本發(fā)明屬保健食品及藥品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種對化學性肝損傷有修復(fù)治療作用的組合物。
背景技術(shù)：
化學性肝損傷是指由化學性肝毒性物質(zhì)所造成的肝損傷。這些化學物質(zhì)包括酒精、環(huán)境中的化學毒物及某些藥物，尤其是酒精。近年來，酒精濫用和酒精依賴引起的疾病已經(jīng)成為當今世界日益嚴重的問題。在非病毒性肝病中，酒精性肝病發(fā)病率占據(jù)首位，酒精性脂肪肝已成為導(dǎo)致肝硬化的最主要病因。因此，開發(fā)預(yù)防和早期遏制酒精性肝損傷的保健食品或藥品顯得尤為重要。在當今“回歸自然”的世界潮流中，藥食同源中藥材的開發(fā)利用已受到世界各國的普遍關(guān)注，發(fā)達國家競相采用先進的科學技術(shù)進行其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)，搶占市場，藥食同源中藥材面臨前所未有的發(fā)展機遇和挑戰(zhàn)。因此，充分發(fā)揮傳統(tǒng)中藥的優(yōu)勢、特色，積極與現(xiàn)代提取、制劑技術(shù)相結(jié)合，大膽創(chuàng)新，改進生產(chǎn)加工工藝，生產(chǎn)安全可靠、質(zhì)量穩(wěn)定、功能確切、食用方便的高品質(zhì)功能產(chǎn)品，最大限度地提取富集有效成分，提高單位體積中產(chǎn)品的效用和價值，開發(fā)能預(yù)防和早期治療化學性肝損傷的保健食品和藥品，具有深刻的意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種以枸杞子提取物和駝血多肽為主要有效成分的對化學性肝損傷具有保護作用的組合物。經(jīng)動物實驗表明，該組合物對酒精、四氯化碳等引起的化學性肝損傷具有顯著的預(yù)防及修復(fù)作用。本發(fā)明所制備的新組合物具有協(xié)同增效作用，可用于預(yù)防或輔助治療化學性肝損傷的藥物或保健食品。
本發(fā)明的對化學性肝損傷有修復(fù)治療作用的組合物，包含有從枸杞子中提取的枸杞提取物和從駱駝血液中提取分離的駝血多肽；
所使用的枸杞提取物中，枸杞多糖含量等于或大于50％；駝血多肽中，多肽含量等于或大于50％。
作為優(yōu)選，所述的組合物中枸杞提取物和駝血多肽的比例為10～1:1。
本發(fā)明組合物中所使用的枸杞提取物，其制備方法如下：
1)將枸杞子經(jīng)高速剪切粉碎，按照料液比1:8～12加入純化水進行提?。惶崛囟葹?0℃，提取時間為1～3h，離心得到提取液；
2)將提取液用微濾膜除雜后，再用超濾膜進行濃縮，濃縮至體積為枸杞質(zhì)量的1.5～2.5倍時，在濃縮液中加入乙醇，使其乙醇濃度達到65％～90％，靜止6～12h；
3)棄去上清液，干燥得到枸杞提取物。
上述步驟1)中的高速剪切的轉(zhuǎn)速為8000～12000rpm，剪切時間為5～15min；
上述步驟2)中使用的微濾膜，孔徑大于50nm，壓力為2～10bar，溫度為30～50℃；使用的超濾膜，孔徑為2～10nm，壓力為5～35bar，溫度為30～50℃；
上述步驟3)中干燥方法為噴霧干燥、微波干燥、真空干燥、鼓風干燥中的一種。
本發(fā)明組合物所使用的駝血多肽，其制備方法如下：
1)將駝血經(jīng)高速剪切，再按照料液比1:5～8加入動物蛋白水解復(fù)合酶水溶液進行提??；
所述的動物蛋白水解復(fù)合酶水溶液的PH為5～5.5，其中動物蛋白水解復(fù)合酶的量為0.5％～1％，以駝血的量為基準；提取溫度為60℃，提取時間為1～3h；
2)提取結(jié)束后，迅速將溫度升至90℃，對動物蛋白水解復(fù)合酶進行滅活0.5h，然后降溫，離心，得到酶解液；
3)將酶解液通過超濾膜系統(tǒng)，得到酶解液Ⅰ，通過膜系統(tǒng)時壓力為2～10bar，溫度為20～35℃；
4)將酶解液Ⅰ通過納濾膜系統(tǒng)濃縮，得到酶解液Ⅱ，通過膜系統(tǒng)時壓力為10～25bar，溫度為20～35℃；濃縮至密度為1.05～1.15時，噴霧干燥得到駝血多肽產(chǎn)品。得到的產(chǎn)品經(jīng)HPLC檢測，多肽含量大于50％，無腥味，有淡淡的奶香味；
上述步驟1)中的高速剪切的轉(zhuǎn)速為8000～12000rpm，剪切時間為5～15min。
上述步驟3)中的超濾膜的分子量為10000～3000。
上述步驟4)中的納濾膜的分子量為1000～180。
在進一步的實施方式中，本發(fā)明所述的新組合物的用途是預(yù)防或輔助治療化學性肝損傷；
在進一步的實施方式中，本發(fā)明所述的新組合物包含枸杞提取物和駝血多肽以一定比例組成的組合物作為有效成分，和食品、保健食品、特殊醫(yī)學用途配方食品或藥品中可接受的輔料或添加劑。
將上述的組合物和食品、保健食品、特殊醫(yī)學用途配方食品或藥品中可接受的輔料或添加劑，按照相應(yīng)的制劑方法和工藝，可制成相應(yīng)的口服制劑，包括如普通片劑、泡騰片、咀嚼片、口含片等，或是如膠囊劑、顆粒劑、合劑、口服劑、丸劑、滴丸劑等。其中所述的食品、保健食品、特殊醫(yī)學用途配方食品或藥品中可接受的輔料包括填充劑、賦形劑、稀釋劑、崩解劑、粘合劑、矯味劑、發(fā)泡劑、潤滑劑等口服制劑中允許使用的常用輔料成分，也包括如溶劑、增稠劑、助溶劑、PH調(diào)節(jié)劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、膨松劑等。其中所述的食品、保健食品、特殊醫(yī)學用途配方食品可接受的添加劑包括微量元素、礦物質(zhì)、維生素、氨基酸、?；撬岬仁称?、保健食品、特殊醫(yī)學用途配方食品中允許使用的常用添加劑。
本發(fā)明的主要特點之一是利用現(xiàn)代提取分離技術(shù)得到具有顯著預(yù)防和輔助治療化學性肝損傷的枸杞提取物。申請人在長期的實驗摸索中，得到的枸杞提取物的制備方法與現(xiàn)有工藝相比更有優(yōu)越性，本方法沒有添加任何酸堿或酶，整個制備過程在60℃以下，避免了活性成分的損失，使用超濾膜濃縮，在除水同時，除去了沒有活性或活性較弱的寡糖和低分子量多糖，使單位質(zhì)量里活性大分子多糖的含量增加。
本發(fā)明的主要特點之二是使用了駝血多肽作為有效成分。駱駝以其特異的功能，超強的耐受力和頑強的生命力，奔馳在生命絕跡的沙漠戈壁之中，被親切稱之為“沙漠之舟”。特殊的環(huán)境使其血液與其它動物的血液相比，具有特殊的生理、營養(yǎng)功能?，F(xiàn)代研究表明：駱駝血中的白蛋白不僅明顯高于其它動物，而且具有異常高的生理活性。
本發(fā)明首次將以上兩種有效成分科學結(jié)合組成新的組合物。實驗表明，新的組合物具有協(xié)同增效預(yù)防和輔助治療化學性肝損傷的作用。
具體實施方式
以下為本發(fā)明的實施例，對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進一步的詳細說明。但不應(yīng)該就此理解為本發(fā)明上述主體的范圍僅限于以下的實施例。應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的核心技術(shù)的前提下，還可以做出改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)屬于本發(fā)明的專利保護范圍。與本發(fā)明的權(quán)利要求書相當?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都應(yīng)認為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
實施例1：
1)將1kg枸杞子粉碎，加入2L純化水，高速剪切20min，轉(zhuǎn)速10000rpm，然后加入10L純化水攪拌提?。惶崛囟葹?0℃，提取時間為2h，攪拌速度為120rpm，4500rpm離心得到提取液；
2)將提取液通過分子量為20萬的微濾膜，壓力為2.5bar，溫度為50℃，收集透過液再用3500分子量的超濾膜進行濃縮，壓力為10bar，溫度為35℃，濃縮至2L時，加入95％乙醇，使其乙醇濃度達到70％，靜止12h；
3)濾除并回收上清液，沉淀物真空干燥(溫度60℃，抽真空)得到枸杞提取物。
所得枸杞提取物呈淡紅色粉末，含水率5％，按照國標規(guī)定的硫酸苯酚法測定，枸杞多糖的含量為65％。按照中國藥典的規(guī)定對枸杞提取物的重金屬含量進行測定，測定結(jié)果為鉛＜0.2mg/kg，砷＜0.1mg/kg。
依據(jù)中國藥典規(guī)定的微生物限度檢測法對枸杞提取物進行微生物檢測，檢測結(jié)果如下：細菌總數(shù)＜1000cfu/g，霉菌總數(shù)＜20，大腸菌群、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均未檢出。
實施例2：
1)將10kg枸杞子粉碎，加入20L純化水，高速剪切4次，每次5min，轉(zhuǎn)速12000rpm。將剪切后的原料移入盛有100L純化水的提取罐中，攪拌提取1.5h；提取溫度為60℃，攪拌速度為120rpm，5000rpm管式離心得到提取液；將離心所得枸杞渣再加入提取罐中，加入100L的純化水，再次提取1.5h，溫度60℃，攪拌速度120rpm，5000rpm管式離心，合并2次的提取液。
2)將提取液通過分子量為15萬的微濾膜，壓力為2.5bar，溫度為50℃，收集透過液再用5000分子量的超濾膜進行濃縮，壓力為10bar，溫度為35℃，濃縮至25L時，加入95％乙醇，使其乙醇濃度達到70％，靜止12h；
3)濾除并回收上清液，沉淀物用5L純化水完全溶解，噴霧干燥(進風溫度180℃)得到枸杞提取物。
所得枸杞提取物呈黃色粉末，含水率4％。按照國標規(guī)定的硫酸苯酚法測定，枸杞多糖的含量為70％。重金屬和微生物均符合要求。
實施例3：
1)將2kg駝血解凍，高速剪切10min，8000rpm；加入盛有10L純化水的圓底燒瓶，加入100g動物蛋白水解復(fù)合酶，再加入檸檬酸使提取液的PH為5.5，提取溫度60℃，攪拌轉(zhuǎn)速120rpm，提取2h；
2)迅速將溫度升至90℃，攪拌0.5h，3500rpm離心得到酶解液；
3)將酶解液通過分子量為5000的超濾膜系統(tǒng)，得到酶解液Ⅰ，通過膜系統(tǒng)時壓力為10bar，溫度為35℃；
4)將酶解液Ⅰ通過分子量為180的納濾膜系統(tǒng)，得到酶解液Ⅱ，通過膜系統(tǒng)時壓力為25bar，溫度為35℃；濃縮至密度為1.05～1.15時，噴霧干燥得到白色駝血多肽產(chǎn)品，有奶香味。得到的產(chǎn)品經(jīng)HPLC檢測，多肽含量為68％。所得駝血多肽產(chǎn)品的重金屬和微生物均符合食品、保健食品和藥品中對重金屬和微生物的要求。
實施例4：
1)將50kg駝血解凍，高速剪切3次，每次5min，8000rpm；加入盛有300L純化水的提取罐，加入0.5kg動物蛋白水解復(fù)合酶，再加入檸檬酸使提取液的PH為5.5，提取溫度60℃，攪拌轉(zhuǎn)速120rpm，提取2h；
2)迅速將溫度升至90℃，攪拌0.5h，5000rpm管式離心得到酶解液；
3)將酶解液通過分子量為7500的超濾膜系統(tǒng)，得到酶解液Ⅰ，通過膜系統(tǒng)時壓力為10bar，溫度為35℃；
4)將酶解液Ⅰ通過分子量為350的納濾膜系統(tǒng)，得到酶解液Ⅱ，通過膜系統(tǒng)時壓力為25bar，溫度為35℃；濃縮至密度為1.05～1.15時，噴霧干燥得到白色駝血多肽產(chǎn)品，有奶香味。得到的產(chǎn)品經(jīng)HPLC檢測，多肽含量為76％。所得駝血多肽產(chǎn)品的重金屬和微生物均符合食品、保健食品和藥品中對重金屬和微生物的要求。
實施例5：枸杞提取物和駝血多肽的生物活性測定
四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷模型
1.實驗動物:清潔級成年雄性Wistar大鼠，大鼠(180～220克)，每組18只(最低要求實驗結(jié)束后每組10只)。
試驗方法和步驟
2.劑量分組及受試樣品給予時間
實驗設(shè)一個模型對照組，一個枸杞提取物治療組(200mg/kg)，一個駝血多肽治療組(100mg/kg)，一個本發(fā)明組合物高劑量治療組(200mg/kg枸杞提取物+100mg/kg駝血多肽)，一個本發(fā)明組合物中劑量治療組(150mg/kg枸杞提取物+75mg/kg駝血多肽)，一個本發(fā)明組合物低劑量治療組(100mg/kg枸杞提取物+50mg/kg駝血多肽)，以及一個空白對照組，灌胃給藥30天。大鼠CCl4肝損傷模型：CCl4:橄欖油＝4:6，40％CCl4 2ml/kg腹腔注射，每周2次，連續(xù)4周。
3.給予受試樣品的途徑
經(jīng)口灌胃給予受試樣品，無法灌胃時將受試樣品摻入飼料或飲水亦可，并記錄每只動物的飼料攝入量或飲水量。CCl4腹腔注射染毒。
4.結(jié)果檢測
4.1第31天采集血樣，血分離血清，測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)。結(jié)果見下表：
表1：本發(fā)明組合物對大鼠各指標的影響
注：各組別之間均具有顯著性差異。
如表1所示，四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷在給予枸杞提取物、駝血多肽和本發(fā)明組合物30天以后，各治療組的體重差值均比模型對照組大，本發(fā)明組合物治療組的體重差異最大，說明大鼠的生長受四氯化碳影響較大；肝臟指數(shù)、ALT、AST與為給予治療措施的對照組相比，具有顯著的下降，尤其是本發(fā)明組合物治療組下降最為明顯。結(jié)果表明將枸杞提取物和駝血多肽組合后，其高、中、低劑量組其輔助治療化學性肝損傷的效果均比單一的枸杞提取物或駝血多肽好，可以產(chǎn)生協(xié)同增效的作用。
實施例6：酒精誘導(dǎo)的肝損傷模型
1.實驗動物:清潔級成年雄性Wistar大鼠，大鼠(180～220克)，每組18只(最低要求實驗結(jié)束后每組10只)。
試驗方法和步驟
2.劑量分組及受試樣品給予時間
實驗設(shè)一個模型對照組，一個枸杞提取物治療組(200mg/kg)，一個駝血多肽治療組(50mg/kg)，一個本發(fā)明組合物治療組(200mg/kg+50mg/kg)，以及一個空白對照組，灌胃給藥30天。大鼠酒精肝損傷模型：50％酒精10ml/kg灌胃，連續(xù)4周。
3.給予受試樣品的途徑
經(jīng)口灌胃給予受試樣品，無法灌胃時將受試樣品摻入飼料或飲水亦可，并記錄每只動物的飼料攝入量或飲水量。
4.結(jié)果檢測
4.1第31天采集血樣，血分離血清，測定谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)。結(jié)果見下表：
表2：本發(fā)明組合物對大鼠各指標的影響
注：各組別之間均具有顯著性差異。
如表2所示，酒精誘導(dǎo)的肝損傷在給予枸杞提取物、駝血多肽和本發(fā)明組合物30天以后，各生理指標顯示將枸杞提取物和駝血多肽組合后，可以產(chǎn)生協(xié)同增效的預(yù)防或輔助治療化學性肝損傷的作用。
實施例7：酒精誘導(dǎo)的肝損傷模型
1.實驗動物:清潔級成年雄性Wistar大鼠，大鼠(180～220克)，每組18只(最低要求實驗結(jié)束后每組10只)。
試驗方法和步驟
2.劑量分組及受試樣品給予時間
實驗設(shè)一個模型對照組，三個本發(fā)明組合物治療組A、B、C，以及一個空白對照組。其中組合物A使用本發(fā)明所用的提取方法得到的枸杞提取物(200mg/kg+40mg/kg)，組合物B使用商品化枸杞多糖(200mg/kg+40mg/kg)，組合物C也使用商品化枸杞多糖(300mg/kg+40mg/kg)，三份供試品中枸杞多糖的含量為50％～60％，駝血多肽均為本發(fā)明方法制備，A、B、C均為40mg/kg。灌胃給藥30天。大鼠酒精肝損傷模型：50％酒精10ml/kg灌胃，連續(xù)4周。
3.給予受試樣品的途徑
經(jīng)口灌胃給予受試樣品，無法灌胃時將受試樣品摻入飼料或飲水亦可，并記錄每只動物的飼料攝入量或飲水量。
4.結(jié)果檢測
4.1第31天采集血樣，血分離血清，測定谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)。結(jié)果見下表：
表3：來源不同的枸杞提取物組合的本發(fā)明組合物對大鼠各指標的影響
注：各組別之間均具有顯著性差異。
如表3所示，酒精誘導(dǎo)的肝損傷在給予本發(fā)明組合物30天以后，各生理指標顯示本發(fā)明組合物可以產(chǎn)生協(xié)同增效的預(yù)防或輔助治療化學性肝損傷的作用。其中，組合物A效果最為明顯。主要是因為組合物A使用的是本發(fā)明所用的提取方法得到的枸杞提取物，其枸杞多糖含量穩(wěn)定，并且活性大分子多糖的含量高，而組合物B、C使用的商品化枸杞提取物，雖然枸杞多糖的含量相同，但可能由于制備工藝不同，或添加了諸如糊精之類的輔料，使其活性有所下降。因此，使用本發(fā)明方法制備得到的枸杞提取物具有一定的優(yōu)越性，亦可用于抗氧化、抗衰老、緩解體力疲勞、抗輻射類功能食品的原料。
使用本發(fā)明的枸杞子提取物和駝血多肽能用于制備不同類型的預(yù)防和治療化學性肝損傷的制品
實施例8：制備咀嚼片
將150g枸杞子提取物，駝血多肽150g，與100g淀粉混勻，加85g淀粉漿(15％～17％)制軟材10～15min，過14目或16目尼龍篩制濕顆粒，于70℃干燥，干顆粒過12目尼龍篩整理，然后將此顆粒與剩余200g淀粉(預(yù)先在100～105℃干燥)、2.5g輕質(zhì)液體石蠟、25g滑石粉共同混勻后，再過12目尼龍篩，顆粒經(jīng)含量測定合格后，用12mm沖壓片，即得咀嚼片。
實施例9：制備片劑
將300g枸杞提取物和150g駝血多肽與100g淀粉混勻，加85g淀粉漿(15％～17％)制軟材10～15min，過14目或16目尼龍篩制濕顆粒，于70℃干燥，干顆粒過12目尼龍篩整理，然后將此顆粒與剩余200g淀粉(預(yù)先在100～105℃干燥)、2.5g輕質(zhì)液體石蠟、25g滑石粉共同混勻后，再過12目尼龍篩，顆粒經(jīng)含量測定合格后，用12mm沖壓片，即得片劑。
實施例10：制備含片
取枸杞提取物500g，駝血多肽200g，D-甘露糖醇188.6g，阿斯巴甜1.8g，L-薄荷腦3.0g，放入多維混合機中混合30分鐘。待充分混合均勻后，緩慢加入適量的水將混合好的物料制成軟材，軟材的干濕度應(yīng)適宜，以用手緊握能成團但不粘手，用手指輕壓能裂開為宜。將制好的軟材投入搖擺式顆粒機中以14目篩網(wǎng)進行制粒，然后將濕顆粒置于熱風循環(huán)干燥箱中在60℃以下干燥，0.5h翻動一次，以加快干燥速度，當顆粒中水分降至4.0-6.0％時停止干燥。干燥顆粒用整粒機16目整粒，得均勻顆粒，然后加入適量微粉硅膠和硬脂酸鎂，置多維混合機中混合30分鐘?；旌虾煤笕〕?，用壓片機進行壓片，共壓制1000片，即得含片。
實施例11：制備泡騰片
將枸杞提取物19％、駝血多肽5％和檸檬酸15％分別研細成粉，過25目篩網(wǎng)，混合均勻后加入聚維酮2.5％和羧甲基纖維素鈣3％造粒，40℃真空干燥，得到第一顆粒；將枸杞提取物15％和碳酸氫鈉20％分別研細成粉，過36目篩網(wǎng)，混合均勻后加入聚維酮2.5％造粒，40℃真空干燥，得到第二顆粒；然后將乳糖20％和PEG 60003％混勻，過60目篩，加入上述第一顆粒和第二顆粒，混合均勻，迅速轉(zhuǎn)移至溫度(25±2)℃、濕度(40±5)％的操作間中巴氏滅菌后進行壓片制得泡騰片成品。