本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種沙棘油用于粘膜修復(fù)與營養(yǎng)的醫(yī)藥保健用途。
背景技術(shù)：
：沙棘油(seabackthornoil)，系從天然植物沙棘的果實中提取出來的珍貴天然油脂。沙棘果實中除了含有不飽和脂肪酸之外，還含有黃酮、維生素、植物甾醇、微量元素和α-生育酚等一百多種生物活性物質(zhì)。沙棘中提取的沙棘油富含VE、胡蘿卜素、類胡蘿卜素、β-谷甾醇、不飽和脂肪酸等，可促進機體新陳代謝，有利于損傷的組織恢復(fù)，還可阻止皮下組織炎癥的發(fā)展，抗炎生肌，以及明顯的促進潰瘍愈合作用。因而沙棘油在臨床上對輻射損傷、燒傷、燙傷、褥瘡、皮炎、粘膜炎、子宮內(nèi)膜炎、宮頸糜爛和胃及十二指潰瘍等有很好的療效，沙棘油內(nèi)服外用還對治療黃褐斑、慢性皮膚潰瘍也有較好效果。對手術(shù)后傷口愈合，消除疼痛、減少不良反應(yīng)，也有很好作用。沙棘中的總黃酮有直接捕獲氧自由基和羥自由基作用。VE、VC、超氧化物歧化酶(SOD)能抗氧化、清除體內(nèi)的自由基，同時又有增強免疫功能，調(diào)節(jié)免疫活性細胞、有利于提高人體抗病能力、延緩人體衰老。沙棘富含的多種生物營養(yǎng)成分對護理皮膚，防皺抗衰也有很好的作用。粘膜是指口腔、鼻腔、腸管、陰道、腸道等與外界相通體腔的濕潤襯里。胃粘膜是存在于胃部內(nèi)壁的一層很薄、很脆弱的粘膜組織，如同一堵天然“屏障”保護著胃壁的安全。它具有一個損傷與自我修復(fù)的動態(tài)平衡機制，保護著胃部的正常運作。一旦外界給予胃的負擔(dān)過重或刺激過強，動態(tài)平衡就會被打破，胃酸便開始對胃壁的“自我消化”，繼而形成凹入表面的破損。胃粘膜一旦受損，就很難再恢復(fù)如初。隨之而來的就是上腹部不適或疼痛、惡心、嘔吐、腹瀉、食欲不振等一系列胃部不適的癥狀。專家指出，保護胃粘膜免受傷害，除了要減少不良因素對胃的刺激外，還需同時修復(fù)和保護相對脆弱的胃粘膜，這樣才能避免胃病發(fā)生和復(fù)發(fā)。皮膚和粘膜將人體保護起來，使人體對外界形成了一個密閉的系統(tǒng)，當(dāng)有害物質(zhì)將要侵入人體時，首先是皮膚和粘膜將外界致病因素阻擋在體外。所以皮膚和粘膜是人體抗感染的第一道防線。陰道粘膜是指陰道內(nèi)壁分泌的保持陰道內(nèi)壁表面濕潤，保持表面活力的粘液膜層，因為其表面多粘稠，故為粘膜。在卵泡期，陰道粘膜受雌激素作用，上皮增厚，表皮細胞角化；陰道上皮細胞內(nèi)糖原豐富(注：陰道粘膜上皮是復(fù)層扁平上皮又名“復(fù)層鱗狀上皮”)，在陰道桿菌作用下分解為乳酸，保持陰道的酸性環(huán)境；排卵后，受孕激素作用，陰道粘膜上皮大量脫落，角化現(xiàn)象消失。目前對粘膜的保護和修復(fù)絕大多數(shù)采用西藥進行治療。在藥物治療方面，盡管西藥有肯定療效，但是價格昂貴、毒副作用大等用藥問題日見突出，且停藥后年復(fù)發(fā)率高達70％左右。近年來中藥對粘膜的治療研究取得了很大的進展，具有療效穩(wěn)定、復(fù)發(fā)率低、副作用少的優(yōu)勢。沙棘油富含VE、胡蘿卜素、類胡蘿卜素、β-谷甾醇、不飽和脂肪酸等，可促進機體新陳代謝，有利于損傷的組織恢復(fù)，還可阻止皮下組織炎癥的發(fā)展，抗炎生肌，以及明顯的促進潰瘍愈合作用。藥理試驗結(jié)果表明沙棘油具有抗炎、鎮(zhèn)痛、提高機體免疫力、保護修復(fù)破損粘膜、促進表皮因子生長等作用。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種沙棘油用于粘膜修復(fù)與營養(yǎng)的醫(yī)藥保健用途。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，沙棘油在制備用于粘膜修復(fù)與營養(yǎng)的藥物或食品或保健品中的應(yīng)用。本發(fā)明的特點還在于，粘膜為皮膚粘膜、胃粘膜或陰道上皮粘膜。沙棘油對皮膚粘膜炎癥具有抑制作用。沙棘油對皮膚粘膜創(chuàng)傷面的修復(fù)以及促進表皮因子(EGF)生長的作用。沙棘油對胃粘膜損傷具有保護作用。沙棘油能夠抑制白假絲酵母菌菌絲的形成及芽生孢子對陰道上皮細胞的粘附，恢復(fù)陰道上皮細胞的形態(tài)及活力的作用。本發(fā)明各個方面的細節(jié)將在隨后的章節(jié)中得以詳細描述。通過下文以及權(quán)利要求的描述，本發(fā)明的特點、目的和優(yōu)勢將更為明顯。附圖說明圖1是創(chuàng)面直徑的測量圖；圖2是高倍鏡下(×3000)菌絲圖；圖3是高倍鏡下(×3000)陰道上皮細胞圖。具體實施方式下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明進行詳細說明。一、皮膚粘膜抗炎作用試驗(一)受試藥物：沙棘油，由陜西海天制藥有限公司供給，試驗時用3％吐溫80水溶液配制所需濃度；(二)動物：小白鼠(ICR種系)，大白鼠(SD種系)，固體飼料喂養(yǎng)。皆由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心供給，設(shè)置合格證為陜醫(yī)動證字04號，質(zhì)量合格證為陜醫(yī)動證字05號。(三)方法與結(jié)果1.小白鼠巴豆油耳部炎癥法選雄性小白鼠40只，體重25～27克，按體重隨機均分4組，1組為3％吐溫80水液對照組；2、3組分別為10％及20％沙棘油藥組；4組氫化可的松組。各組小鼠在左耳部均勻涂巴豆油混合液0.06ml/只致炎。致炎半小時后，1組鼠左耳涂3％吐溫80水液；2、3組鼠分別在左耳涂10％及20％沙棘油藥液；4組左耳涂氫化可的松液。(氫可化的松注射液100mg/20ml)。涂藥容積皆為0.1ml/只。致炎3.5小時后，用棉球輕輕擦去耳皮膚殘留藥液。致炎4小時后，脫頸椎處死小鼠，沿耳根部剪下左、右兩耳重疊一起，用眼科剪刀在左、右耳相同部位修剪成同樣大小形狀的耳片，用扭力天平分別稱重。計算小鼠左、右耳重量差，為炎癥腫脹程度指標。將各組鼠耳炎癥腫脹程度進行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果如表1。表1沙棘油皮膚用藥對小鼠巴豆油耳炎癥的影響結(jié)果表明，10％沙棘油藥，或20％沙棘油藥耳部皮膚局部涂藥，對小白鼠巴豆油致耳部炎癥，皆具有明顯的抑制作用(p＜0.01)。二、沙棘油對皮膚創(chuàng)傷修復(fù)研究1.材料1.1儀器倒置顯微鏡(Nikon)、生物安全柜(HealForce)、CO2培養(yǎng)箱(Thermo)、勻漿儀(IKA)、低溫離心機(Eppendrof)、分光光度計(Bio-RAD)、游標卡尺(Wollschlger)。1.2試劑沙棘油(陜西海天制藥有限公司)、RPMI1640(GIBCO)、胎牛血清(GIBCO)、細胞消化液(Invitrogen)、PBS液(GIBCO)、MTS細胞繁殖定量檢測試劑盒(Promega)、大鼠表皮生長因子試劑盒(R&D)。1.3細胞與動物大鼠皮膚成纖維細胞(來自3日齡Wistar乳鼠背部皮膚)，雄性5周齡Wistar大鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供)2.方法2.1動物創(chuàng)傷模型的制作、分組及給藥方法2.1.1造模雄性5周齡Wistar大鼠，在背部脊柱兩側(cè)做2個圓形創(chuàng)面，每個直徑20mm深達筋膜。2.1.2分組與給藥將大鼠分為5組，每組6只。其中對照組1組不給藥，4組給藥組，給藥濃度為100、200、300、400μg/ml(使用PBS溶解藥物)。每個創(chuàng)面給藥1ml，創(chuàng)緣皮下注射。陰性對照組注射1mlPBS液，陽性對照組注射含200U的PBS液1ml。創(chuàng)傷當(dāng)日開始給藥，每天1次，連續(xù)給藥10d后停止給藥。2.2創(chuàng)面測量測量時取2個創(chuàng)面的直徑平均值作為該樣本的測量結(jié)果。整個實驗周期以愈合最慢的1組完全愈合為截止期。由于創(chuàng)口愈合時不按規(guī)則圓形愈合，所以每只大鼠的每個創(chuàng)口測量4個不同位置的直徑，取平均值作為該創(chuàng)口直徑。2.3細胞因子的測定造模后1d開始取創(chuàng)緣皮膚，而后每隔3d取創(chuàng)緣皮膚。按每克皮膚加入0.1mol/LPBS15ml的量勻漿，勻漿于4℃15000r/min離心30min，取上清用于細胞因子的測定。大鼠表皮生長因子(EGF)的測定依據(jù)試劑盒說明書進行。2.4統(tǒng)計方法采用t檢驗，數(shù)據(jù)使用SPSS115進行分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，P＜0.05為有顯著差異。3結(jié)果3.1愈合過程中創(chuàng)面大小的測量如圖1顯示，給藥300μg/ml的實驗組在第16天最先愈合完畢，其次為給藥400μg/ml的實驗組和陽性對照組在第18天愈合完畢，第3為給藥200μg/ml的實驗組在第19天愈合完畢，第4為給藥100μg/ml在第20天愈合完畢，第5為陰性對照組在第23天愈合完畢。3.2細胞因子的測定數(shù)據(jù)比較方法為測量當(dāng)天的各給藥組分別與陰性對照組、陽性對照組比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。由于有實驗組在第16測量日之前完全愈合，故只列出并比較第16測量日及之前的數(shù)據(jù)。3.2.1表皮生長因子(EGF)表2顯示，沙棘油各濃度組EGF含量從實驗開始隨藥物濃度增高而增加，且均比陽性對照組低。第10天最后1次給藥時，各實驗組EGF達到峰值，并且各給藥組均低于陽性對照組。除第1天測量值外，300μg/ml組在沙棘油各濃度組給藥期間EGF含量最高。表2EGF的測定(n＝6)(pg/ml)注：與陽性對照組比較*P＜0.05；與陰性對照組比較：#P＜0.05三、沙棘油對胃粘膜損傷的試驗(一)受試藥物；沙棘油，由陜西海天制藥有限公司供給，試驗時用3％吐溫80水溶液配制所需濃度；(二)動物：小白鼠(ICR品系)，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心供給。質(zhì)量合格證為陜醫(yī)動證字05號。(三)劑量選擇：沙棘油的人體推薦量為每日2g/60kg.bw，實驗設(shè)3個劑量組，即：0.17g/kg.bw組(低)、0.33g/kg.bw組(中)和0.99g/kg.bw(高)組，低、中、高3個組的劑量分別為人體推薦量的5倍、10倍、30倍，用1％羧甲基纖維素鈉將樣品配至所需濃度，同時設(shè)立1％羧甲基纖維素鈉對照組，按1ml/100g體重灌胃30d。(四)儀器與試劑：電子數(shù)顯卡尺，無水乙醇，甲醛。(五)方法與結(jié)果1.實驗方法：取大鼠40只，隨機分為4組，劑量組灌胃沙棘油，對照組灌胃1％羧甲基纖維素鈉，連續(xù)30d，解剖前動物禁食不禁水24h。實驗結(jié)束當(dāng)天灌胃受試物1h后再灌胃無水乙醇1ml/只。1h后處死動物，取胃于10％甲醛溶液中固定20min后沿胃大彎剪開，洗凈內(nèi)容物，用游標卡尺測量其充血和彌漫性出血條帶的長和寬(精確到0.01mm)。計算每鼠的充血和彌漫性出血條帶的總面積。2.結(jié)果：沙棘油對無水乙醇引起的大鼠胃粘膜損傷的影響給予沙棘油30d后，沙棘油中、高劑量組的胃粘膜損傷面積顯著小于對照組(P<0.01、P<0.05)，說明沙棘油對無水乙醇引起的胃粘膜損傷有一定的保護作用。結(jié)果見表3。表3沙棘籽油對無水乙醇引起的胃粘膜損傷的影響由于沙棘油能減少大鼠胃液分泌量并降低總酸排出量及胃蛋白酶排出量,并能增加大鼠胃壁黏液量。這樣，在削弱侵襲因素的同時又增強了保護因素,從而顯示出良好的抗?jié)冏饔谩Ｉ臣椭泻袠O其豐富的脂肪酸，其抑制胃總酸排出量及增加胃黏液分泌量的作用可能與其含有的豐富脂肪酸有關(guān)。研究表明脂肪或脂肪酸都有抑制胃酸分泌的作用。由于脂肪或脂肪酸在近端小腸能刺激多種胃腸激素釋放，如腸抑胃肽、促胰激素、腸類胰高血糖素等，而胰高血糖素對胃粘膜有保護作用，促胰液素及膽囊收縮素也有刺激胃粘膜表面上皮細胞分泌黏液并增強康損傷能力等作用。推測，沙棘油有可能通過刺激近端小腸釋放多種胃腸激素的綜合作用來保護胃粘膜的損傷。四、沙棘油對體外受損陰道上皮粘膜的修復(fù)試驗(一)實驗方法：用白假絲酵母菌株粘附原代培養(yǎng)的陰道上皮細胞，造成陰道上皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)以及細胞功能的改變(分泌的細胞因子以及IgG的含量減少)；然后將受損后的陰道上皮細胞在沙棘油的干預(yù)下培養(yǎng)一段時間，觀察細胞形態(tài)和功能是否有所改善。1.細胞培養(yǎng)每100mlK-SFM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，加入500μl牛垂體提取物(BovinePituitaryExtract，BPE)和重組表皮生長因子(RecombinantEpidermalGrowthFactor，rEGF)的混合液；1ml青鏈霉素液；500μlCaCl2溶液(終濃度為0.4mM)。培養(yǎng)瓶中，加4-6mlK-SFM，將培養(yǎng)瓶蓋回擰半圈，放入5％CO237℃恒溫培養(yǎng)箱中。當(dāng)鏡下觀察細胞長滿融合培養(yǎng)瓶底約80％-90％時，可進行細胞傳代。將細胞制成單細胞懸液，用血球計數(shù)板計數(shù),調(diào)整細胞濃度為1×105/ml。2.白假絲酵母菌培養(yǎng)白假絲酵母菌(ATCC-11006)轉(zhuǎn)種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，2天后再轉(zhuǎn)種1次。選取其中生長良好的單一菌落，挑取少許菌種懸浮于培養(yǎng)液中，洗滌2次。用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整濃度分別為1×105/ml。陰道上皮細胞與白假絲酵母菌在六孔板中共培養(yǎng)。3.ELISA方法檢測收集到的細胞上清液中的IgG含量收集假絲酵母菌感染VEC后的培養(yǎng)上清檢測商品化總IgG。實驗分為4組：0組為單獨培養(yǎng)的VK2/E6E7；1組為Candidaalbicans：VK2/E6E7比例為1:1共培養(yǎng)12h后加入1640培養(yǎng)液24h；2組為VK2/E6E7加1640培養(yǎng)12小時后直接加入沙棘油54mg/ml作用24h；3組為Candidaalbicans：VK2/E6E7比例為1:1共培養(yǎng)12h后加入沙棘油54mg/ml作用24h。收集四組的細胞培養(yǎng)上清液，裝于2ml的無菌EP管中，置于-80℃冰箱內(nèi)待測。采用ELISAKitforImmunoglobulinG(IgG)(美國Cloud-Clone公司)，型號CEA544Hu試劑盒按說明書進行操作，加入標準品及待檢測樣品，做標準曲線，酶標儀檢測OD450值。4.電鏡步驟實驗分為4組：0組為單獨培養(yǎng)的VK2/E6E7；1組為Candidaalbicans：VK2/E6E7比例為1:1共培養(yǎng)12h后加入1640培養(yǎng)液24h；2組為VK2/E6E7加1640培養(yǎng)12小時后直接加入沙棘油54mg/ml作用24h；3組為Candidaalbicans：VK2/E6E7比例為1:1共培養(yǎng)12h后加入沙棘油54mg/ml作用24h。接種于24孔板中，用2.5％戊二醛固定細胞，然后用鋨酸后固定2h以上、后用1％鋨酸固定液固定2小時。70％、80％、90％、100％丙酮梯度脫水。環(huán)氧樹脂混合液，37℃浸泡24h后包埋。超薄電鏡切片后使用醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色。掃面電鏡觀察各組陰道上皮與白假絲酵母菌的作用情況。(二)實驗結(jié)果及分析：1.細胞培養(yǎng)上清IgG檢測(如表4所示)表4細胞培養(yǎng)上清IgG檢測結(jié)果分組復(fù)孔1復(fù)孔2復(fù)孔3均值0(V)0.6320.5120.7770.6401(V+C)0.2480.2480.2150.2372(V+沙)0.51200.1760.2293(V+沙+C)0.5360.3910.464由表4可知，IgG的分泌量在組間存在明顯差異，沙棘油單獨作用于上皮細胞時可能由于藥物的毒性作用等造成IgG的分泌減少，但是沙棘油作用于被白假絲酵母菌侵襲的細胞后，與單純的白假絲酵母菌侵襲上皮細胞相比，能明顯促進上皮細胞IgG的分泌，增強細胞的免疫功能。2.掃描電鏡的初步結(jié)果沙棘油治療24h后，如圖2所示，圖2中上面箭頭所指散在的短桿狀芽生孢子；中間箭頭所指為斷裂的菌絲；底部箭頭所指為正在吞噬斷裂菌絲的陰道上皮細胞(圖中顯示3個上皮細胞)，高倍鏡下(×3000)觀察到菌絲顯著減少，僅剩少量散在的短桿狀芽生孢子；3個上皮細胞正在吞噬被折斷的菌絲，周圍散在分布少量短桿狀芽生孢子。如圖3所示，箭頭所指為陰道上皮細胞，高倍鏡下(×3000)顯示陰道上皮細胞形態(tài)良好，活力較好，足突粘附性強，上皮細胞胞膜相對完整，細胞表面光滑上皮，表面布滿微絨毛及微絨毛嵴，即呈不規(guī)則疏網(wǎng)狀的質(zhì)膜皺褶，與正常未感染細胞形態(tài)一致。該結(jié)果說明沙棘油能夠抑制白假絲酵母菌菌絲的形成及芽生孢子對陰道上皮細胞的粘附，恢復(fù)陰道上皮細胞的形態(tài)及活力，增強細胞的免疫功能，促進陰道粘膜的修復(fù)。最后應(yīng)說明的是：以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，依然可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改和等同替換，而不脫離本技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。當(dāng)前第1頁1 2 3