本發(fā)明涉及3D打印領(lǐng)域，特別涉及一種組合物、含有該組合物的3D敷料及其制備方法。
背景技術(shù)：
：創(chuàng)面是正常皮膚(組織)在外界致傷因子如外科手術(shù)、外力、熱、電流、化學(xué)物質(zhì)、低溫以及機(jī)體內(nèi)在因素如局部血液供應(yīng)障礙等作用下所導(dǎo)致的損害。常伴有皮膚完整性的破壞以及一定量正常組織的丟失，同時，皮膚的正常功能受損，也稱為傷口或者創(chuàng)傷，創(chuàng)面修復(fù)既傷口修復(fù)。皮膚創(chuàng)面的修復(fù)和愈合是外科學(xué)研究的熱點與難點，嚴(yán)重?zé)齻⑻悄虿∽愫湍[瘤潰瘍等難愈性傷口更是創(chuàng)傷外科領(lǐng)域的棘手問題。目前臨床上主要采用藥物、手術(shù)等方法來修復(fù)創(chuàng)面，難以取得令人滿意的療效，給患者帶來了痛苦。而移植脂肪成活率較低也極大地限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力和分化能力的多潛能細(xì)胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學(xué)界將其稱之為“萬用細(xì)胞”。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)是存在于脂肪組織中的干細(xì)胞，具有多向分化的潛能。相對于其它種子細(xì)胞，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有來源廣泛、含量豐富、分離簡單、體外擴(kuò)增穩(wěn)定容易、不涉及倫理問題、便于自體移植、免疫原性低、對供區(qū)損傷小等優(yōu)勢，備受外科醫(yī)生的重視。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供一種組合物、含有該組合物的3D敷料及其制備方法。本發(fā)明利用3D打印技術(shù)打印本發(fā)明提供的3D敷料，用于皮膚創(chuàng)面的修復(fù)和愈合。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種組合物，包括如下組分：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可以有效促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合，它在體內(nèi)外均可向皮膚表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞分化，分泌多種生物活性分子限制炎癥和凋亡，促進(jìn)血管形成，參與損傷修復(fù)等，最終實現(xiàn)促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。低免疫原性的脫細(xì)胞生物材料因具有天然特定的三維結(jié)構(gòu)、富含活性因子等特點在一定程度上解決了脂肪細(xì)胞成活率低的問題。同時，支架材料也可以為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提供合適的生存和分化環(huán)境，選擇合適的生物支架材料可以提高創(chuàng)面修復(fù)的效果。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述的組合物包括如下組分：在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述的組合物包括如下組分：在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述的組合物包括如下組分：在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述的組合物包括如下組分：在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述的組合物包括如下組分：在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述的組合物包括如下組分：在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述的組合物包括如下組分：在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述生物大分子物質(zhì)為殼多糖。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述生長因子為EGF。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)為人脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)凍干粉。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述組合物中的溶劑為Lonza。所述組合物中各組分的質(zhì)量百分含量之和為100％，所述溶劑的加入量為100％減去生物大分子物質(zhì)、膠原蛋白、生長因子和脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)之后的余量。本發(fā)明還提供了所述的組合物在制備創(chuàng)傷修復(fù)的藥物和/或制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種3D敷料，包括所述的組合物。本發(fā)明還提供了一種如所述的3D敷料的制備方法，包括如下步驟：步驟1：獲得脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為0.9×105個/ml～1.1×106個/ml；步驟2：取脂肪干細(xì)胞、生物大分子物質(zhì)、膠原蛋白、生長因子、脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)和溶劑混合，調(diào)整pH值為7.2～7.4，制得支架材料溶液；步驟3：取步驟1所述的單細(xì)胞懸液與步驟2制得的支架材料溶液按照配方混合。具體的，獲得脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的單細(xì)胞懸液的方法為：取P3代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，加入消化液進(jìn)行消化，之后用適量血清終止消化，輕輕吹打；1500rpm，離心5min，棄上清，用4℃PBS洗滌細(xì)胞3次后重懸混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度約為107個/ml。本發(fā)明提供一種組合物、含有該組合物的3D敷料及其制備方法。含有該組合物的3D敷料能夠有效修復(fù)創(chuàng)面。本發(fā)明利用3D打印和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、支架相結(jié)合的技術(shù)，快速打印出一種用于修復(fù)皮膚創(chuàng)面的3D打印敷料。該3D敷料機(jī)械強(qiáng)度良好，可用手術(shù)鉗夾取，加入培養(yǎng)基后不松散，繼續(xù)培養(yǎng)過程中未見破碎和大幅降解。具體實施方式本發(fā)明公開了一種組合物、含有該組合物的3D敷料及其制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的組合物、含有該組合物的3D敷料及其制備方法中所用原料及試劑均可由市場購得。下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實施例1：人脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)的制備在超凈臺內(nèi)，用PBS緩沖液清洗標(biāo)本3次。將脂肪組織剪成3-5mm厚的組織塊，置于低滲三羥甲基氨基甲烷緩沖液(含10mmol/L三羥甲基氨基甲烷、5mmol/LEDTA)中，-80℃冷凍、37℃水浴復(fù)溫，反復(fù)凍融5次；0.25％胰蛋白酶處理6h，無菌PBS緩沖液沖洗30min，3次；異丙醇處理36h，無菌PBS緩沖液沖洗30min，3次；0.25％胰蛋白酶處理6h,無菌PBS緩沖液沖洗30min，3次；5×107U/LDNase-I及1×106U/LDNase-A處理16h,無菌PBS緩沖液沖洗30min，3次；異丙醇處理8h，無菌PBS緩沖液沖洗30min，3次。所有溶液均添加雙抗(100U/mL青霉素、0.1mg/mL鏈霉素)，處理過程均在持續(xù)均勻攪拌下進(jìn)行，-40℃過夜后置于真空凍干機(jī)24h凍干，環(huán)氧乙烷低溫消毒后密封備用。實施例2：人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)超凈臺內(nèi)，用移液管吸棄脂肪組織下層液體，用移液管加入等體積的細(xì)胞清洗液，蓋上瓶蓋后上下顛倒搖晃，靜置至明顯分層；吸棄脂肪組織下層溶液(重復(fù)一次)。用移液管將脂肪組織均勻分至50ml離心管中，補(bǔ)加細(xì)胞清洗液至40ml，1500rpm離心5min。用移液管吸棄上層脂肪油和下層液體，每管加入脂肪組織等體積的0.5％I型膠原酶溶液，封口后水平前后搖晃，充分混合均勻。轉(zhuǎn)移至恒溫振蕩器中，37℃、200R消化30-50min，直至脂肪完全消化。離心管配平后放入離心機(jī)，1500rpm離心5min。用移液管吸棄油層，并倒棄剩余液體，加入40ml細(xì)胞清洗液重懸細(xì)胞沉淀，離心管配平后放入離心機(jī)內(nèi)，1500rpm離心5min。離心結(jié)束后，倒棄上清，Lonza培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞接種于15cm培養(yǎng)皿中，每20ml脂肪接種1個15cm皿，每皿加入20ml細(xì)胞懸液，10ng/mlEGF。48h后，對原代細(xì)胞進(jìn)行換液，獲得人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞(P0)，再經(jīng)傳代培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)80-90％即得人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞。實施例3：敷料取P3代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，加入消化液進(jìn)行消化，之后用適量血清終止消化，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液。1500rpm,離心5min，棄上清，用4℃PBS洗滌細(xì)胞3次后重懸混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度約為107個/ml。在50ml離心管中，按配方先后加入殼多糖、I型膠原、EGF、人脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)凍干粉、Lonza，每一步充分?jǐn)嚢杌靹?，并?mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值至7.2-7.4，形成支架材料溶液。組分含量P3代脂肪干細(xì)胞(實施例1獲得)0.9×105個/ml～1.1×105個/ml殼多糖1.8～2.2％I型膠原0.4～0.6％EGF4.5～5.5ng/mL人脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)凍干粉2.5～3.5％Lonza(溶劑)余量取單細(xì)胞懸液與支架材料溶液按配方濃度混勻。實施例4：敷料取P3代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，加入消化液進(jìn)行消化，之后用適量血清終止消化，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液。1500rpm,離心5min，棄上清，用4℃PBS洗滌細(xì)胞3次后重懸混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度約為107個/ml。在50ml離心管中，按配方先后加入殼多糖、I型膠原、EGF、人脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)凍干粉、Lonza，每一步充分?jǐn)嚢杌靹?，并?mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值至7.2-7.4，形成支架材料溶液。組分含量P3代脂肪干細(xì)胞(實施例1獲得)4.5×105個/ml-5.5×105個/ml殼多糖1.5-2.5％I型膠原0.4-0.6％EGF4.5-5.5ng/mL人脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)凍干粉4.5-5.5％Lonza(溶劑)余量取單細(xì)胞懸液與支架材料溶液按配方濃度混勻。實施例5：敷料取P3代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，加入消化液進(jìn)行消化，之后用適量血清終止消化，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液。1500rpm,離心5min，棄上清，用4℃PBS洗滌細(xì)胞3次后重懸混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度約為107個/ml。在50ml離心管中，按配方先后加入殼多糖、I型膠原、EGF、人脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)凍干粉、Lonza，每一步充分?jǐn)嚢杌靹颍⒂?mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值至7.2-7.4，形成支架材料溶液。取單細(xì)胞懸液與支架材料溶液按配方濃度混勻。實施例6：敷料取P3代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，加入消化液進(jìn)行消化，之后用適量血清終止消化，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液。1500rpm,離心5min，棄上清，用4℃PBS洗滌細(xì)胞3次后重懸混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度約為107個/ml。在50ml離心管中，按配方先后加入殼多糖、I型膠原、EGF、人脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)凍干粉、Lonza，每一步充分?jǐn)嚢杌靹?，并?mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值至7.2-7.4，形成支架材料溶液。組分含量P3代脂肪干細(xì)胞(實施例1獲得)1×105個/ml殼多糖2％I型膠原0.5％EGF5ng/mL人脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)凍干粉3％Lonza(溶劑)余量取單細(xì)胞懸液與支架材料溶液按配方濃度混勻。實施例7：敷料取P3代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，加入消化液進(jìn)行消化，之后用適量血清終止消化，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液。1500rpm,離心5min，棄上清，用4℃PBS洗滌細(xì)胞3次后重懸混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度約為107個/ml。在50ml離心管中，按配方先后加入殼多糖、I型膠原、EGF、人脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)凍干粉、Lonza，每一步充分?jǐn)嚢杌靹?，并?mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值至7.2-7.4，形成支架材料溶液。組分含量P3代脂肪干細(xì)胞(實施例1獲得)4.5×105個/ml殼多糖2％I型膠原0.5％EGF5ng/mL人脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)凍干粉5％Lonza(溶劑)余量取單細(xì)胞懸液與支架材料溶液按配方濃度混勻。實施例8：敷料取P3代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，加入消化液進(jìn)行消化，之后用適量血清終止消化，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液。1500rpm,離心5min，棄上清，用4℃PBS洗滌細(xì)胞3次后重懸混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度約為107個/ml。在50ml離心管中，按配方先后加入殼多糖、I型膠原、EGF、人脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)凍干粉、Lonza，每一步充分?jǐn)嚢杌靹?，并?mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值至7.2-7.4，形成支架材料溶液。組分含量P3代脂肪干細(xì)胞(實施例1獲得)1×106個/ml殼多糖2％I型膠原0.5％EGF5ng/mL人脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)凍干粉5％Lonza(溶劑)余量取單細(xì)胞懸液與支架材料溶液按配方濃度混勻。實施例9：3D敷料制備(1)3D建模利用CAD/CAM等矢量建模軟件，實現(xiàn)3D建模。利用3D打印機(jī)內(nèi)置的激光器對需修復(fù)傷口處進(jìn)行掃描，獲得傷口的大小、形狀、厚薄及患者正常皮膚的表皮真皮厚度等數(shù)據(jù)，然后利用PlyEdit軟件對掃描后的圖像進(jìn)行消除數(shù)字噪音等處理并對其進(jìn)行編輯，使之產(chǎn)生一個連續(xù)的表面圖像；利用Studio4.0軟件將圖像轉(zhuǎn)化為立體光刻(.STL)文件并導(dǎo)入至SolidWorks軟件，使掃描后的潰瘍表面圖像轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€虛擬立體圖像(或模塊)，可以用來直接打印出對應(yīng)的敷料。(2)3D打印敷料利用已經(jīng)建好的3D敷料模具，將細(xì)胞和支架材料混合液一層一層噴涂在基材上，打印的層數(shù)和具體的量根據(jù)不同患者以及患者的不同部位而變化，打印完成后，等待其凝固，形成3D敷料。(3)打印后處理待敷料凝固后，將敷料從基材上剝離下來，并放在培養(yǎng)基(Lonza、10％FBS，0.1％青、鏈霉素)中于37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)。實施例10：3D敷料評價(1)3D敷料質(zhì)量檢測：對實施例3-8制得的醫(yī)用敷料進(jìn)行微生物檢測和內(nèi)毒素檢測檢測。其中，微生物檢測(細(xì)菌、真菌)根據(jù)2015年版中華人民共和國藥典第4部通則1100進(jìn)行檢測；內(nèi)毒素檢測根據(jù)2015年版中華人民共和國藥典第4部通則1143進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果：實施例3-8制得的生物制劑在細(xì)菌、真菌和內(nèi)毒素的檢測中，均呈陰性。說明了該干細(xì)胞制劑的質(zhì)量合格，可用于創(chuàng)口的修復(fù)。(2)力學(xué)性能評價利用鑷子夾，觀察實施例3-8制得的3D敷料是否破碎，以此來判斷敷料的彈性和韌性；并且觀察剛打印的敷料和培養(yǎng)10天后的敷料在形狀、厚度、彈性上是否有明顯的變化。結(jié)果顯示：實施例3-8制得的3D敷料機(jī)械強(qiáng)度良好，可用手術(shù)鉗夾取，加入培養(yǎng)基后不松散，繼續(xù)培養(yǎng)過程中未見破碎和大幅降解。實施例11：3D敷料的創(chuàng)傷修復(fù)效果檢測取70只小鼠，將小鼠常規(guī)飼養(yǎng)3d后，腹腔注射10％水合氯醛麻醉，每100g體重注射1ml10％水合氯醛。剃去背部毛，在背部制成一個深入皮下的1cm*1cm的創(chuàng)面，造成小鼠創(chuàng)傷模型。將小鼠分為7組，其中一組為對照組，其余6組為實驗組。對照組用無菌紗布包扎傷口，其余6組小鼠分別用實施例3～8制得的3D敷料進(jìn)行治療，7天后觀察小鼠的傷口愈合程度，結(jié)果如表1所示：表1*表示與對照組相比具有顯著性差異，P<0.05。表1試驗結(jié)果表明，本發(fā)明實施例3～8制備的3D敷料與對照組相比，顯著(P<0.05)提高了小鼠的傷口愈合程度。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3