本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種ROS響應(yīng)的腦卒中智能藥物載體及其制備方法。

背景技術(shù)：

隨著人類社會的不斷進步，社會老齡化問題日趨嚴(yán)重，腦血管疾病發(fā)生率也在逐年增加，并已成為當(dāng)前老年人疾病防治的重點。其中腦卒中是嚴(yán)重危害人類健康和生命安全的常見的難治性疾病，存在著明顯三高(發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高)現(xiàn)象，被列為人類僅次于心血管疾病和惡性腫瘤的第三大殺手。臨床上87％的腦卒中屬于缺血性腦卒中，所以，對缺血性腦卒中的藥物治療研究具有重大的臨床意義。生物體內(nèi)活性氧(ROS)包括：羥自由基(OH-)、過氧化氫、過氧亞硝基(ONOO-)等，許多生理反應(yīng)都會產(chǎn)生一定量的低水平ROS。研究表明：相較于正常生理條件，腦組織在腦卒中條件下會高水平持續(xù)性的產(chǎn)生ROS，過量的ROS會導(dǎo)致氧化性應(yīng)激并且損傷細(xì)胞內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等成分，從而造成局部細(xì)胞損傷。ROS水平提高和缺血性腦卒中的局部發(fā)病機制密切相關(guān)，腦卒中的典型損傷(缺血再灌注損傷)會產(chǎn)生持續(xù)大量ROS，并可同時加重最初的缺血性損傷。因此，針對腦缺血病灶部位高水平ROS的特性進行響應(yīng)敏感智能藥物載體的研究具有很大的前景。

NR2B9C是一種目前極有臨床前景的治療缺血性腦卒中的多肽，它由針對NMDA受體亞型NR2B羧基端的9個氨基酸殘基組成，可特異性的與PSD-95結(jié)合，解除NMDAR/PSD-95偶聯(lián)，阻斷引起神經(jīng)興奮性毒性的下游信號傳導(dǎo)，但不影響NMDA受體的正常生理功能。目前研究中NR2B9C均由源自HIV的Tat攜帶進入血液循環(huán)才能達(dá)到相應(yīng)的局部治療效果，但Tat在安全性方面存在很大爭議，臨床應(yīng)用前景也不容樂觀。所以，研究開發(fā)NR2B9C的腦卒中智能藥物傳遞系統(tǒng)，顯得非常重要。由于NR2B9C為親水性極強的小分子多肽，常見的膠束、納米粒等核-殼型結(jié)構(gòu)的載體對其包封率和載藥量都不理想。聚合物囊泡是由兩親性嵌段聚合物構(gòu)成的具有封閉雙層結(jié)構(gòu)的藥物遞送載體，內(nèi)部具有良好的親水環(huán)境，對親水性藥物具有很理想的包封作用。

葡聚糖是一種具有較好的生物相容性，生物可降解性，易修飾以及容易獲取的聚合物。研究表明，硼酸酯可作為具有ROS響應(yīng)特性的觸發(fā)基團，該基團較易響應(yīng)ROS介導(dǎo)的降解作用。通過可逆性化學(xué)修飾，將具有ROS響應(yīng)特性的疏水性硼酸酯接枝于親水葡聚糖骨架，使其形成兩親性結(jié)構(gòu)進而可以自主裝分散于水相，形成極具應(yīng)用前景的納米囊泡藥物載體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是，鑒于目前NR2B9C遞藥效率及安全性等方面存在的缺陷，提供一種ROS響應(yīng)的腦卒中智能藥物載體及制備方法，該載體極易響應(yīng)ROS介導(dǎo)的降解作用，使藥物在腦缺血病灶部位速釋同時減少在非病灶區(qū)釋放，從而更加安全有效的實現(xiàn)藥物遞送。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：ROS響應(yīng)的腦卒中智能藥物載體，是由以疏水性硼酸酯接枝于親水葡聚糖骨架形成的兩親性嵌段共聚物為載體材料制備的納米囊泡、該納米囊泡用于包載的神經(jīng)保護劑NR2B9C。納米囊泡載體具有規(guī)整的球形外觀，平均粒徑在120-220nm。

所述葡聚糖重均分子量為10000-25000。

所述疏水性硼酸酯為4-羥甲基笨硼酸頻哪醇酯(PBAP)、4-羥甲基苯硼一種或多種。所述NR2B9C的氨基酸序列為KLSSIESDV。

納米囊泡具有規(guī)整的球形外觀，平均粒徑在120-220nm。

所述硼酸酯與葡聚糖的接枝率為30±5％。

將硼酸酯與葡聚糖通過共價接枝，再將接枝反應(yīng)后的載體材料通過自主裝法制備成納米囊泡載體，并將神經(jīng)保護劑NR2B9C包載于所述納米囊泡載體中。

所述的ROS響應(yīng)的腦卒中智能藥物載體的制備方法，先將硼酸酯與葡聚糖通過共價接枝，再將接枝反應(yīng)后的材料通過自主裝法制備成納米囊泡；硼酸酯與葡聚糖的質(zhì)量比為10:5～25；

所述硼酸酯與葡聚糖共價接枝方法包括以下步驟：將4-羥甲基苯硼酸頻那醇酯(PBAP)與羰基二咪唑(CDI)溶于無水二氯甲烷，反應(yīng)30±10min后硫酸鎂干燥過夜，濃縮并真空干燥得白色固體(PBAP-CDI)；將葡聚糖(dextran，Mw＝10000～25000g/mol)溶于甲酰胺中，隨后分別加入PBAP-CDI、4-二甲氨基吡啶DMAP，室溫攪拌過夜；將反應(yīng)液通過透析法除去溶劑及未反應(yīng)的PBAP-CDI，冷凍干燥所得白色粉末(PHB-Dextran)即為硼酸酯與葡聚糖共價接枝產(chǎn)物。

所述自組裝法包括以下步驟：將一定量PHB-Dextran溶于甲醇與甲酰胺的混合溶劑作為有機相，將適量NR2B9C溶于0.2M Tris-HCl緩沖液，加入到上述有機相后分散到0.5％泊洛沙姆188水溶液中，繼續(xù)攪拌1-2h，然后透析除去有機溶劑及游離NR2B9C，溶液過0.45μm的微孔濾膜即得納米囊泡載體(NP/NR2B9C)。

制備納米囊泡時混合有機相中甲醇與甲酰胺的體積比為1:1～5。

NR2B9C與PHB-Dextran載體材料的質(zhì)量比為1:10～20。

本發(fā)明有益效果：

1、本發(fā)明合成出的腦卒中智能藥物載體，在合成路線與制備工藝上有較大改進：并采用透析法來提純載體材料及去除有機溶劑，合成出的材料溶解性良好，包封藥物能力較強；采用自組裝技術(shù)來制備納米載體，方法簡單易行，成本低。本發(fā)明制備出的ROS響應(yīng)的腦卒中智能藥物載體可將粒徑控制在165nm左右，具有較好的穩(wěn)定性。

2、本發(fā)明以ROS為智能釋藥開關(guān)，將神經(jīng)保護劑NR2B9C包封于具有ROS響應(yīng)的腦卒中智能藥物載體中，可使其在腦缺血病灶部位速釋藥物同時減少在非病灶區(qū)釋放，從而更加安全有效地將NR2B9C遞送到大腦卒中部位，最大限度發(fā)揮藥物的治療作用，同時減少全身毒副作用。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明所合成載體材料(PHB-Dextran)的分子式(上)與核磁共振圖譜(下)。

圖2為本發(fā)明ROS響應(yīng)的腦卒中智能藥物載體的透射電鏡圖。

圖3為本發(fā)明ROS響應(yīng)的腦卒中智能藥物載體的水解行為圖(分別對應(yīng)0.01M PBS緩沖體系和含有1mM H₂O₂的0.01M PBS緩沖體系拍攝的納米載體溶液的外觀照片；對應(yīng)0h(AB圖)0.25h(CD圖),0.5h(EF圖)，1h(HI圖),2h(JK圖),4h(LM圖)六個時間段，每個時間段兩幅照片。

圖4為本發(fā)明ROS響應(yīng)的腦卒中智能藥物載體的體外釋放圖。

圖5為本發(fā)明ROS響應(yīng)的腦卒中智能藥物載體的體內(nèi)藥效比較照片：分為四個組：假手術(shù)組(Sham)、模型組(MCAO)、游離(NR2B9C)組、腦卒中智能藥物載體(NP/NR2B9C)組，每組取視交叉前4mm及其后大腦做連續(xù)冠狀切片各取5片的五幅照片。

圖6、7為本發(fā)明ROS響應(yīng)的腦卒中智能藥物載體的體內(nèi)藥效學(xué)圖，(分別對應(yīng)**P<0.01,***P<0.001)。

具體實施方式：

下面結(jié)合具體實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的闡述，具體實施例是在本發(fā)明的優(yōu)選條件下進行。所述方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所述原材料如無特別說明均能從公開商業(yè)途徑而得。

實施例1

載體材料PHB-Dextran的制備與表征

將4-羥甲基苯硼酸頻那醇酯(PBAP,7.37g,31.5mmol)與羰基二咪唑(CDI,10.20g,62.9mmol)溶于無水二氯甲烷，反應(yīng)30min。純水洗三次(3×10ml)，鹽水洗一次(1×10ml)，硫酸鎂干燥過夜，濃縮并真空干燥得白色固體(PBAP-CDI)。將葡聚糖(dextran，Mw＝10000g/mol)溶于4ml甲酰胺中，隨后分別加入PBAP-CDI、DMAP，室溫攪拌過夜。將反應(yīng)液用透析袋(截留分子量500Da，透析介質(zhì)為純水)透析除去甲酰胺及游離PBAP-CDI，冷凍干燥得白色粉末(PHB-Dextran)。核磁共振儀檢測其核磁圖譜，見圖1。

實施例2

ROS響應(yīng)腦卒中智能藥物載體的制備與表征

采用自組裝法制備，稱取10mg PHB-Dextran溶于甲酰胺與甲醇的混合溶劑(V:V＝1:1)作為有機相，稱取1mg NR2B9C溶于0.2M Tris-HCl緩沖液，與有機相混合后逐滴分散到不斷攪拌(500rpm，37℃)的10ml 0.5％泊洛沙姆188水溶液中，繼續(xù)攪拌1-2h，透析(截留分子量50kDa，透析介質(zhì)為純水)24h后，過0.45μm微孔濾膜即得納米囊泡載體(NP/NR2B9C)，用透射電鏡表征其形態(tài)見圖2。圖2中顯示透射電鏡下觀察該納米囊泡載體具有規(guī)整的球形外觀，大小均勻，粒徑在165nm左右。激光粒度分析表明，所得納米囊泡載體以170nm為有效直徑并呈正態(tài)分布，多分散性為0.018。包封率為60％，載藥量為2.91％。

實施例3

ROS響應(yīng)腦卒中智能藥物載體的水解行為

將制備好的納米囊泡載體(NP)分成兩份，分別置于0.01M PBS緩沖體系和含有1mM H₂O₂的0.01M PBS緩沖體系中，37℃孵育。數(shù)碼相機分別于0,0.25,0.5，1,2,4h拍攝相片考察納米載體溶液的外觀變化，見圖3。由圖3中可見，加入1mM H₂O₂ 15min后納米囊泡載體的淡藍(lán)色乳光明顯減弱，30min后乳光消失變無色澄清，而無H₂O₂的PBS組外觀無明顯變化，此結(jié)果驗證了納米囊泡載體的水解行為具有ROS響應(yīng)特性。

實施例4

ROS響應(yīng)腦卒中智能藥物載體的體外釋放

包載羅丹明標(biāo)記的NR2B9C(Rhodamine-NR2B9C)納米囊泡載體制備方式同上。采用超濾離心法考察NP/Rhodamine-NR2B9C的釋藥行為，用1mM H₂O₂來模擬ROS水平升高的腦缺血病灶部位的微環(huán)境。釋放介質(zhì)分別為pH7.4的PBS磷酸鹽緩沖液和含有1mM H₂O₂的PBS磷酸鹽緩沖液。于37℃恒溫水浴，160rpm振蕩進行釋放實驗，平行操作3份。分別于0，0.5，1，2，4，8h時間點定時吸取介質(zhì)0.5mL，同時補充等量恒溫的新鮮釋放介質(zhì)。取出的介質(zhì)經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，置于超濾離心管(MWCO＝30000Da)中并以3500rpm 5min超濾離心，下層清夜稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，熒光分光光度計(EX:460nm,EM:525nm)測定并計算出累積釋放百分率。由圖4可知，H₂O₂組釋放藥物較快，4h時的累計釋藥量已接近50％。而PBS組釋放趨勢較平緩，4h時的累計釋藥量僅為15％左右。從上述結(jié)果可知，在H₂O₂存在條件下的累積釋放率顯著高于無H₂O₂存在的PBS組，驗證了納米囊泡載體釋藥行為的ROS響應(yīng)特性，這將有利于其進入腦組織后，在缺血細(xì)胞中ROS刺激下響應(yīng)，迅速釋放出藥物，修復(fù)已經(jīng)瀕臨死亡的神經(jīng)元。

實施例5

ROS響應(yīng)腦卒中智能藥物載體的體內(nèi)藥效學(xué)研究

健康雄性SD大鼠，隨機分為4組：假手術(shù)組(Sham)、模型組(MCAO)、游離NR2B9C組、腦卒中智能藥物載體(NP/NR2B9C)組，每組分別于腦損傷后，尾靜脈注射相應(yīng)處方。在腦缺血再灌注24h后，根據(jù)Zea-Longa建立的神經(jīng)功能缺損程度的五級四分法標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)地評分。缺血再灌注24h后，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，立刻斷頭取腦，橫斷面由前向后，取視交叉前4mm及其后大腦做連續(xù)冠狀切片(層厚2mm)，共取5片。將切片置于1％(質(zhì)量濃度)TTC染色液中，干燥箱內(nèi)37℃避光孵育30min，肉眼觀察正常腦組織呈玫紅色，梗死區(qū)腦組織呈白色。計算梗死灶面積百分比：梗死區(qū)面積Sn/梗死區(qū)所在半腦面積S’n×100％。Sn表示每單個鬧切片上梗死面積之和，S’n表示每單個梗死區(qū)所在的半腦面積之和(n＝1～5)。見圖5，TTC染色結(jié)果腦中玫紅色部位為正常腦組織，白色部位為梗死區(qū)域。圖中可知，假手術(shù)組未見梗死區(qū)域，模型組有較大程度的損傷，而NP/NR2B9C組的梗死面積可見明顯減小，說明NP/NR2B9C對腦損傷的保護作用明顯。由大腦梗死灶面積對比圖可見，NP/NR2B9C組較MCAO組可以明顯減少缺血梗死面積，統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P<0.001)。由神經(jīng)功能評分結(jié)果，可以看出NP/NR2B9C組的大鼠較MCAO組有較輕的神經(jīng)功能損傷，統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P<0.01)。以上結(jié)果均表明本發(fā)明的腦卒中智能藥物載體(NP/NR2B9C)可以安全有效地將NR2B9C遞送到大腦卒中部位，使其發(fā)揮治療作用。