本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種提高紅景天抗氧化能力的發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
紅景天，屬景天科多年生草本或灌木植物，是生長(zhǎng)在1700米以上的珍稀野生植物，高寒缺氧的生長(zhǎng)環(huán)境賦予其極頑強(qiáng)的生命力，被譽(yù)為“高原人參”。生長(zhǎng)在我國(guó)的紅景天有72種，全世界大約有90多個(gè)品種，我國(guó)的主要品種有高山紅景天、圣地紅景天、大花紅景天、狹葉紅景天、小叢紅景天、菱葉紅景天、帕里紅景天、玫瑰紅景天等等。紅景天含有多種化學(xué)成分，包括黃酮類、皂苷類、氨基酸類、酚類、香豆素類、揮發(fā)油,以及多糖等常見的大分子物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)紅景天可提高缺氧耐受力、抗疲勞、抗氧化、抗衰老、提高免疫力、抗癌、保護(hù)肝臟、并且具有抗福射、抗焦慮等作用。紅景天提取物具有抗氧化作用,能明顯改善機(jī)體缺氧環(huán)境。對(duì)酒精性肝損傷和應(yīng)激引起的肝損傷具有保護(hù)作用,機(jī)制是由于紅景天提取物具有抗氧化能力,可以通過清除自由基及其代謝產(chǎn)物,抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。
發(fā)酵是中藥炮制的一個(gè)重要方面，借助于酶和微生物的作用，在一定環(huán)境條件下(如溫度、濕度、空氣、水分等)，使藥物通過發(fā)酵作用，其有效成分被充分分離、提取，改變其原有性能，增強(qiáng)或產(chǎn)生新的功效，擴(kuò)大用藥品種，以適應(yīng)臨床用藥的需要。經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后，中藥更具有生物活性。目前,中草藥的微生物發(fā)酵技術(shù)已成為提高中草藥活性成分、降低副作用、增強(qiáng)藥效的重要手段。紅景天具有抗氧化活性已被廣泛認(rèn)可,但其抗氧化作用的主要活性成分還尚不明確。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述問題，本發(fā)明利用微生物發(fā)酵制藥技術(shù)來提高紅景天提取液的抗氧化能力，增強(qiáng)其藥效。紅景天經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后,其化學(xué)成分會(huì)發(fā)生改變，從而改變了抗氧化能力。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種提高紅景天抗氧化能力的發(fā)酵方法，包括如下步驟：
(1)紅景天的預(yù)處理：將紅景天切片粉碎至40-60目；干燥使含水量為3％-5％，所述干燥溫度為60-80℃，干燥時(shí)間2-3小時(shí)，即得紅景天粉，備用；
(2)紅景天提取液的制備：將步驟(1)所得紅景天粉和蒸餾水按料水比1:25的比例混合，100℃提取兩次，每次一小時(shí)，八層紗布過濾后混合提取液，補(bǔ)足水分，將提取液在4℃沉降過夜，5000rpm離心20-30分鐘除雜，上清液用于配制發(fā)酵培養(yǎng)基；
(3)種子培養(yǎng)基的配制：組成為10g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、3g/L硝酸鈉、1.5g/L磷酸二氫鉀、2g/L七水硫酸鎂、0.01g/L七水硫酸亞鐵，121℃滅菌20min；
(4)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：將步驟(2)所得的紅景天提取液加入0.5％-2％的葡萄糖中，121℃滅菌20min；
(5)發(fā)酵方法：使用無菌生理鹽水清洗生長(zhǎng)7天的黑曲霉斜面上的孢子，4層紗布過濾除雜，使用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，再稀釋至孢子數(shù)為107個(gè)/ml，按2％-5％的接種量接種至種子培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，再按5％-10％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28-30℃200rpm培養(yǎng)2-3天。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下有益效果：通過微生物與中藥共發(fā)酵來進(jìn)行中藥炮制，微生物發(fā)酵的次生代謝物與藥物成分發(fā)生協(xié)同作用可增強(qiáng)藥效，使得紅景天提取液的抗氧化能力提高，DPPH清除率由35％提高至75％。微生物的分解作用可將藥材中的有毒物質(zhì)分解，或者對(duì)其進(jìn)行修飾使其毒性降低。進(jìn)人人體后不能直接被利用的藥物有效活性組分，可利用發(fā)酵技術(shù)在體外完成轉(zhuǎn)化而使之能被機(jī)體直接利用，迅速發(fā)揮應(yīng)有效能。發(fā)酵保護(hù)中藥活性成分免遭破壞，使藥物的有效組分、活性物質(zhì)最大限度地得以提取、利用。使用黑曲霉發(fā)酵紅景天，節(jié)省藥材資源，保護(hù)環(huán)境，方法操作簡(jiǎn)單，成本低，周期短，是在溫和條件下提高紅景天藥效的方法，是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化、具有高科技水平的新技術(shù)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
(1)紅景天的預(yù)處理：將紅景天切片粉碎至全部過60目篩；再進(jìn)行干燥，所述干燥溫度為80℃，干燥時(shí)間3小時(shí)，使含水量5％,即得紅景天粉，備用。
(2)紅景天提取液的制備：將步驟(1)所得紅景天粉和蒸餾水按料水比1:25的比例混合，100℃提取兩次，每次一小時(shí)，八層紗布過濾后混合提取液，補(bǔ)足水分。將提取液在4℃沉降過夜，5000rpm離心30分鐘除雜，上清用于配制發(fā)酵培養(yǎng)基。
(3)種子培養(yǎng)基的配制：組成為10g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、3g/L硝酸鈉、1.5g/L磷酸二氫鉀、2g/L七水硫酸鎂、0.01g/L七水硫酸亞鐵，121℃滅菌20min；
(4)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：將步驟(2)所得的紅景天提取液加入2％的葡萄糖，分裝在500ml的錐形瓶中，每瓶裝液量100ml，121℃滅菌20min。
(5)發(fā)酵方法：使用無菌生理鹽水將生長(zhǎng)7天的黑曲霉斜面上的孢子洗下，4層紗布過濾除雜，使用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，再稀釋至孢子數(shù)為107個(gè)/ml，按2％的接種量接種至種子培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。再按5％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃200rpm培養(yǎng)3天。
實(shí)施例2
(1)紅景天的預(yù)處理：將紅景天切片粉碎40目；再進(jìn)行干燥，所述干燥溫度為60℃，干燥時(shí)間3小時(shí)，使含水量3％,即得紅景天粉，備用。
(2)紅景天提取液的制備：將步驟(1)所得紅景天粉和蒸餾水按料水比1:25的比例100℃提取兩次，每次一小時(shí)，八層紗布過濾后混合提取液，補(bǔ)足水分。將提取液在4℃沉降過夜，5000r離心30分鐘除雜，上清用于配制發(fā)酵培養(yǎng)基。
(3)種子培養(yǎng)基的配制：將10g葡萄糖、5g酵母粉、3g硝酸鈉、1.5g磷酸二氫鉀、2g七水硫酸鎂、0.01g七水硫酸亞鐵溶于水，定容至1L，分裝在500ml的錐形瓶中，每瓶裝液量100ml，121℃滅菌20min。
(4)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：將步驟(2)所得的紅景天提取液加入1％的葡萄糖，分裝在500ml的錐形瓶中，每瓶裝液量100ml，121℃滅菌20min。
(5)發(fā)酵方法：使用無菌生理鹽水將生長(zhǎng)7天的黑曲霉斜面上的孢子洗下，4層紗布過濾除雜，使用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，再稀釋至孢子數(shù)為107個(gè)/ml，按2％的接種量接種至種子培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。再按5％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃200rpm培養(yǎng)2天。
實(shí)施例3
(1)紅景天的預(yù)處理：將紅景天切片粉碎，過50目篩，中粉及細(xì)粉留用，粗粉再粉碎，至全部過50目篩；再進(jìn)行干燥，所述干燥溫度為60℃，干燥時(shí)間2小時(shí)，使含水量5％,即得紅景天粉，備用。
(2)紅景天提取液的制備：將步驟(1)所得紅景天粉和蒸餾水按料水比1:25的比例100℃提取兩次，每次一小時(shí)，八層紗布過濾后混合提取液，補(bǔ)足水分。將提取液在4℃沉降過夜，5000rpm離心20分鐘除雜，上清液用于配制發(fā)酵培養(yǎng)基。
(3)種子培養(yǎng)基的配制：將10g葡萄糖、5g酵母粉、3g硝酸鈉、1.5g磷酸二氫鉀、2g七水硫酸鎂、0.01g七水硫酸亞鐵溶于水，定容至1L，分裝在500ml的錐形瓶中，每瓶裝液量100ml，121℃滅菌20min。
(4)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：將步驟(2)所得的紅景天提取液加入0.5％的葡萄糖，分裝在500ml的錐形瓶中，每瓶裝液量100ml，121℃滅菌20min。
(5)發(fā)酵方法：使用無菌生理鹽水將生長(zhǎng)7天的黑曲霉斜面上的孢子洗下，4層紗布過濾除雜，使用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，再稀釋至孢子數(shù)為107個(gè)/ml，按2％的接種量接種至種子培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。再按5％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃200rpm培養(yǎng)3天。
實(shí)施例4
DPPH清除率測(cè)定：量取2mL乙醇,取2mL DPPH溶液(0.2mM，溶于乙醇),混合振搖，室溫下避光靜置30min后,于517mn處測(cè)吸光度Ac；發(fā)酵液稀釋500倍精密量取2mL,再取2mL乙醇,振蕩，室溫下避光靜置30min后,于517nm處測(cè)吸光度Aj；精密量取稀釋500倍的發(fā)酵液2mL,再取2ml DPPH溶液,振蕩，30min后于517nm處測(cè)吸光度Ai。計(jì)算清除率:K＝[l-(Ai-Aj)/Ac]×l00％。實(shí)施例1-3所得的紅景天發(fā)酵液的DPPH清除率見表1。
表1實(shí)施例1-3所得紅景天發(fā)酵液的DPPH清除率
發(fā)酵前的紅景天提取液DPPH清除率為35％，經(jīng)過黑曲霉發(fā)酵，DPPH清除率大幅度提高，最高可達(dá)到75％，提高了114％。在黑曲霉的作用下紅景天的抗氧化性能得到了增強(qiáng)，提高了藥效。