(zhuǎn)速為3000r·min^-1，濾過，即得上樣液；取上樣液經(jīng)HPD-100型大孔樹脂柱分離純化，純化工藝為：最大上樣量為2.5g生藥·g^-1，吸附流速為2BV·h^-1，洗脫劑為70％乙醇，洗脫流速為3BV·h^-1，洗脫劑用量為6BV；合并收集70％乙醇洗脫液，濃縮，減壓干燥，粉碎，即得活性組分。

實施例2本發(fā)明栝樓桂枝滴丸的制備

按3:2:1比例取聚乙二醇4000、聚乙二醇6000和實施例1制備的栝樓桂枝湯浸膏粉，混合均勻，90℃下加熱熔融，按以下條件滴制成丸：滴速為20滴·min^-1、滴距為2cm、冷凝溫度為10℃。

實施例3本發(fā)明栝樓桂枝滴丸的工藝篩選

1儀器與材料

XS105型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；HH-1型恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；CJJ78-1型磁力加熱攪拌器(金壇市城東新瑞儀器廠)；DLSB型低溫冷卻循環(huán)泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；LB-2D型崩解時限測定儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；游標卡尺。

栝樓桂枝湯浸膏粉(實施例1的方法制備)；聚乙二醇4000(批號：20150120)、聚乙二醇6000(批號：20130408)，購自國藥集團化學試劑有限公司；水為超純水。

2方法與結(jié)果

2.1滴丸的配方篩選

(1)基質(zhì)的篩選

本實驗以藥液粘稠度、滴制的難易程度、滴丸的外觀質(zhì)量為考察指標，在藥物與基質(zhì)比例為1:5的條件下，分別以聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000-聚乙二醇6000(4:1、3:2、1:1、2:3、1:4)為基質(zhì)制備滴丸。滴制時除基質(zhì)設(shè)計為不同的水平外，其他條件均完全一致。結(jié)果見如表1。

表1不同基質(zhì)配比對滴丸成型的影響

結(jié)果顯示，以聚乙二醇4000為基質(zhì)時藥液較稀，滴制較難控制；以聚乙二醇6000作為基質(zhì)時藥液稠，滴制困難，滴丸成型率較低；而以聚乙二醇4000-聚乙二醇6000不同比例為基質(zhì)滴制，其中比例為3:2時，滴制容易，滴丸成型率高，外觀質(zhì)量良好。故本實驗選用聚乙二醇4000-聚乙二醇6000比例為3:2時作為滴丸基質(zhì)。

(2)基質(zhì)與藥物的配比篩選

將基質(zhì)與藥物以不同比例(3:1、4:1、5：1、6:1、7:1)混合制備滴丸，其他條件均完全一致。以藥液粘稠度、滴制的難易程度、滴丸的外觀質(zhì)量為考察指標。結(jié)果見表2。

表2基質(zhì)與藥物不同比例對滴丸成型的影響

結(jié)果顯示，當基質(zhì)與藥物的比例為4:1或5:1時，藥液粘稠適中，滴制容易，外觀質(zhì)量良好。進一步考慮到滴丸的載藥量小，服用劑量大，且藥物與基質(zhì)比例為1:4時，制得滴丸的丸重差異相對較小，故確定最佳基質(zhì)與藥物比例為4:1。

2.3滴丸成型工藝

滴丸的成型工藝作進一步優(yōu)化，以滴丸的圓整度(y1)、重量差異(y2)和溶散時限(y3)作為評價指標，采用加權(quán)評分法來評價滴丸質(zhì)量。圓整度評價中，y1＝L_最短徑/L_最長徑，根據(jù)y1值分成5擋，分別用1～5分表示，其中分數(shù)越低越好。滴丸的重量差異檢測為:取20粒滴丸，稱定質(zhì)量，計算其RSD值；溶散時限按《中國藥典》2015年版四部溶散時限項目來進行。結(jié)果進行綜合評分，綜合評分＝y(tǒng)1×0.3+y2×0.3+y3×0.4，其數(shù)值越小越好，結(jié)果見表3。

表3不同滴速、滴距、藥液溫度和冷凝溫度參數(shù)組合的篩選

可以看出，滴速為20滴·min^-1、滴距為2cm、滴制溫度為90℃、冷凝溫度為10℃時，栝樓桂枝滴丸的綜合評分顯著優(yōu)于其他工藝參數(shù)組合。

綜上，最終的成型工藝確定藥物與基質(zhì)比例為1:4，滴速為20滴·min^-1，藥液溫度為90℃，滴距為2cm，冷凝溫度為10℃。以此工藝制備滴丸3批，并對制得滴丸進行質(zhì)量評價，滴丸的外觀質(zhì)量好，丸質(zhì)量差異系數(shù)和溶散時限均較小，結(jié)果如表4所示。

表4工藝驗證實驗結(jié)果

結(jié)果顯示，滴丸圓整，外觀質(zhì)量良好，丸重變異系數(shù)RSD在3.27％～3.35％，溶散時限在4.62～4.77min，表明該制備工藝穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性良好。符合《中國藥典》2015年版滴丸劑項下規(guī)定，質(zhì)量無顯著性差異，此制備工藝簡單合理，穩(wěn)定可行。

實施例4本發(fā)明栝樓桂枝滴丸的質(zhì)量檢測

為了有效控制滴丸制劑的質(zhì)量和療效，本實驗對該制劑進行了質(zhì)量標準和體外溶出度研究，為有效控制制劑的質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

1儀器與材料

U-3000型高效液相色譜儀(美國戴安公司)；XS105型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RCZ-6C1型藥物溶出度儀(上海黃海藥檢儀器廠)。

栝樓桂枝滴丸(實施例2的方法制備)；芍藥苷(批號：110736-201539)、芍藥內(nèi)酯苷(批號：16021410)、肉桂酸(批號：110786-200503)、甘草苷(批號：111610-201106)，購自中國藥品生物制品研究院；6-姜酚(批號：PZ9M6R1)、甘草酸(批號：Z30A6B1)、甘草素(批號：ZMO314BD14)，購自上海源葉生物科技有限公司；色譜級乙腈，購自德國默克公司；水為超純水。

2方法與結(jié)果

2.1含量測定

2.1.1色譜條件DIKMA C₁₈色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相為乙腈-0.1％磷酸，梯度洗脫條件見表5；流速0.8ml·min^-1；柱溫30℃；進樣體積10μL，檢測波長為236nm；色譜圖見圖1。

表5 HPLC梯度洗脫條件

2.1.2線性范圍考察精密稱取芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、肉桂酸、6-姜酚、甘草苷、甘草酸和甘草素對照品適量，用甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為3.450mg·ml^-1、1.498mg·ml^-1、116μg·ml^-1、127μg·ml^-1、0.999mg·ml^-1、751μg·ml^-1、49μg·ml^-1的對照品貯備液。精密量取5mL至50mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度搖勻。依次吸取2，5，8，10，15，20，25，30μL對照品液注入高效液相色譜儀，以進樣量(X)為橫坐標，色譜峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線，見表6。

表6栝樓桂枝滴丸7種指標成分的回歸方程

2.1.2供試品溶液的制備 取栝樓桂枝滴丸適量，研細，取細粉約0.5g，精密稱定，置于25mL容量瓶中，加甲醇20mL，超聲提取30min，冷卻后用甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.3精密度試驗 分別精密吸取同一對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件，重復進樣6次進行測定，測得芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、肉桂酸、6-姜酚、甘草苷、甘草酸和甘草素的峰面積RSD％分別為0.52％、0.76％、0.44％、0.61％、0.53％、0.57％和0.76％，表明該方法儀器精密度良好。

2.1.4穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液，分別于配置后0，2，4，6，8，12h按2.1.1項下色譜條件進樣測定。測得芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、肉桂酸、6-姜酚、甘草苷、甘草酸和甘草素的峰面積RSD％分別為1.16％、1.62％、1.54％、1.61％、1.96％、1.19％和1.75％，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5重復性試驗 取滴丸細粉6份，按2.1.2項下制備供試品溶液，2.1.1項下色譜條件測定，測得芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、肉桂酸、6-姜酚、甘草苷、甘草酸和甘草素的峰面積RSD％分別為1.29％、2.67％、2.38％、1.99％、1.62％、2.25％和1.81％，表明該方法重復性良好。

2.1.6加樣回收率試驗 取滴丸細粉6份，精密稱定，每份約0.5g，各精密加入對照品溶液適量，按2.1.2項下制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件測定，測定芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、肉桂酸、6-姜酚、甘草苷、甘草酸和甘草素的加樣回收率，結(jié)果見表7。

表7栝樓桂枝滴丸中7種成分加樣回收率測定結(jié)果

2.1.7供試品含量測定 取三批栝樓桂枝滴丸，分別按2.1.2項下制備供試品溶液，2.1.1項下色譜條件測定，結(jié)果見表8。

表8三批供試液中7種成分的含量(n＝3)(mg·g^-1)

2.2體外溶出度測定

2.2.1滴丸體外溶出度試驗 參照《中國藥典》2015年版，采用轉(zhuǎn)籃法測定。取滴丸適量，平行6份，以水為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100r·min^-1，溫度為37±0.5℃，依法測定，分別于1、2、5、8、10、15、20、25、30min取樣5mL(同時補充等量等溫溶出介質(zhì))，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按2.1.1項下色譜條件測定7種成分的濃度，計算累積溶出率，繪制時間-累積溶出率曲線，見圖2。結(jié)果表明，栝樓桂枝滴丸7種成分在15min內(nèi)累計溶出率均達到98％以上。

在供試品溶液的制備中，主要對提取方法和提取溶劑進行了考察。

首先比較了超聲、回流兩種提取方法對7種成分提取率的影響，表9的結(jié)果表明，超聲提取法提取率均高于回流提取且超聲提取方法簡便快捷，最終確定提取方法為超聲提取法；提取溶劑考察了甲醇和70％乙醇。表10的結(jié)果表明，甲醇除肉桂酸之外對其他6種成分的提取率均高于70％乙醇，綜合考慮，確定提取溶劑為甲醇。

表9提取方法考察結(jié)果(mg·g^-1)

表10提取溶劑考察結(jié)果(mg·g^-1)

以下通過試驗例證明本發(fā)明的有益效果。

試驗例

福建省第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑栝樓桂枝顆粒(批文為：2013S0001)的說明書中，標明12g/包，每日3包，共需服藥量為36g·d^-1；現(xiàn)改為滴丸后，日處方量藥材經(jīng)大孔樹脂純化后，得到浸膏為0.79g，因成型后滴丸最佳工藝基質(zhì)用量確定為浸膏量的5倍，即3.95g，所以最后滴丸的服用量為4.74g·d^-1，平均每粒滴丸丸重為35mg，有效減少了患者的服用劑量。

綜上所述，本發(fā)明的栝樓桂枝滴丸，療效顯著優(yōu)于栝樓桂枝顆粒，有效減少了患者的服用劑量，提高了患者的適從性。并且，本發(fā)明的栝樓桂枝滴丸圓整度高，外觀質(zhì)量好，滴丸質(zhì)量差異系數(shù)和溶散時限均較小，質(zhì)量穩(wěn)定性高。本發(fā)明還公開了其質(zhì)量檢測方法，該方法可以有效測定栝樓桂枝滴丸中7種有效成分的含量，從而全面監(jiān)控其質(zhì)量。