本發(fā)明涉及一種營養(yǎng)組合物及用途，尤其是一種具有促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖等作用且可對(duì)多種器官損傷恢復(fù)的營養(yǎng)組合物及在制備器官損傷修復(fù)藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

正常情況下，生物體受到創(chuàng)傷后會(huì)行使自我修復(fù)功能，這種修復(fù)功能在很大程度上依賴于體內(nèi)的干細(xì)胞完成。但是，機(jī)體內(nèi)自我修復(fù)功能是非常有限的，如無法在組織器官嚴(yán)重器質(zhì)性損傷的情況下修復(fù)，現(xiàn)有方法是通過給予外源性干細(xì)胞進(jìn)行器官修復(fù)。然而，要實(shí)現(xiàn)將干細(xì)胞變成藥物還有許多的關(guān)鍵問題需要解決，例如，如何保持干細(xì)胞經(jīng)過體外大規(guī)模培養(yǎng)后的分化能力、遺傳特征、致瘤性和穩(wěn)定性；建立與藥效作用相關(guān)的體外生物學(xué)評(píng)價(jià)方法；篩選保持活細(xì)胞穩(wěn)定的藥物制劑配方；選擇劑型及包裝材料；規(guī)范儲(chǔ)存、冷鏈運(yùn)輸條件；建立干細(xì)胞產(chǎn)品的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量評(píng)價(jià)體系；摸索臨床前藥物有效性評(píng)價(jià)體系、安全性評(píng)價(jià)體系等等，比較麻煩。

專利號(hào)為200710012788.8的中國發(fā)明專利公開了一種“促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖與血紅蛋白合成的營養(yǎng)組合物”。該營養(yǎng)組合物的原料及重量比如下：核苷酸90~110、精氨酸20~30、賴氨酸20~30、半胱氨酸10~20、甘氨酸25~35、組氨酸20~30、卵磷脂110~130、腦磷脂50~70、維生素E 0.4~0.6、維生素C 5~7、葉酸0.02~0.04、維生素B₂ 0.05~0.07、維生素B₆ 0.07~0.08、維生素B₁₂ 0.0001~0.0002、鐵0.5~1.5、鋅0.5~0.7、錳0.4~0.6、枸杞多糖14~16、葡萄籽提取物14~16?？擅黠@提高血中血紅蛋白（Hb）、紅細(xì)胞（RBC）、白細(xì)胞（WBC）及血小板（Plt）數(shù)量；可刺激骨髓造血干細(xì)胞的增殖，使造血干細(xì)胞明顯增多；明顯提高細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目。但是僅對(duì)肝、脾兩個(gè)器官的損傷具有恢復(fù)作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種具有促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖等作用且可對(duì)多種器官損傷恢復(fù)的營養(yǎng)組合物及在制備器官損傷修復(fù)藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種營養(yǎng)組合物，其特征在于各組分質(zhì)量比如下：賴氨酸200~1200、甲硫氨酸100~1600、苯丙氨酸150~1400、蘇氨酸50~600、色氨酸50~400、精氨酸200~1500、組氨酸100~1000、甘氨酸100~600、天冬氨酸100~600、亮氨酸100~600、異亮氨酸100~600、纈氨酸100~800、絲氨酸100~400、谷氨酰胺200~600、?；撬?00~500、乳清酸100~300、核苷酸200~1200、維生素A 0.2~0.6、維生素D 0.002~0.006、維生素B₂ 1~4、維生素B₆ 1~4、維生素B₁₂ 0.001~0.006、煙酸 5~20、葉酸0.01~1.2、維生素C 50~150、鐵2~10、鋅2~10、錳2~10、銅 0.5~2、硒0.01~0.1、鉻0.01~0.02、鉀10~300、鈣100~300、鎂100~200、肌醇50~60、大豆磷脂100~2500。

各組分最佳質(zhì)量比如下：賴氨酸600、甲硫氨酸800、苯丙氨酸700、蘇氨酸300、色氨酸200、精氨酸760、組氨酸500、甘氨酸300、天冬氨酸300、亮氨酸300、異亮氨酸300、纈氨酸400、絲氨酸200、谷氨酰胺300、?；撬?00、乳清酸300、核苷酸400、維生素A 0.6、維生素D0.006、維生素B₂2、維生素B₆2、維生素B₁₂ 0.004、煙酸12、葉酸0.9、維生素C100、鐵10、鋅10、錳 8、銅2、硒0.1、鉻 0.02、鉀 300、鈣300、鎂 200、肌醇60、大豆磷脂1200。

上述營養(yǎng)組合物在制備器官損傷修復(fù)藥物中的應(yīng)用。

上述營養(yǎng)組合物在制備肝臟損傷修復(fù)藥物中的應(yīng)用。

上述營養(yǎng)組合物在制備脾臟損傷修復(fù)藥物中的應(yīng)用。

上述營養(yǎng)組合物在制備腎臟損傷修復(fù)藥物中的應(yīng)用。

上述營養(yǎng)組合物在制備大腦損傷修復(fù)藥物中的應(yīng)用。

上述營養(yǎng)組合物在制備骨骼損傷修復(fù)藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的營養(yǎng)組合物具有促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖等作用且可對(duì)肝臟損傷、脾臟損傷、腎臟損傷、大腦損傷及骨骼損傷等具有修復(fù)作用，可應(yīng)用于制備器官損傷修復(fù)藥物，無毒、無副作用，避免給予外源性干細(xì)胞進(jìn)行器官修復(fù)所存在的麻煩。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例對(duì)再障大鼠體重的影響示意圖。

圖2 是本發(fā)明實(shí)施例對(duì)再障大鼠肝、脾、腎、腦的影響示意圖（HE染色）。

圖3 是本發(fā)明實(shí)施例對(duì)再障大鼠腸、肌肉的影響示意圖（HE染色）。

圖4是本發(fā)明各實(shí)驗(yàn)組的腎切片透射電鏡圖。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例對(duì)再障大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長的影響示意圖。

圖6是本發(fā)明各實(shí)驗(yàn)組脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)及成脂細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)示意圖。

圖7是本發(fā)明各實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)及成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)示意圖。

圖8時(shí)本發(fā)明實(shí)施例對(duì)再障大鼠骨髓造血細(xì)胞的影響示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：本發(fā)明的營養(yǎng)組合物各組分質(zhì)量（mg）比如下：賴氨酸200~1200、甲硫氨酸100~1600、苯丙氨酸150~1400、蘇氨酸50~600、色氨酸50~400、精氨酸200~1500、組氨酸100~1000、甘氨酸100~600、天冬氨酸100~600、亮氨酸100~600、異亮氨酸100~600、纈氨酸100~800、絲氨酸100~400、谷氨酰胺200~600、?；撬?00~500、乳清酸100~300、核苷酸200~1200、維生素A 0.2~0.6、維生素D 0.002~0.006、維生素B₂ 1~4、維生素B₆ 1~4、維生素B₁₂0.001~0.006、煙酸 5~20、葉酸0.01~1.2、維生素C 50~150、鐵2~10、鋅2~10、錳2~10、銅 0.5~2、硒0.01~0.1、鉻0.01~0.02、鉀10~300、鈣100~300、鎂100~200、肌醇50~60、大豆磷脂100~2500。

實(shí)施例2：各組分質(zhì)量（mg）比如下：賴氨酸600、甲硫氨酸800、苯丙氨酸700、蘇氨酸300、色氨酸200、精氨酸760、組氨酸500、甘氨酸300、天冬氨酸300、亮氨酸300、異亮氨酸300、纈氨酸400、絲氨酸200、谷氨酰胺300、?；撬?00、乳清酸300、核苷酸400、維生素A 0.6、維生素D0.006、維生素B₂2、維生素B₆2、維生素B₁₂ 0.004、煙酸12、葉酸0.9、維生素C100、鐵10、鋅10、錳 8、銅2、硒0.1、鉻 0.02、鉀 300、鈣300、鎂 200、肌醇60、大豆磷脂1200。

所述營養(yǎng)組合物對(duì)肝臟損傷、脾臟損傷、腎臟損傷、大腦損傷及骨骼損傷等具有修復(fù)作用，可在制備器官損傷恢復(fù)藥物中應(yīng)用。

實(shí)施例1、2原料來源如下表：

實(shí)驗(yàn)：

一．再生障礙性貧血大鼠模型的建立

本實(shí)驗(yàn)采用SD大鼠。實(shí)驗(yàn)步驟：第一天X射線2.5Gy照射后，于第4、6、8天分別給予環(huán)磷酰胺35mg/kg，氯霉素45 mg/kg腹腔注射。第15天重復(fù)以上步驟。以單純等量生理鹽水相應(yīng)部位注射為正常對(duì)照組。

實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)動(dòng)物藥理學(xué)的藥品劑量和綜合試驗(yàn)的設(shè)計(jì)分析，分為：①正常對(duì)照組；②再障模型組；③實(shí)施例2營養(yǎng)組合物高劑量組，以2266.95mg/kg.d對(duì)大鼠灌胃；④實(shí)施例2營養(yǎng)組合物中劑量組，以1511.3mg/kg.d對(duì)大鼠灌胃；⑤實(shí)施例2營養(yǎng)組合物低劑量組，以1057.91mg/kg.d對(duì)大鼠灌胃。

試驗(yàn)流程：首先，按前述再障大鼠模型的建立方法建立模型，從第5天開始，營養(yǎng)組合物高、中、低劑量組分別以相應(yīng)劑量對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃，每天一次，直至第60天，拉頸處死大鼠，采樣進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)每日進(jìn)行整體觀察，測(cè)量體重。

二．實(shí)驗(yàn)方法

1. 外周血檢測(cè)

各實(shí)驗(yàn)組第60天, 稱重動(dòng)物，經(jīng)眼眶取血，采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定外周血血紅蛋白含量、紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板數(shù)；顯微鏡下觀察外周血涂片。

2．促紅細(xì)胞生成素（Epo）檢測(cè)

酶標(biāo)板每孔加入標(biāo)準(zhǔn)液，對(duì)照液及預(yù)先用樣品稀釋液稀釋的待測(cè)樣品100ul，封板，37°C孵育90分鐘。反應(yīng)后甩干孔內(nèi)液體后，將準(zhǔn)備好的生物素抗小鼠EPO抗體工作液按每孔100ul依次加入（TMB空白顯色孔除外），封板后37°C反應(yīng)60分鐘，0.01M PBS洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右。加入準(zhǔn)備好的親和素－過氧化物酶復(fù)合物工作液按每孔100ul依次加入（TMB空白顯色孔除外），37°C反應(yīng)30分鐘。按每孔90μl依次加入已在37℃中平衡30分鐘TMB顯色液，37°C避光反應(yīng)，每孔100μl依次加入TMB終止液。用酶標(biāo)儀于450nm波長處讀取吸光度（OD值）, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得樣本Epo濃度（pg/ml）。

3. 骨髓檢測(cè)

頸椎脫臼處死大鼠, 分離雙側(cè)股骨打開骨髓腔進(jìn)行骨髓涂片、骨髓單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓病理檢查、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及分化趨勢(shì)的分析。

4. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的分離提取

SD大鼠腹腔注射麻醉藥后脫頸處死，75% 乙醇浸泡大鼠20 min；無菌取雙后肢，放入75% 的乙醇中浸泡5 min；清除下肢肌肉，從膝關(guān)節(jié)斷離股骨，剪開股骨兩端；用10 mL注射器吸取10% 胎牛血清的F-12K培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集骨髓沖洗液，制成單細(xì)胞懸液，200目篩網(wǎng)濾過后以1×10⁸接種于培養(yǎng)瓶中。置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 小時(shí)首次更換培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞，以后每隔2天換液1次。當(dāng)細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底面積的80%~90%時(shí)，傳代培養(yǎng)。

5．間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的成脂誘導(dǎo)分化

成脂誘導(dǎo)法：將分離純化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，消化傳代，以1×10⁵/孔的密度，400ul/孔接種于預(yù)先放置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，制備細(xì)胞爬片，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)80% 融合時(shí)，加入10%的胎牛血清、1μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L牛胰島素的H-DMEM誘導(dǎo)3天，再用10% 的胎牛血清、10 mg/L牛胰島素的H-DMEM處理1天，如此循環(huán)3次后，用10%的胎牛血清、10 mg/L牛胰島素的H-DMEM處理7天，每隔三四天換液1次。對(duì)照組始終加入含體積分?jǐn)?shù)為10% 的胎牛血清、10 mg/L牛胰島素的H-DMEM，每隔三四天換液1次。誘導(dǎo)后細(xì)胞用PBS洗滌2~3次，10% 甲醛室溫固定40min。PBS洗2~3次，飽和油紅O染液用一蒸水以3:2稀釋，室溫染色30min，PBS洗數(shù)次直至無肉眼觀察到沉渣，光鏡觀察。

6. 間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）成骨細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

取P2代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，按2×10⁵個(gè)/孔接種于12孔板，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長達(dá)80% 融合時(shí)，吸除孔中培養(yǎng)液，換為成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液 (含高糖DMEM、體積分?jǐn)?shù)為10% 胎牛血清、10^-8mol/L地塞米松、10^-2 mol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L抗壞血酸)，每3天更換誘導(dǎo)液1次。培養(yǎng)14天后，吸除培養(yǎng)液，PBS洗2次，10%甲醛室溫固定40 min，PBS洗3次，加入0.1% 茜紅素（3:2稀釋），室溫染色10min，去除染液，PBS洗3次后，顯微鏡下觀察。

7. RNA提取和RT-PCR分析

常規(guī)應(yīng)用Trizol 法提取各標(biāo)本的總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A₂₆₀和A₂₈₀，以檢測(cè)RNA含量和純度，并置放于-70°C保存。

反轉(zhuǎn)錄體系20μl，包含樣品RNA 1μl，按照TaKaRa 的反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的說明書進(jìn)行操作。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：65°C 1min，30°C 5min，65°C 15min，98°C 5min，5°C 5min。

PCR反應(yīng)體系50 μl，包含反轉(zhuǎn)錄液10 μl。PCR反應(yīng)條件： 94°C預(yù)變性1min；97°C 變性 20s,64°C退火20s,72°C 20s延伸，循環(huán)30次；72°C 延伸5min，4°C恒定。取5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳， 紫外燈下凝膠成像。

8. 透射電鏡觀察

將大鼠部分肝、脾、腦、腎組織標(biāo)本上取不同部位的3張切片進(jìn)行透射電鏡(JEM-100CXE 型) 超微結(jié)構(gòu)的觀察，每張切片分別隨機(jī)觀察5-6個(gè)部位，并按相同放大倍數(shù)攝片，每組隨機(jī)抽取l0張照片，采用Epson微機(jī)和Summa Sketch PIus 數(shù)字化儀，并使用Sigmascan軟件，對(duì)各組照片作電鏡圖像的形態(tài)進(jìn)行分析，同時(shí)計(jì)數(shù)線粒體的平均數(shù)目。

9. 線粒體膜電位測(cè)定

細(xì)胞（5×10⁵個(gè)）接種于25cm²培養(yǎng)瓶中, 37℃培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的姜黃素分別作用1 h和 6 h 后，收獲細(xì)胞，PBS洗兩遍，重懸于2ml 含1.0 μM 羅丹明123的新鮮培養(yǎng)液中，37°C 水浴振搖孵育10 min，離心去掉細(xì)胞，熒光比色計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液中羅丹明123的強(qiáng)度，激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長520 nm，結(jié)果以細(xì)胞吸收的羅丹明123的熒光強(qiáng)度表示。

10. 線粒體DNA含量測(cè)定

將骨髓單個(gè)核細(xì)胞（5×10⁷）、新鮮組織肝臟、脾、腦、腎勻漿、裂解、離心，獲取線粒體。按照DNA提取試劑盒說明提取線粒體中的DNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其含量。計(jì)算公式如下：

DNA濃度（μg/μl）= A₂₆₀ × 50μg/ml × 稀釋倍數(shù) × 10^-3

11. 病理學(xué)觀察

將大鼠部分肝、脾、腦、腎、腸、肌肉置于4 %多聚甲醛中固定，依次經(jīng)過常規(guī)脫水、石蠟浸泡包埋、切片、HE 染色, 顯微鏡觀察各組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

12. 免疫組化染色

石蠟切片脫蠟、水化；PBS洗2-3次各5分鐘；3% H₂O₂（80%甲醇）滴加在玻片上，室溫靜置10分鐘；PBS洗2-3次各5分鐘；抗原修復(fù)；PBS洗2-3次各5分鐘；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體，滴加一抗50μl，4°C過夜。過夜后需在37°C復(fù)溫45分鐘。PBS洗3次各5分鐘；滴加二抗40-50μl，室溫靜置，或37°C 1小時(shí)；PBS洗3次各5分鐘；DAB顯色5-10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；PBS或自來水沖洗10分鐘；蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化；自來水沖洗10-15分鐘；脫水、透明、封片、鏡檢。

13. 流式細(xì)胞儀分析

取大鼠左脛骨，去除表面肌肉組織，修剪骨垢，用18 號(hào)針插入脛骨踝端，用PBS 5mL 沖洗入試管內(nèi)，以200目篩網(wǎng)過濾。1000 r/min 離心 5min，棄上清液。將細(xì)胞加入5mL Percoll分離液（相對(duì)比重1.073g/L），2000r/min，離心25min，取中間單個(gè)核細(xì)胞層。PBS洗滌后調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞數(shù)為l×10⁶/管，每樣本3管，測(cè)定管加入FITC標(biāo)記的CD34或CD45抗體，37°C孵育2小時(shí)。然后PBS洗滌一次。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)CD34/45陽性細(xì)胞數(shù)量變化，以標(biāo)記抗體呈陽性的細(xì)胞百分率作為表達(dá)CD34/45 蛋白（骨髓造血干細(xì)胞標(biāo)志物）的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)以只加標(biāo)記熒光素的羊抗兔IgG和不加抗體的細(xì)胞作陰性對(duì)照。

14. 蛋白芯片分析

將大鼠部分骨髓單個(gè)核細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、肝臟組織進(jìn)行蛋白芯片分析，此部分工作由上海康城公司完成。

15. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每一項(xiàng)分析至少有三次結(jié)果。數(shù)值用均數(shù)±SD表示，采用t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為有顯著性差異,并在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（一）營養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠全身情況的影響

與正常對(duì)照組相比，再障模型組大鼠自6天起陸續(xù)出現(xiàn)皮毛松弛蓬亂，光澤度降低，部分大鼠有脫毛及皮損。同時(shí)大鼠消瘦、精神漸顯不佳，唇色眼瞼蒼白、活動(dòng)減少、少食、體重下降。其中再障模型組大鼠體重（218.23±33.52 g）與正常對(duì)照組（366.54±49.68 g,*p<0.05）相比下降明顯。

不同劑量的營養(yǎng)組合物組與再障模型組比較，大鼠精神狀態(tài)漸佳，進(jìn)食量增大，體重增加（見圖1）。表明營養(yǎng)組合物對(duì)再生障礙性貧血小鼠全身有顯著恢復(fù)作用。

（二）營養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠外周血的影響

與正常對(duì)照組相比，再障模型組外周血中紅細(xì)胞 (RBC)、白細(xì)胞 (WBC)、血小板 (PLT) 及血紅蛋白 (Hb) 均顯著下降 (表 1，#p<0.05)；不同劑量營養(yǎng)組合物組與再障模型組比較，其外周血中各項(xiàng)指標(biāo)均顯著升高 (表 1，*p<0.05)，并呈量效依賴性。

與正常對(duì)照組相比，再障模型組大鼠促紅細(xì)胞生成素（EPO）含量明顯升高，且EPO與 RBC、 Hb的降低呈負(fù)相關(guān)，r=-0.91及r=-0.93（*p<0.05），表明EPO水平與再障骨髓紅系生成能力降低，EPO反應(yīng)性能力減弱，EPO呈代償性升高有關(guān)。(表1，*p<0.01)。EPO是一種重要的造血調(diào)控因子，具有促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增殖、分化和成熟，維持外周血中紅細(xì)胞，血紅蛋白恒定的作用，血液中EPO水平能反映機(jī)體中的紅細(xì)胞生成能力。而不同劑量的營養(yǎng)組合物組與再障模型組比較,促紅細(xì)胞生成素（Epo）由于代償作用含量降低 (*p<0.01)；并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。

以上結(jié)果提示，營養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠外周血各種血細(xì)胞有促進(jìn)升高作用。

表1營養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠外周血的影響

^# P<0.05 再障組與正常組；^*P<0.05 營養(yǎng)組合物組與再障組

（三）本發(fā)明實(shí)施例營養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠器官損傷修復(fù)的影響

1．對(duì)于肝、脾、腎、腦、腸及肌肉等器官損傷修復(fù)的影響

從圖2可以看出：

肝的病理切片HE染色顯示，與正常對(duì)照組相比，再障模型組大鼠肝臟組織小葉結(jié)構(gòu)欠清晰，肝細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)深染，肝血竇及中央靜脈擴(kuò)張，充血。不同劑量的營養(yǎng)組合物組與再障模型組比較, 肝臟組織小葉結(jié)構(gòu)明顯清晰，肝細(xì)胞形態(tài)接近正常。

脾的病理切片HE染色顯示，與正常對(duì)照組相比，再障模型組大鼠脾臟略微腫大，脾組織結(jié)構(gòu)疏松，脾小體個(gè)數(shù)減少，生發(fā)中心不明顯，白髓減少，脾血竇擴(kuò)張、充血，部分區(qū)域可見脾小動(dòng)脈壁增厚及玻璃樣變。不同劑量的營養(yǎng)組合物組與再障模型組比較，脾小體數(shù)量增多，白髓增多。

腎的病理切片HE染色顯示，與正常對(duì)照組相比，再障模型組大鼠腎小球體積減小，部分大小不一，腎小管水腫。不同劑量的營養(yǎng)組合物組與再障模型組比較，腎小球體積趨于正常，腎小管水腫減輕。

腦的病理切片HE染色顯示，與正常對(duì)照組相比，再障模型組大鼠腦部海馬區(qū)域的神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂。不同劑量的營養(yǎng)組合物組與再障模型組比較，神經(jīng)元細(xì)胞排列趨于整齊。

從圖3中可以看出：

腸、肌肉的組織切片顯示未見明顯變化。

圖4是本發(fā)明各實(shí)驗(yàn)組的腎切片透射電鏡圖。從圖4可以看出：與正常對(duì)照組相比，再障模型組大鼠腎小球基底膜足突大面積融合；不同劑量的營養(yǎng)組合物組與再障模型組比較, 大鼠腎小球基底膜足突融合程度減低，排列趨于正常。

結(jié)果顯示，本發(fā)明實(shí)施例營養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠肝、脾、腎、腦損傷有顯著恢復(fù)作用。

2．對(duì)于骨骼損傷修復(fù)的影響

2.1 本發(fā)明實(shí)施例營養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長的影響

各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力結(jié)果見圖5，再障組顯著低于正常組，低劑量組與再障組無差異，中劑量組，高劑量組與再障組有明顯差異。

2.2 本發(fā)明實(shí)施例對(duì)再障大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化趨勢(shì)的影響

2.2.1 脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)及成脂細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)

如圖6所示：

正常組，再障組，高劑量組，中劑量組和低劑量組P2代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別用成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，再障組誘導(dǎo)形成的脂肪滴出現(xiàn)時(shí)間 第7天早于正常組第12 d左右。繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，脂肪滴明顯增大并發(fā)生融合。誘導(dǎo)19天后，融合的脂肪滴被油紅O染色為明亮的紅色；顯微鏡下觀察，再障組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)能力高于正常組，營養(yǎng)組合物處理再障大鼠后，間充質(zhì)干細(xì)胞成脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)能力下降，且隨著營養(yǎng)組合物劑量增加而下降，表明營養(yǎng)組合物減弱再障大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞成脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)能力。

為更客觀地比較營養(yǎng)組合物對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂肪細(xì)胞的影響，進(jìn)一步檢測(cè)了成脂肪細(xì)胞相關(guān)基因Pparr mRNA，F(xiàn)abp4 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)abp4和Pparr的表達(dá)水平與營養(yǎng)組合物干預(yù)的計(jì)量呈負(fù)相關(guān)。

以上結(jié)果表明再障組與正常對(duì)照組相比，再障鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化能力增強(qiáng)；而營養(yǎng)組合物干預(yù)后，再障鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成脂細(xì)胞分化能力減弱。

2.2.2 成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)及成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)

如圖7所示：

正常組，再障組，高劑量組，中劑量組和低劑量組P2代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別用成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)5~7天，可見細(xì)胞集落中心出現(xiàn)黑色沉積物，14天后茜紅素染色。再障組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞黑色沉積物出現(xiàn)較晚，鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯少于正常組。營養(yǎng)組合物處理再障大鼠后，間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)能力增強(qiáng)，且隨著營養(yǎng)組合物劑量增加而增加，表明營養(yǎng)組合物能增強(qiáng)再障大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)能力。

為比較營養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞過程的影響，進(jìn)一步檢測(cè)了成骨細(xì)胞相關(guān)基因mRNA和Bglap mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Alp和Bglap的表達(dá)水平與營養(yǎng)組合物干預(yù)的計(jì)量呈正相關(guān)。

結(jié)果表明再障組與正常照組相比，再障鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化能力減弱；而營養(yǎng)組合物干預(yù)后，再障鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化能力增強(qiáng)。

2.3 本發(fā)明實(shí)施例對(duì)再障大鼠骨髓造血細(xì)胞的影響

骨髓涂片（圖8）顯示，與正常對(duì)照組相比，再障模型組大鼠部分骨髓涂片出現(xiàn)油滴，骨髓全面衰竭呈增生障礙，造血細(xì)胞減少，非造血細(xì)胞增多；成熟紅細(xì)胞大小一致，無明顯淡染區(qū)；巨核細(xì)胞缺如，血小板減少，散在分布（圖8A）；骨髓單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，再障模型組明顯低于正常對(duì)照組（圖8B、表2）。各營養(yǎng)組合物組與再障模型組比較，骨髓病理變化逐漸改善，骨髓細(xì)胞明顯增多（圖8A）；各營養(yǎng)組合物組單個(gè)核細(xì)胞數(shù)明顯高于再障模型組（圖8B、表2）。

表2

^# P<0.05 再障組與正常組；^*P<0.05 營養(yǎng)組合物組與再障組

結(jié)果顯示，營養(yǎng)組合物可促進(jìn)再障大鼠骨髓造血細(xì)胞的增殖，對(duì)再障大鼠骨髓損傷狀態(tài)有顯著修復(fù)作用。

綜上所述，本發(fā)明實(shí)施例營養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠骨骼損傷狀態(tài)有顯著修復(fù)作用。