本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及化合物的新用途，尤其涉及β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲酰基-2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物在制備預(yù)防/治療糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

現(xiàn)代社會(huì)以及高脂、高糖飲食為特點(diǎn)的生活飲食習(xí)慣使得人群中血糖、血胰島素水平異?；颊呒ぴ?；如得不到有效防治，必然引起機(jī)體多系統(tǒng)的損害，例如：胰島受損導(dǎo)致的胰島素分泌不足，靶組織細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性的下降，蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合癥等，最常見的疾病為Ⅱ型糖尿病。有關(guān)資料表明，糖尿病己成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后，嚴(yán)重威脅人類健康的第三大疾病，預(yù)計(jì)到2025年，全球糖尿病患者將突破3億(王雙慧，燕麥β-葡聚糖對(duì)糖調(diào)節(jié)受損(IGR)小鼠血脂和抗氧化能力的影響研究[D].重慶大學(xué)，2014)。另外，糖尿病病人容易出現(xiàn)脂蛋白和血脂的異常情況，Ⅱ型糖尿病病人中約有超過60％存在血脂異常的現(xiàn)象，但是，只有少數(shù)患者能夠在早期診斷出來并得到有效治療。慢性并發(fā)癥還可導(dǎo)致糖尿病患者病殘或過早死亡。據(jù)統(tǒng)計(jì)，Ⅰ型糖尿病患者中有50％死于慢性腎功能衰竭，而Ⅱ型糖尿病也有5％-10％死于腎功能衰竭(中國當(dāng)代醫(yī)療百科專家專著編委會(huì)編著.糖尿病防治保健手冊(cè).北京：中醫(yī)古籍出版社,2006.12)。

ɑ-葡萄糖苷酶抑制劑通過可逆性抑制小腸刷狀緣上的ɑ-葡萄糖苷酶，保持餐后血糖穩(wěn)定，減少餐后血糖大幅波動(dòng)對(duì)胰腺的刺激，改善機(jī)體高糖環(huán)境造成的外周組織胰島素敏感性的降低。大量臨床數(shù)據(jù)表明，ɑ-葡萄糖苷酶抑制劑可用于調(diào)節(jié)糖、脂代謝、改善高胰島素血癥、糖耐量異常，并且能有效預(yù)防并改善糖尿病大血管及微血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，對(duì)治療和預(yù)防糖尿病及血管并發(fā)癥等具 有重要的作用(Dinicolantonio JJ et al.Acarbose:Safe and Effective for Lowering Postprandial Hyperglycaemia and Improving Cardiovascular Outcomes[J].Open Heart，2015)。糖尿病屬于慢性疾病，治療周期較長，甚至可能終身服藥；再者近年來，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，阿卡波糖為代表的ɑ-葡萄糖苷酶抑制劑可導(dǎo)致胃腸道紊亂、肝損害、過敏等不良反應(yīng)的出現(xiàn)；因此，研制成本低廉、安全有效的降糖藥物是關(guān)注的要點(diǎn)。

中藥作為中華民族的瑰寶，未病先防、既病防變，具有多途徑、多靶點(diǎn)、多向性的藥理特點(diǎn)，作用溫和持久且能有效延緩并發(fā)癥的發(fā)生。以多酚類為例，該類化合物具有多種生理功能，諸如改善心血管疾病、防癌、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、抗病毒、抗高血糖、降血脂、調(diào)節(jié)抗氧化酶系的表達(dá)及抗炎等多種生理功能。多酚類物質(zhì)五沒食子?；咸烟菑V泛存在于天然藥物中，諸如五倍子、牡丹皮、白芍、赤芍、黃芩等中；該類化合物藥理活性廣泛，有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗血管再生、抗衰老等作用。據(jù)報(bào)道，五沒食子酰基葡萄糖具有緩解胰島素抵抗、抑制ɑ-葡萄糖苷酶及11β羥化固醇脫氫酶1型、減少胰島淀粉樣多肽、糖基化終末產(chǎn)物的沉積，模擬胰島素、刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，減緩糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變及血管病變等作用(張建博等.五沒食子?；咸烟侵委煝蛐吞悄虿〖捌洳l(fā)癥藥效機(jī)制研究進(jìn)展[J].藥學(xué)研究，2015)。五沒食子?；咸烟窃谥委煝蛐吞悄虿〖捌洳l(fā)癥方面的研究報(bào)道，給予天然藥物研究者重要的啟示。

化合物Davidiin(β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖)可以從植物珙桐、頭花蓼分離得到。其在藥材頭花蓼中含量在1％左右，且有抗肝癌(Wang Y et al.A potential antitumor ellagitannin,davidiin,inhibited hepatocellular tumor growth by targeting EZH2[J].Tumour Biol，2014)、抑制SUMO蛋白質(zhì)修飾化(M Takemoto et al.Inhibition of Protein Sumoylation By Davidiin,an Ellagitannin From Davidia Involucrata[J].The Journal of Antibiotics，2014)并能抑制阿片受體、多巴胺2受體、ɑ2腎上腺素受體、β腎上腺素受體活性(Zhu M et al.Plant Polyphenols:Biologically Active Compounds Or Non-selective Binders to Protein[J].Phytochemistry，1997)等作用。本發(fā)明人驚喜地發(fā)現(xiàn)β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲酰基-2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物具有降血糖、降血脂、防治糖尿病腎 臟病變的新功能，因而，宜進(jìn)一步開發(fā)新的適應(yīng)癥藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于研究設(shè)計(jì)β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物在制備抗糖尿病、高血脂及慢性腎損傷等并發(fā)癥中藥物的新用途。

本發(fā)明提供了β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物在制備預(yù)防/治療糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述與糖尿病相關(guān)并發(fā)癥為高血脂或慢性腎損傷的病癥。

本發(fā)明提供了β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物在制備預(yù)防/治療糖尿病相關(guān)高血脂藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物在制備預(yù)防/治療糖尿病相關(guān)慢性腎損傷藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物通過從中藥頭花蓼中分離純化所得。

所述β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲酰基-2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物的英文名為Davidiin，結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明人進(jìn)行了β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物的糖尿病動(dòng)物模型試驗(yàn)，證實(shí)化合物β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物具有降血糖、降血脂以及防治糖尿病腎臟病變功能。α-淀粉酶活性抑制實(shí)驗(yàn)顯示β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物對(duì)α-淀粉酶具有顯著的抑制效果。小鼠淀粉耐量 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：給藥前，各實(shí)驗(yàn)組小鼠體重沒有顯著性差異；給藥后，與對(duì)照組比較，化合物低、中、高劑量組灌胃給藥能顯著降低小鼠的餐后血糖，并且高、中、低三劑量組呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。由此說明，β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物對(duì)高血糖具有治療作用。β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物(Davidiin)對(duì)鏈脲菌素糖尿病大鼠的糖、脂代謝及糖尿病腎臟病變的影響試驗(yàn)，結(jié)果顯示其能夠降低餐后血糖水平，改善受損葡萄糖耐量，阻滯血紅蛋白蛋白的糖基化、降低胰島素抵抗、促進(jìn)胰島細(xì)胞再生，緩解氧化應(yīng)激壓力，長期服用還能夠改善糖脂代謝、延遲或防治腎病變的發(fā)生和發(fā)展。因此，β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物可用于制備預(yù)防/治療糖尿病相關(guān)高血脂藥物。

本發(fā)明提供了從中藥頭花蓼中分離純化制備β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物的方法。

該方法包括下列步驟：

(1)取頭花蓼藥材粉碎，先以2-4倍于藥材的50％-70％乙醇W/L浸潤12h，然后滲漉提取，流速為1.5BV/h，TLC薄層板檢測提取完全，收集滲漉液，減壓濃縮(55℃，0.08-0.1MPa)至無醇味得提取液，取提取液依次用0.5-1.5倍于藥材體積的石油醚萃取1-3次，棄除萃取液，萃取后的水部位再用0.5-1.5倍于藥材體積的乙酸乙酯萃取1-3次，棄除萃取液，將萃取后的水部位再用0.5-1.5倍于藥材體積的正丁醇萃取1-3次，收集萃取液，減壓濃縮(55℃，0.08-0.1MPa)得正丁醇浸膏，然后取正丁醇浸膏加入1倍于浸膏重量的水W/L混懸后通過大孔樹脂柱，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇洗脫，洗脫液為柱體積的10倍～15倍，分別得到水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇洗脫液，分別減壓濃縮(55℃，0.08-0.1MPa)至無醇味的浸膏；(2)取上述30％乙醇洗脫液浸膏，用體積比為1:1的甲醇：水溶解，經(jīng)MCI～CHP20P凝膠柱色譜，以體積比為的1:9～1:0甲醇：水梯度洗脫，TLC薄層板檢測，得到7個(gè)流份Fr₁-Fr₇；取流份Fr₃經(jīng)凝膠柱LH-20體積比為1:9～1:0的甲醇：水體積比為1:9～1:0梯度洗脫純化2次，減壓濃縮(55℃，0.08-0.1MPa)至棕黃色晶型粉末，得β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物。

經(jīng)各波譜數(shù)據(jù)解析確認(rèn)結(jié)構(gòu)為化合物β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖(Davidiin)，高效液相色譜法檢測，純度為98.1％。

本發(fā)明所述藥物為由β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物作為活性成分與藥用輔料組成的藥物組合物。

現(xiàn)有研究僅提供β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲酰基-2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物具有一定的抗腫瘤作用等；但是均未有該化合物用于糖尿病、高血脂及相關(guān)并發(fā)癥研究作用方面的報(bào)道。本發(fā)明首次公開了所述化合物具有降血糖、降血脂以及防治糖尿病腎臟病變的功能，為防治糖尿病提供了新的藥物。中藥頭花蓼來源豐富，分離純化工藝簡單，成本低，藥物無副作用，安全性好，具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1不同藥物濃度的α-淀粉酶抑制率(實(shí)施例2)

Davidiin；阿卡波糖

橫坐標(biāo)：濃度(單位μg/ml)；縱坐標(biāo)：抑制率(單位％)

圖2藥物治療對(duì)大鼠胰島組織病理的影響(HE，×400)(實(shí)施例4)

A:正常對(duì)照組大鼠(Normal control)B：糖尿病模型組(Diabetic control)

C：阿卡波糖組(Diabetic+acarbose)D：Davidiin低劑量組(Diabetic+5mg/kg*d)

E：Davidiin中劑量組(Diabetic+15mg/kg*d)F：Davidiin高劑量組(Diabetic+45mg/kg*d)

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1化合物β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖(Davidiin)的制備

取市售頭花蓼藥材20kg，粉碎，先以40L的70％乙醇浸潤12h，然后滲漉提取，流速為1.5BV/h(BV為藥材重量)，TLC薄層板檢測是否提取完全，收集滲 漉液，減壓濃縮(55℃)至無醇味得粗提物浸膏(相對(duì)密度為1.1～1.2)；每次用10L的石油醚萃取，萃取液為石油醚部位、萃取后的殘留液再用20L的乙酸乙酯萃取，萃取液為乙酸乙酯部位、再將萃取后的殘留液用10L的正丁醇萃取，萃取液為正丁醇部位，分別萃取2次，TLC薄層板檢測是否萃取完全；取正丁醇部位減壓濃縮(55℃)得正丁醇浸膏，稱其重量為1012g，得率為5.06％，然后取正丁醇浸膏500g加入500mL的水混懸后通過D-101型大孔樹脂柱，依次用10L的水、8L的10％乙醇、8L的30％乙醇、5L的50％乙醇、5L的70％乙醇和8L的95％乙醇洗脫，分別得到水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇洗脫液，分別減壓濃縮(55℃)至無醇味的浸膏(相對(duì)密度為1.12～1.18)，稱其重量分別為172g、105g、31g、41g、58g和87g。

取上述其中30％乙醇洗脫液浸膏，用50mL的甲醇：水(1:1)的混合溶液溶解，經(jīng)MCI～CHP 20P凝膠柱色譜，以甲醇：水1:9～1:0梯度洗脫，TLC薄層板檢測，得到7個(gè)流份(Fr₁-Fr₇)。流份Fr₃經(jīng)凝膠柱(LH-20)甲醇：水體積比為1:9～1:0梯度洗脫純化2次，55℃條件下減壓濃縮至棕黃色晶體，即為目標(biāo)化合物(1083mg)。

經(jīng)各種波譜數(shù)據(jù)解析確認(rèn)結(jié)構(gòu)為化合物β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖(Davidiin)

ESI-MS m/z 937.10[M-H]⁺；

棕黃色晶體；

ESI-MS m/z:953.1[M+Na]⁺；IR:3047,1724,1620,1536,1454；

¹H-NMR(600MHz，CD₃OD，δppm):6.69(1H,d,J＝3.0Hz,H-1),5.42(1H,dd,J＝3.0,8.0Hz,H-2),5.72(1H,d,J＝8.0Hz,H-3),5.10(1H,s,H-4),4.38(1H,m,H-5),5.32(1H,d,J＝13.0Hz,H-6),4.03(1H,d,J＝13.0Hz,H-6),6.57,7.06,7.24(2H,s,H-2'/H-2”),6.87(2H,s,H-2”'/H-6”'),6.89(2H,s,H-2””/H-6””),6.94(2H,s,H-2””'/H-6””')；

¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD，δppm):65.6(C-6),70.8(C-2),75.1(C-3),74.4(C-4),77.8(C-5),90.5(C-1),165.9,166.4,166.8,167.4,167.9(-COO-),117.1 (C-1'),118.2(C-1”),120.4(C-2'),124.6(C-2”),109.1(C-3'),112.5(C-3”),145.4(C-4'),145.8(C-4”)137.0(C-5'),138.8(C-5”),145.8(C-6'),146.2(C-6”),121.6(C-1”'/C-1””/C-1””'),110.3(C-2”'/C-2””/C-2””'),144.5(C-3”'/C-3””/C-3””'),139.8(C-4”'/C-4””/C-4””'),144.8(C-5”'/C-5””/C-5””'),110.8(C-6”'/C-6””/C-6””').

高效液相色譜法檢測，純度為98.1％。

實(shí)施例2化合物β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲酰基-2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖化合物(Davidiin)α-淀粉酶活性抑制實(shí)驗(yàn)

1.實(shí)驗(yàn)用品

α-淀粉酶：美國sigma公司；

二甲基亞砜：上海博光生物科技有限公司；

阿卡波糖：德國Bayer公司；

酶標(biāo)儀：美國Bio-Tek公司；

化合物β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖(Davidiin)，由實(shí)施例1制備

其他所用試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)方法

一系列不同濃度的待測樣品溶液25μl，再加入12.5μlα-淀粉酶溶液(含量為27.8mg/L，25mM的PIPES緩沖液配制而成，PH6.9)，37℃溫孵10min，向體系中加入12.5μl濃度為0.16％的淀粉溶液，37℃溫孵，在10min結(jié)束時(shí)向體系中加入100μl顯色試劑，同時(shí)終止反應(yīng)，在630nm波長下測定吸光度(A)，反應(yīng)剩余顯色試劑的量反映被酶水解的淀粉的量，直接反映淀粉酶的活性。阿卡波糖作為本法的陽性對(duì)照，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照，酶活性對(duì)照。抑制率(％)計(jì)算公式如下：

抑制率(％)＝[1-(樣品withoutE-樣品withE)/(對(duì)照withoutE-對(duì)照withE)]×100％

見圖1不同藥物濃度的α-淀粉酶抑制率

Davidiin；阿卡波糖

橫坐標(biāo)：濃度(單位μg/ml)；縱坐標(biāo)：抑制率(單位％)

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖對(duì)α-淀粉酶具有顯著的抑制效果，呈劑量依賴型，隨著其濃度的增加，酶的抑制活性也隨之增強(qiáng)。IC50值為124.7μg/ml，95％置信區(qū)間116.3～133.7，效果優(yōu)于同濃度的阿卡波糖(阿卡波糖IC50值為327.1μg/ml，95％置信區(qū)間291.9～366.5。

實(shí)施例3化合物β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖(Davidiin)小鼠淀粉耐量實(shí)驗(yàn)

1.材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

阿卡波糖(拜耳，50mg/片)，玉米淀粉(一招鮮，袋裝，458g)，血糖測定試紙(Major Ⅱ)

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002；體重：20g左右；性別：雄性；每組10只)。

1.3實(shí)驗(yàn)藥物

化合物β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖(Davidiin)，由實(shí)施例1制備；臨用前，化合物烘干(50～60℃環(huán)境下烘干至恒重)，然后分別精密稱取化合物50mg、100mg、200mg，加入10ml0.5％羧甲基纖維素鈉，分別配成濃度為5mg/ml、10mg/ml和20mg/ml的懸浮液與2.5g/kg淀粉等體積混合后，作為化合物低、中、高劑量組，其化合物的濃度分別為2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml。

1.4給藥方法

給藥體積均為0.1ml/10g體重，對(duì)照組給等體積的淀粉，全部采用灌胃法給藥。確定化合物給藥量分別為25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

將50只ICR小鼠隨機(jī)分成5組，在適應(yīng)性飼養(yǎng)2-3天后，稱取體重，按體重隨機(jī)分組(每組體重相等)，每組10只。撤除食物及墊料饑餓12h，分為對(duì)照組、陽性對(duì)照組(阿卡波糖，給藥劑量25mg/kg)，Davidiin低、中、高劑量組，然后一起灌胃給藥。給糖前測定血糖，在給糖后30min，60min，120min時(shí)各測

定血糖一次，然后計(jì)算AUC(area under the curve)，計(jì)算公式如下：

注：BG:blood glucose血糖

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用spss16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間多項(xiàng)數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以表示，P＜0.05作為顯著性差異。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1小鼠各組體重情況，見表1

表1給藥前小鼠的體重情況(數(shù)據(jù)以均數(shù)表示，g，n＝10)

2.2小鼠給糖前(0min)，給糖后30min、60min、120min的血糖及AUC值見表2。

表2單體化合物灌胃后小鼠餐后血糖(mg/dl,n＝10,)

注：給藥組與對(duì)照組比較，^*P<0.05，^**P<0.01

3.結(jié)論

給藥前，各實(shí)驗(yàn)組小鼠體重沒有顯著性差異；給藥后，與對(duì)照組比較，化合物低、中、高劑量組灌胃給藥能顯著降低小鼠的餐后血糖，并且高、中、低三劑量組呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。因此化合物β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖對(duì)高血糖具有治療作用。

實(shí)施例4化合物β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖(Davidiin)對(duì)鏈脲菌素糖尿病大鼠的糖、脂代謝及糖尿病腎臟病變的影響

1.材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，雄性，體重170-190g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SCXK(滬)2013-0016。飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室溫20℃，相對(duì)濕度45％左右，光暗周期(12h/12h)，實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物自由進(jìn)食水。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物

化合物β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖(Davidiin)，由實(shí)施例1制備；臨用時(shí)用0.5％的羧甲基纖維素鈉溶液配成相應(yīng)濃度的混懸液。

阿卡波糖片(拜糖平)：拜耳醫(yī)藥保健有限公司，國藥準(zhǔn)字H19990205，批號(hào)BJ24830；動(dòng)物灌胃使用前用0.5％羧甲基纖維素鈉溶液配制成所需濃度溶液。

1.3主要試劑及儀器

高脂飼料：上海普路騰生物科技有限公司；許可證號(hào)為滬飼證(2014)04001；

羧甲基纖維素：生工生物工程(上海)股份有限公司；批號(hào)：AA27BA0024；

二水合檸檬酸三鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；批號(hào)：20150629；

一水合檸檬酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；批號(hào)：20150804；

鏈脲佐菌素：上海源葉生物科技有限公司；批號(hào)：NO2N6Q5278；

茂晶血糖測試片(Major Ⅱ)：茂晶生技股份有限公司；批號(hào)：5707787277；國食藥監(jiān)械(許)字2400021號(hào)；

葡萄糖測定試劑盒：上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；批號(hào)：20151105147

SOD測試盒：南京建成生物工程研究所；批號(hào)：20151224；

丙二醛(MDA)測試盒：南京建成生物工程研究所；批號(hào)：20151225；

肌酐(Cr)測試盒：南京建成生物工程研究所；批號(hào)：20151218；

總膽固醇測試盒：南京建成生物工程研究所；批號(hào)：20151225；

甘油三酯測試盒：南京建成生物工程研究所；批號(hào)：20151226；

高密度脂蛋白測試盒：南京建成生物工程研究所；批號(hào)：20151225；

低密度脂蛋白測試盒：南京建成生物工程研究所；批號(hào)：20151226；

大鼠糖化血紅蛋白試劑盒：美國RB進(jìn)口分裝；貨號(hào)：DRE20948；批號(hào)：201512；

大鼠腫瘤壞死因子α：美國RB進(jìn)口分裝；貨號(hào)：DRE20040；批號(hào)：20151226；

大鼠胰島素：美國RB進(jìn)口分裝；貨號(hào)：DRE20732；批號(hào)：20151226；

茂晶血糖測試儀：茂晶生技股份有限公司；

Screen Master 3000雙通道半自動(dòng)生化分析儀：hospitex公司；

多功能酶標(biāo)儀：Tecan公司；

洗板機(jī)：Thermo Labsystems公司；

移液器：吉爾森P型移液器(Pipetman)

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物造模

雄性Wistar大鼠75只，適應(yīng)性詞養(yǎng)1周，隨機(jī)抽取10只作為正常組，普通飼料飼養(yǎng)；其余65只大鼠采用高脂飼料(基礎(chǔ)飼料59.75％，酪蛋白19％，豬油10％，蔗糖10％，膽固醇1％，膽鹽0.25％，普通及高脂飼料均購于上海斯萊康有限公司)。

飼養(yǎng)2周后，高脂飼料飼養(yǎng)組動(dòng)物禁食12h，鏈脲佐菌素(STZ)按35mg/kg給大鼠腹腔注射，普通詞料飼養(yǎng)組大鼠同時(shí)注射等體積的檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液，1w后測定各動(dòng)物隨機(jī)血糖及空腹血糖(禁食時(shí)間8:00-14:00)，隨機(jī)血糖值≧200mg/dl且空腹血糖值≧126mg/dl的動(dòng)物視為模型成功。

1.2.2動(dòng)物分組

將符合糖尿病模型要求的大鼠50只，按血糖、體重隨機(jī)分為5組，每組10只大鼠，分別為糖尿病模型組(Diabetic control)、阿卡波糖組(Diabetic+acarbose)、Davidiin低劑量組(Diabetic+5mg/kg*d)、Davidiin中劑量組(Diabetic+15mg/kg*d)、Davidiin高劑量組(Diabetic+45mg/kg*d)；上述5組以高脂飼料繼續(xù)飼養(yǎng)4周。另有正常對(duì)照組大鼠(Normal control)10只。

1.2.3標(biāo)本制備

給藥4周后，各組大鼠禁食，然后經(jīng)腹腔注射水合氯醛(400mg/kg)麻醉，分離腹主動(dòng)脈并取血，取1ml加入抗凝管中(用作測定糖化血紅蛋白)；其余血標(biāo)本，肝素抗凝，3000rpm/min離心15min。取上清分裝保存，用于其他指標(biāo)檢測。大鼠采血后，暴露胰腺和肝臟，迅速將胰腺周圍的組織分離干凈，取下整個(gè)胰腺，從胰頭部迅速剪取約1mm3的胰腺組織，生理鹽水沖洗干凈，浸泡于固定液中。

1.2.4指標(biāo)檢測

于給藥后每周(0、1、2、3、4周)的同一時(shí)間記錄大鼠的一般狀態(tài)，包括實(shí)驗(yàn)大鼠的精神狀態(tài)、毛色、體重、攝食量、尿量等情況；測定動(dòng)物給藥0、1、2、3、4周隨機(jī)血糖；給藥三周后，各組大鼠進(jìn)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)；血漿甘油三酯、膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血糖、胰島素、SOD、MDA、肌酐等生化指標(biāo)及糖化血紅蛋白、TNF-α。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用spss 16.0軟件(美國IBM公司)進(jìn)行處理分析，測定數(shù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)間比較采方差分析檢驗(yàn)，p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1大鼠一般情況觀察

正常對(duì)照組大鼠體重增加明顯，精神狀況良好，毛皮有光澤，動(dòng)作自如，反應(yīng)靈敏。糖尿病模型組大鼠精神逐漸萎靡、明顯消瘦、多尿、多飲、毛豎無光澤；治療組精神狀況良好，較正常對(duì)照組稍差。

2.2大鼠血糖水平的變化

分別于給藥1周、2周、3周、4周，測各組大鼠非禁食血糖(9:30AM)，結(jié)果見表3。高脂飼料飼養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素可致使大鼠非禁食血糖水平顯著增高(p<0.01)；Davidiin給藥能夠降低高血糖大鼠非禁食血糖，并呈現(xiàn)劑量關(guān)系；與糖尿病模型組比較，Davidiin中劑量組給藥3周、4周后顯著降低非禁食血糖水平(p<0.05)；Davidiin高劑量組給藥2周后，非禁食血糖較模型對(duì)照組顯著下降(p<0.05)，給藥3周、4周后血糖下降非常顯著(p<0.01)。

表3藥物治療對(duì)大鼠非禁食血糖的影響(mg/dl，)

^#p<0.05，^##p<0.01，與正常對(duì)照組比較；*p<0.05，**p<0.01，與糖尿病模型組比較

2.3給藥對(duì)大鼠糖耐量異常的改善

給藥3周后，大鼠禁食不禁水12h，進(jìn)行口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4；糖尿病模型組大鼠的空腹血糖和糖負(fù)荷后各測定時(shí)間點(diǎn)血糖水平顯著高于正常對(duì)照組，差異非常顯著(p<0.01)；與糖尿病模型組比較，阿卡波糖組大鼠葡萄糖負(fù)荷后各時(shí)間點(diǎn)血糖水平下降非常顯著(p<0.01)，但空腹血糖(0min)無顯 著差異；Davidiin給藥明顯改善糖耐量異常，降低空腹血糖，并改善糖負(fù)荷后各時(shí)間點(diǎn)的血糖水平，各劑量均能顯著降低糖負(fù)荷后血糖曲線下面積，并呈現(xiàn)劑量關(guān)系；與糖尿病模型組比較，Davidiin高劑量組灌胃葡萄糖后30min、60min血糖水平降低非常顯著(p<0.01)，120min血糖水平降低顯著(p<0.05)，糖負(fù)荷后血糖曲線下面積降低非常顯著；與阿卡波糖組不同的是，Davidiin高劑量組能非常顯著的降低空腹血糖水平(p<0.01)。

表4藥物治療對(duì)于糖耐量異常的影響(mg/dl，)

^#p<0.05，^##p<0.01，與正常對(duì)照組比較；*p<0.05，**p<0.01，與糖尿病模型組比較

2.4給藥對(duì)大鼠糖化血紅蛋白的影響

給藥4周后，處死動(dòng)物，血液樣本測定各組大鼠糖化血紅蛋白(HbA1c)水平，結(jié)果見表5。與正常對(duì)照組大鼠相比，糖尿病模型組大鼠糖化血紅蛋白顯著升高(p<0.05)，給藥組糖化血紅蛋白水平糖尿病較模型組降低，Davidiin高劑量給藥有顯著作用(p<0.05)，阿卡波糖給藥有非常顯著的作用(p<0.01)。

表5藥物治療對(duì)大鼠糖化血紅蛋白的影響(nmol/L，)

^#p<0.05，^##p<0.01，與正常對(duì)照組比較；*p<0.05，**p<0.01，與糖尿病模型組比較

2.5給藥對(duì)大鼠血漿血糖、胰島素的影響

給藥4周后，測定各組大鼠血糖(FBG)、胰島素(Insulin)水平，結(jié)果見表6。與正常對(duì)照組大鼠相比，糖尿病模型組大鼠血漿血糖升高非常顯著(p<0.01)；Davidiin給藥組血漿血糖水平較糖尿病較模型組降低，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，其中Davidiin高劑量組差異顯著(p<0.05)；阿卡波糖組血糖水平無顯著變化。各組大鼠胰島素水平比較，與正常對(duì)照組大鼠相比，糖尿病模型組大鼠血漿胰島素升高非常顯著(p<0.01)；給藥組血漿胰島素水平較糖尿病較模型組降低，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)；阿卡波糖及Davidiin中劑量組、高劑量給藥作用非常顯著(p<0.01)。

表6藥物治療對(duì)大鼠空腹血糖、血漿胰島素的影響

^#p<0.05，^##p<0.01，與正常對(duì)照組比較；*p<0.05，**p<0.01，與糖尿病模型組比較

2.6給藥對(duì)大鼠HOMA-IR(穩(wěn)態(tài)胰島素評(píng)價(jià)指數(shù))和HOMA-β(胰島β細(xì)胞功能)的影響

計(jì)算各組大鼠HOMA-IR和HOMA-β，結(jié)果見表7。與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組的HOMA-IR升高非常顯著(P<0.01)；與糖尿病模型組比較，化合物給藥各組HOMA-IR均有所降低，高劑量組差異顯著(P<0.05)；阿卡波糖組HOMA-IR則未表現(xiàn)出下降。糖尿病模型組HOMA-β較正常對(duì)照組下降非常顯著(P<0.01)；各給藥組與糖尿病模型組比較，無顯著差異。

表7藥物治療對(duì)大鼠HOMA-IR和HOMA-β的影響

^#p<0.05，^##p<0.01，與Normal control比較；*p<0.05，**p<0.01，與Diabetic control比較

2.7給藥對(duì)大鼠血漿血脂的影響

給藥4周后，測定各組動(dòng)物血漿血脂水平，結(jié)果見表8。與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組的甘油三酯(TG)及總膽固醇(TCHO)水平升高非常顯著(P<0.01)；與糖尿病模型組比較，各給藥治療組甘油三酯水平均有所降低，Davidiin高劑量組與阿卡波糖組差異顯著(P<0.05)；與糖尿病模型組比較，阿卡波糖組大鼠血漿總膽固醇水平無顯著變化，Davidiin中劑量組、高劑量組大鼠血漿總膽固醇水平下降非常顯著(P<0.01)，且Davidiin治療呈現(xiàn)劑量關(guān)系。

表8藥物治療給藥對(duì)糖尿病大鼠血脂的影響(mmol/L，)

^#p<0.05，^##p<0.01，與正常對(duì)照組比較；*p<0.05，**p<0.01，與糖尿病模型組 比較

2.8給藥對(duì)大鼠血漿SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)的影響

給藥4周后，測定各組動(dòng)物血漿SOD、MDA水平，結(jié)果見表9。與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠血漿SOD水平有所下降，但無顯著差異；與糖尿病模型組比較，Davidiin各劑量組、阿卡波糖組SOD水平均顯著升高，差異非常顯著(P<0.01)。各組大鼠血漿MDA水平比較，與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠血漿MDA水平顯著升高(P<0.05)；與糖尿病模型組比較，Davidiin高劑量組、阿卡波糖組MDA水平均顯著下降，差異非常顯著(P<0.01)。

表9藥物治療對(duì)糖尿病大鼠血漿SOD、MDA水平的影響

^#p<0.05，^##p<0.01，與正常對(duì)照組比較；*p<0.05，**p<0.01，與糖尿病模型組比較

2.9給藥對(duì)大鼠血漿肌酐的影響

給藥4周后，處死動(dòng)物，測定各組動(dòng)物血漿肌酐水平，結(jié)果見表10。與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠血漿Cr水平顯著升高，差異非常顯著(P<0.01)；與糖尿病模型組比較，Davidiin各劑量組Cr水平均有所下降，高劑量組差異顯著(P<0.05)；阿卡波糖組Cr水平無顯著變化。

表10藥物治療對(duì)大鼠血漿肌酐的影響(μmol/L，)

^#p<0.05，^##p<0.01，與正常對(duì)照組比較；*p<0.05，**p<0.01，與糖尿病模型組比較

2.10給藥對(duì)大鼠胰島組織病理的影響

正常對(duì)照組大鼠胰島β細(xì)胞數(shù)量較多，呈條索狀排列于胰島的中心，胞質(zhì)豐富，呈嗜酸性，核圓形深染；α細(xì)胞散在或成團(tuán)分布于胰島周邊部，胞質(zhì)較少，體積比β細(xì)胞小。糖尿病模型組大鼠胰島胰島萎縮，數(shù)量減少，分布稀疏，胰島細(xì)胞發(fā)生退行性改變，數(shù)目亦減少；HE染色后觀察，周圍結(jié)締組織和基膜不完整，形態(tài)不規(guī)則，胰島β細(xì)胞數(shù)目減少，空泡增多，細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)著色淺，分布不均、邊集，部分細(xì)胞核缺失，部分胞核固縮或呈殘影；胰島中心偶見β細(xì)胞出現(xiàn)再生，再生細(xì)胞核大，核仁突出。阿卡波糖組較糖尿病模型組胰島輪廓比較完整，胰島細(xì)胞數(shù)量較多，分布較規(guī)則，胞漿較飽滿；Davidiin給藥組較糖尿病模型組胰島輪廓比較完整，胰島β再生出現(xiàn)不同程度增多，空泡減少，胞漿較飽滿，但與正常對(duì)照組比較胰島數(shù)目較少，胰島細(xì)胞形態(tài)欠規(guī)則。

圖2藥物治療對(duì)大鼠胰島組織病理的影響(HE，×400)

A:正常對(duì)照組大鼠(Normal control)B：糖尿病模型組(Diabetic control)

C：阿卡波糖組(Diabetic+acarbose)D：Davidiin低劑量組(Diabetic+5mg/kg*d)

E：Davidiin中劑量組(Diabetic+15mg/kg*d)F：Davidiin高劑量組(Diabetic+45mg/kg*d)

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)論

上述化合物β-1,6-六羥基聯(lián)苯二甲?；?2,3,4-三沒食子酸基-D-葡萄糖長期應(yīng)用能夠降低餐后血糖水平，改善受損葡萄糖耐量，阻滯血紅蛋白蛋白的糖基化、降低胰島素抵抗、促進(jìn)胰島細(xì)胞再生，緩解氧化應(yīng)激壓力，長期服用還能夠改善糖脂代謝、延遲或防治腎病變的發(fā)生和發(fā)展。