相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2009年8月14日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)61/234,178的優(yōu)先權(quán)。上述申請(qǐng)的內(nèi)容以引用方式合并于此。
背景技術(shù)：
：脫發(fā)是許多化療劑常見(jiàn)且使人痛苦的副作用，目前對(duì)此幾乎沒(méi)有有效的預(yù)防措施。在最近的研究中，接受化療的四十六名患者中的三十五名認(rèn)為脫發(fā)比嘔吐為更大的令人不安的副作用(Tierney等,B.J.Cancer,62:527-528,1990)。目前，患有脫發(fā)的人只能通過(guò)重復(fù)局部施用類(lèi)固醇來(lái)試圖再生脫落的毛發(fā)，或能通過(guò)局部施用米諾地爾來(lái)試圖維持毛發(fā)生長(zhǎng)。此外，盡管有著一些有前途的研究，目前沒(méi)有批準(zhǔn)的能夠在化療治療期間防止脫發(fā)副作用發(fā)生的治療劑。例如，使用幼年大鼠模型，已表明ImuVert(由細(xì)菌粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑)保護(hù)動(dòng)物免受由阿糖胞苷或阿霉素引起的脫發(fā)(Hussein等,Science249:1564-1566,1990)。在隨后的研究中，也觀察到重組白細(xì)胞介素-1(IL-1)β有著免受ARA-C-引起的脫發(fā)的類(lèi)似的保護(hù)作用(Jimenez等,FASEBJ.1991)。盡管有著這些有前途的結(jié)果，仍然需要能治療患有這種疾病的患者，還能預(yù)防接受癌癥治療的患者的化療引起的脫發(fā)的安全且有效的治療劑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及維生素D化合物(例如維生素D3或鈣三醇及其類(lèi)似物或其代謝物)、其劑型和制劑在預(yù)防或治療脫發(fā)(例如，化療引起的脫發(fā)(CIA))中的用途。因此，一方面，本發(fā)明提供通過(guò)將藥物組合物局部施用于個(gè)體來(lái)預(yù)防或治療個(gè)體脫發(fā)的方法，所述藥物組合物包含配制成遞送至表皮同時(shí)基本上避免真皮遞送的治療有效量的維生素D化合物。在一些實(shí)施方式中，所述藥物組合物包含約40％(w/w)丙二醇和約60％(w/w)無(wú)水乙醇(200proof,U.S.)；或約30％(w/w)丙二醇、約10％(w/w)乙氧基二甘醇或二乙二醇單乙基醚(transcutol)和約60％(w/w)無(wú)水乙醇(200proof,U.S.)。在其他實(shí)施方式中，所述維生素D化合物由式(I)及其藥學(xué)可接受的鹽表示：其中a和b各自獨(dú)立為單鍵或雙鍵；當(dāng)a是雙鍵時(shí)，X是-CH2；或當(dāng)a是單鍵時(shí)，X是氫或羥基取代的烷基；R1是氫、羥基、烷氧基、三烷基甲硅烷基或烷基，任選被一到三個(gè)鹵素、羥基、氰基或-NR’R”基團(tuán)取代；R2是氫、羥基、-O-三烷基甲硅烷基或烷基、烷氧基或鏈烯基，任選被一到三個(gè)鹵素、羥基、氰基或-NR’R”基團(tuán)取代；當(dāng)b是雙鍵時(shí)，R3不存在，或當(dāng)b是單鍵時(shí)，R3是氫、羥基或烷基，或R3和R1連同它們所連接的碳原子可連接形成5-7元碳環(huán)；當(dāng)b是雙鍵時(shí)，R4不存在，或當(dāng)b是單鍵時(shí)，R4是氫、鹵素或羥基；當(dāng)a是雙鍵時(shí)，R5不存在，或當(dāng)a是單鍵時(shí)，R5是氫、鹵素或羥基；R6是烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷基-O-烷基、烷基-CO2-烷基，任選被一到五個(gè)羥基、氧代、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR’R”基團(tuán)取代；R7是烷基，任選被一到三個(gè)羥基、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR’R”基團(tuán)取代；和R’和R”各自獨(dú)立為氫、羥基、鹵素、烷基或烷氧基。在一些其他實(shí)施方式中，所述維生素D化合物由式(II)及其藥學(xué)可接受的鹽表示：其中c是單鍵或雙鍵；R1a是氫、三烷基甲硅烷基或烷基，任選被一到三個(gè)鹵素、羥基、氰基或-NR’R”基團(tuán)取代；R2a是氫、羥基、-O-三烷基甲硅烷基、或烷基、烷氧基或鏈烯基，任選被一到三個(gè)鹵素、羥基、氰基或-NR’R”基團(tuán)取代；當(dāng)c是雙鍵時(shí)，R3a、R4a不存在，或當(dāng)c是單鍵時(shí)，R3a、R4a各自獨(dú)立為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，任選被一到三個(gè)羥基或鹵素基團(tuán)取代；R3b、R4b、R5a、R6a、R7a和R8a各自獨(dú)立為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，任選被一到三個(gè)羥基或鹵素基團(tuán)取代；或R6a、R7a和R8a中的任何兩個(gè)可連接形成3-7元碳環(huán)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述維生素D化合物是1,25-二羥基維生素D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維生素D3、1α,24-二羥基維生素D3或MC903。在其他實(shí)施方式中，所述維生素D化合物不是1,25-二羥基維生素D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維生素D3、1α,24-二羥基維生素D3或MC903。在其他實(shí)施方式中，所述維生素D化合物和等量鈣三醇在正常角質(zhì)形成細(xì)胞中具有類(lèi)似或相同的基因調(diào)節(jié)特征。在一些實(shí)施方式中，所述維生素D化合物調(diào)節(jié)其表達(dá)水平由等量的鈣三醇調(diào)節(jié)的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)。在其他實(shí)施方式中，所述維生素D化合物調(diào)節(jié)正常角質(zhì)形成細(xì)胞中HSPA2或HSF4mRNA、HSPB1或DNAJC6mRNA的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述維生素D化合物調(diào)節(jié)正常角質(zhì)形成細(xì)胞中SLC1A1、KCNB2、KCNN4或SLC1A3蛋白的表達(dá)。在其他實(shí)施方式中，所述維生素D化合物調(diào)節(jié)表3-1和表3-2中一種或多種蛋白的表達(dá)至少約2倍。在其他實(shí)施方式中，在正常角質(zhì)形成細(xì)胞與所述維生素D化合物接觸約24小時(shí)后，所述維生素D化合物誘導(dǎo)表3-3、3-4、3-5或3-6中的一種或多種蛋白的過(guò)度表達(dá)。在其他實(shí)施方式中，所述維生素D化合物誘導(dǎo)正常角質(zhì)形成細(xì)胞中GST、角蛋白1、角蛋白17、半乳凝集素1、S100A9(鈣衛(wèi)蛋白)或S100A13的一種或多種的過(guò)度表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，所述脫發(fā)是斑禿(AA)、全禿(AT)、普禿(AU)或化療引起的脫發(fā)(CIA)。在一些其他實(shí)施方式中，所述斑禿包括彌散性斑禿、單一部位斑禿(alopeciaareatamonolocularis)、多個(gè)部位斑禿(alopeciaareatamultilocularis)和須部斑禿(alopeciaareatabarbae)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述脫發(fā)不包括雄激素性脫發(fā)(雄性脫發(fā))或化療后脫發(fā)(PCA)。在一些實(shí)施方式中，所述個(gè)體是靈長(zhǎng)類(lèi)。在其他實(shí)施方式中，所述個(gè)體是人。在其他實(shí)施方式中，所述個(gè)體還未開(kāi)始脫發(fā)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，個(gè)體正在經(jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷化療。在一些其他實(shí)施方式中，在化療之前或在化療的同時(shí)將所述藥物組合物施用于個(gè)體。在又一個(gè)實(shí)施方式中，在化療開(kāi)始后但在脫發(fā)開(kāi)始前將所述藥物組合物施用于個(gè)體。在一些實(shí)施方式中，所述藥物組合物基本上不降低化療功效。在其他實(shí)施方式中，所述化療是全身化療。在一些實(shí)施方式中，所述化療包括以下一種或多種：蒽環(huán)類(lèi)(阿霉素/多柔比星、柔紅霉素、表柔比星、伊達(dá)比星、戊柔比星)、5-FU、貝伐單抗、他莫昔芬、伊立替康、紫杉醇(Taxol)、卡鉑、依托泊苷、癌得星/環(huán)磷酰胺、順鉑、厄洛替尼(特羅凱)、吉西他濱、星形孢菌素、長(zhǎng)春新堿、伊馬替尼(格列衛(wèi))、吉非替尼(易瑞沙)、索拉非尼、達(dá)沙替尼、放線(xiàn)菌素D、六甲蜜胺(HMM，六甲基蜜胺)、異環(huán)磷酰胺、博來(lái)霉素、甲氨蝶呤、多西他賽(泰索帝)、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春瑞濱、拓?fù)涮婵?、安吖啶、阿糖胞苷、白消安、美法侖、長(zhǎng)春堿、洛莫司汀(CCNU)、塞替派、吉西他濱、卡氮芥(BCNU)、米托蒽醌、絲裂霉素C、甲基芐肼、6-巰嘌呤、鏈脲佐菌素、氟達(dá)拉濱、雷替曲塞(拓優(yōu)得)、卡培他濱及其等效物。在其他實(shí)施方式中，所述維生素D化合物以相當(dāng)于約0.1μg鈣三醇/cm2的劑量體積局部施用于個(gè)體。在其他實(shí)施方式中，總劑量相當(dāng)于約2-100μg鈣三醇/75kg體重。在另一方面，本發(fā)明提供預(yù)防或治療個(gè)體脫發(fā)的方法，包括將含有治療有效量維生素D化合物的藥物組合物局部施用于個(gè)體，所述維生素D化合物由式(I)及其藥學(xué)可接受的鹽表示：其中a和b各自獨(dú)立為單鍵或雙鍵；當(dāng)a是雙鍵時(shí)，X是-CH2；或當(dāng)a是單鍵時(shí)，X是氫或羥基取代的烷基；R1是氫、羥基、烷氧基、三烷基甲硅烷基或烷基，任選被一到三個(gè)鹵素、羥基、氰基或-NR’R”基團(tuán)取代；R2是氫、羥基、-O-三烷基甲硅烷基或烷基、烷氧基或鏈烯基，任選被一到三個(gè)鹵素、羥基、氰基或-NR’R”基團(tuán)取代；當(dāng)b是雙鍵時(shí)，R3不存在，或當(dāng)b是單鍵時(shí)，R3是氫、羥基或烷基，或R3和R1連同它們所連接的碳原子可連接形成5-7元碳環(huán)；當(dāng)b是雙鍵時(shí)，R4不存在，或當(dāng)b是單鍵時(shí)，R4是氫、鹵素或羥基；當(dāng)a是雙鍵時(shí)，R5不存在，或當(dāng)a是單鍵時(shí)，R5是氫、鹵素或羥基；R6是烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷基-O-烷基、烷基-CO2-烷基，任選被一到五個(gè)羥基、氧代、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR’R”基團(tuán)取代；R7是烷基，任選被一到三個(gè)羥基、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR’R”基團(tuán)取代；和R’和R”各自獨(dú)立為氫、羥基、鹵素、烷基或烷氧基。其中所述維生素D化合物不是1,25-二羥基維生素D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維生素D3、1α,24-二羥基維生素D3或MC903。在一些實(shí)施方式中，所述維生素D化合物由式(II)及其藥學(xué)可接受的鹽表示：其中c是單鍵或雙鍵；R1a是氫、三烷基甲硅烷基或烷基，任選被一到三個(gè)鹵素、羥基、氰基或-NR’R”基團(tuán)取代；R2a是氫、羥基、-O-三烷基甲硅烷基、或烷基、烷氧基或鏈烯基，任選被一到三個(gè)鹵素、羥基、氰基或-NR’R”基團(tuán)取代；當(dāng)c是雙鍵時(shí)，R3a、R4a不存在，或當(dāng)c是單鍵時(shí)，R3a、R4a各自獨(dú)立為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，任選被一到三個(gè)羥基或鹵素基團(tuán)取代；R3b、R4b、R5a、R6a、R7a和R8a各自獨(dú)立為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，任選被一到三個(gè)羥基或鹵素基團(tuán)取代；或R6a、R7a和R8a中的任何兩個(gè)可連接形成3-7元碳環(huán)。另一方面，本發(fā)明提供預(yù)防或治療個(gè)體脫發(fā)的方法，包括將含有治療有效量維生素D化合物的藥物組合物局部施用于個(gè)體，其中所述維生素D化合物，當(dāng)以如下有效濃度局部施用于個(gè)體時(shí)：(1)約50μg/mL，在給藥至少約連續(xù)25天后不引起毒性；或(2)約100μg/mL，在給藥至少約連續(xù)7天后不引起毒性。又一方面，本發(fā)明提供預(yù)防或治療個(gè)體脫發(fā)的方法，包括將含有用于預(yù)防或治療個(gè)體脫發(fā)的治療有效量維生素D化合物的藥物組合物局部施用于個(gè)體，而基本上不干擾共施用的化療劑的功效。一方面，本發(fā)明提供預(yù)防或治療個(gè)體脫發(fā)的方法，包括將含有治療有效量維生素D化合物的藥物組合物局部施用于個(gè)體，所述維生素D化合物：(1)在正常角質(zhì)形成細(xì)胞中具有與等量鈣三醇類(lèi)似或相同的基因調(diào)節(jié)特征；(2)調(diào)節(jié)其表達(dá)水平由等量的鈣三醇調(diào)節(jié)的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)；(3)調(diào)節(jié)正常角質(zhì)形成細(xì)胞中HSPA2或HSF4mRNA、HSPB1或DNAJC6mRNA的表達(dá)；(4)調(diào)節(jié)正常角質(zhì)形成細(xì)胞中SLC1A1、KCNB2、KCNN4或SLC1A3蛋白的表達(dá)；(5)調(diào)節(jié)表3-1和表3-2中一種或多種蛋白的表達(dá)至少約2倍；(6)在正常角質(zhì)形成細(xì)胞與所述維生素D化合物接觸約24小時(shí)后，誘導(dǎo)表3-3、3-4、3-5或3-6中的一種或多種蛋白的過(guò)度表達(dá)；或(7)誘導(dǎo)正常角質(zhì)形成細(xì)胞中GST、角蛋白1、角蛋白17、半乳凝集素1、S100A9(鈣衛(wèi)蛋白)或S100A13的一種或多種的過(guò)度表達(dá)。其中所述維生素D化合物不是1,25-二羥基維生素D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維生素D3、1α,24-二羥基維生素D3或MC903。又一方面，本發(fā)明提供用于局部施用的藥物組合物，包含用于預(yù)防或治療脫發(fā)的治療有效量的維生素D化合物，其中所述維生素D化合物配制成遞送至表皮同時(shí)基本上避免真皮遞送。在一些方面，所述藥物組合物包含約40％(w/w)丙二醇和約60％(w/w)無(wú)水乙醇(200proof,U.S.)，未變性的；或約30％(w/w)丙二醇、約10％(w/w)乙氧基二甘醇或二乙二醇單乙基醚和約60％(w/w)無(wú)水乙醇(200proof,U.S.)，未變性的。在一些方面，本發(fā)明提供用于局部施用的藥物組合物，包含用于預(yù)防或治療脫發(fā)的治療有效量的維生素D化合物，其中所述維生素D化合物由式(I)及其藥學(xué)可接受的鹽表示：其中a和b各自獨(dú)立為單鍵或雙鍵；當(dāng)a是雙鍵時(shí)，X是-CH2；或當(dāng)a是單鍵時(shí)，X是氫或羥基取代的烷基；R1是氫、羥基、烷氧基、三烷基甲硅烷基或烷基，任選被一到三個(gè)鹵素、羥基、氰基或-NR’R”基團(tuán)取代；R2是氫、羥基、-O-三烷基甲硅烷基或烷基、烷氧基或鏈烯基，任選被一到三個(gè)鹵素、羥基、氰基或-NR’R”基團(tuán)取代；當(dāng)b是雙鍵時(shí)，R3不存在，或當(dāng)b是單鍵時(shí)，R3是氫、羥基或烷基，或R3和R1連同它們所連接的碳原子可連接形成5-7元碳環(huán)；當(dāng)b是雙鍵時(shí)，R4不存在，或當(dāng)b是單鍵時(shí)，R4是氫、鹵素或羥基；當(dāng)a是雙鍵時(shí)，R5不存在，或當(dāng)a是單鍵時(shí)，R5是氫、鹵素或羥基；R6是烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷基-O-烷基、烷基-CO2-烷基，任選被一到五個(gè)羥基、氧代、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR’R”基團(tuán)取代；R7是烷基，任選被一到三個(gè)羥基、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR’R”基團(tuán)取代；和R’和R”各自獨(dú)立為氫、羥基、鹵素、烷基或烷氧基；其中所述維生素D化合物不是1,25-二羥基維生素D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維生素D3、1α,24-二羥基維生素D3或MC903。在一些實(shí)施方式中，所述維生素D化合物由式(II)及其藥學(xué)可接受的鹽表示：其中c是單鍵或雙鍵；R1a是氫、三烷基甲硅烷基或烷基，任選被一到三個(gè)鹵素、羥基、氰基或-NR’R”基團(tuán)取代；R2a是氫、羥基、-O-三烷基甲硅烷基、或烷基、烷氧基或鏈烯基，任選被一到三個(gè)鹵素、羥基、氰基或-NR’R”基團(tuán)取代；當(dāng)c是雙鍵時(shí)，R3a、R4a不存在，或當(dāng)c是單鍵時(shí)，R3a、R4a各自獨(dú)立為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，任選被一到三個(gè)羥基或鹵素基團(tuán)取代；R3b、R4b、R5a、R6a、R7a和R8a各自獨(dú)立為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，任選被一到三個(gè)羥基或鹵素基團(tuán)取代；或R6a、R7a和R8a中的任何兩個(gè)可連接形成3-7元碳環(huán)。在一些其他方面，本發(fā)明提供用于局部施用的藥物組合物，包含用于預(yù)防或治療脫發(fā)的治療有效量的維生素D化合物，其中所述維生素D化合物，當(dāng)以如下有效濃度局部施用于個(gè)體時(shí)：(1)約50μg/mL，在給藥至少約連續(xù)25天后不引起毒性；或(2)約100μg/mL，在給藥至少約連續(xù)7天后不引起毒性。又一方面，本發(fā)明提供用于局部施用的藥物組合物，包含用于預(yù)防或治療脫發(fā)的治療有效量的維生素D化合物，其中當(dāng)與化療劑共施用時(shí)，所述治療有效量的維生素D化合物基本上不干擾化療劑的功效。另一方面，本發(fā)明提供用于局部施用的藥物組合物，包含用于預(yù)防或治療脫發(fā)的治療有效量的維生素D化合物，其中所述治療有效量的維生素D化合物：(1)在正常角質(zhì)形成細(xì)胞中具有與等量鈣三醇類(lèi)似或相同的基因調(diào)節(jié)特征；(2)調(diào)節(jié)其表達(dá)水平由等量的鈣三醇調(diào)節(jié)的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)；(3)調(diào)節(jié)正常角質(zhì)形成細(xì)胞中HSPA2或HSF4mRNA、HSPB1或DNAJC6mRNA的表達(dá)；(4)調(diào)節(jié)正常角質(zhì)形成細(xì)胞中SLC1A1、KCNB2、KCNN4或SLC1A3蛋白的表達(dá)；(5)調(diào)節(jié)表3-1和表3-2中一種或多種蛋白的表達(dá)至少約2倍；(6)在正常角質(zhì)形成細(xì)胞與所述維生素D化合物接觸約24小時(shí)后，誘導(dǎo)表3-3、3-4、3-5或3-6中的一種或多種蛋白的過(guò)度表達(dá)；或(7)誘導(dǎo)正常角質(zhì)形成細(xì)胞中GST、角蛋白1、角蛋白17、半乳凝集素1、S100A9(鈣衛(wèi)蛋白)或S100A13的一種或多種的過(guò)度表達(dá)。其中所述維生素D化合物不是1,25-二羥基維生素D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維生素D3、1α,24-二羥基維生素D3或MC903。應(yīng)注意，適用時(shí)，預(yù)期本發(fā)明(上文和下文)描述的所有實(shí)施方式能與任何其他一種或多種實(shí)施方式組合，包括僅在本發(fā)明的一個(gè)方面中描述的實(shí)施方式，和在本發(fā)明不同方面中描述的實(shí)施方式。附圖說(shuō)明圖1顯示三種皮膚供體的總吸收量和質(zhì)量平衡結(jié)果，以及單次施用經(jīng)48小時(shí)的來(lái)自完整的人尸體皮膚的鈣三醇的分配。結(jié)果以平均值±SE作為總質(zhì)量(ng/cm2)的對(duì)數(shù)標(biāo)尺顯示。圖2顯示HEKa細(xì)胞相對(duì)于生長(zhǎng)介質(zhì)中存在的不同濃度鈣三醇的典型生長(zhǎng)曲線(xiàn)。注意鈣三醇濃度的對(duì)數(shù)標(biāo)尺。圖3顯示胰腺癌細(xì)胞系PaCa2的典型生長(zhǎng)曲線(xiàn)，所述生長(zhǎng)曲線(xiàn)對(duì)0.1μg/mL鈣三醇的存在沒(méi)有反應(yīng)。圖4A和4B分別顯示在濃度增加的鈣三醇的存在下Hep-G2細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)。圖5顯示在不存在(◆)或存在0.1μg/mL鈣三醇(×)時(shí)，厄洛替尼(特羅凱)——一種EGFRTyr激酶抑制劑的劑量曲線(xiàn)。圖6顯示在不存在(◆)或存在0.1μg/mL鈣三醇(×)時(shí)，吉非替尼(易瑞沙)——另一種EGFRTyr激酶抑制劑的劑量曲線(xiàn)。圖7顯示在不存在(◆)或存在0.1μg/mL鈣三醇(×)時(shí)，索拉非尼的劑量曲線(xiàn)。已知索拉非尼抑制若干激酶(Raf、VEGF-R2、c-kit、PDGR-R)。圖8顯示在不存在(◆)或存在0.1μg/mL鈣三醇(×)時(shí)，達(dá)沙替尼的劑量曲線(xiàn)。達(dá)沙替尼抑制BCR/ABLTyr激酶。圖9顯示在不存在(◆)或存在0.1μg/mL鈣三醇(×)時(shí)，星形孢菌素的劑量曲線(xiàn)。星形孢菌素是相對(duì)非特異性的激酶抑制劑。圖10顯示在不存在(◆)或存在0.1μg/mL鈣三醇(×)時(shí)，順鉑的劑量曲線(xiàn)。順鉑是DNA烷化劑。圖11顯示在不存在(◆)或存在0.1μg/mL鈣三醇(×)時(shí)，卡鉑的劑量曲線(xiàn)。卡鉑也是DNA烷化劑。圖12顯示在不存在(◆)或存在0.1μg/mL鈣三醇(×)時(shí)，伊立替康的劑量曲線(xiàn)。圖13顯示在不存在(◆)或存在0.1μg/mL鈣三醇(×)時(shí)，紫杉醇的劑量曲線(xiàn)。圖14顯示在不存在(◆)或存在0.1μg/mL鈣三醇(×)時(shí)，5-FU的劑量曲線(xiàn)。圖15顯示在不存在(◆)或存在0.1μg/mL鈣三醇(×)時(shí)，吉西他濱的劑量曲線(xiàn)。圖16顯示在不存在(◆)或存在0.1μg/mL鈣三醇(×)時(shí)，多柔比星的劑量曲線(xiàn)。圖17顯示在不存在(◆)或存在0.1μg/mL鈣三醇(×)時(shí)，他莫昔芬的劑量曲線(xiàn)。圖18顯示0.1μg/mL鈣三醇保護(hù)正常角質(zhì)形成細(xì)胞HEKa對(duì)抗5-FU，而幾乎不影響5-FU對(duì)抗癌細(xì)胞的ED50值。圖19顯示鈣三醇幾乎不改變多柔比星對(duì)抗癌細(xì)胞系SkBr-3的細(xì)胞毒效果。圖20A顯示在接受依托泊苷的SpragueDawley大鼠中，鈣三醇局部制劑以劑量依賴(lài)性方式保護(hù)化療引起的脫發(fā)(CIA)。左圖：僅接受依托泊苷的大鼠；中圖：接受依托泊苷和局部施用局部制劑中0.1μg的鈣三醇的大鼠；右圖：接受依托泊苷和局部施用局部制劑中0.3mg的鈣三醇的大鼠。圖20B顯示涂上顏色的LongEvans大鼠中的類(lèi)似結(jié)果。圖21顯示鈣三醇局部制劑(總劑量0.2μg)保護(hù)LongEvans大鼠免受環(huán)磷酰胺(CTX)引起的脫發(fā)。圖22A顯示鈣三醇局部制劑(總劑量0.2μg)保護(hù)LongEvans大鼠免受CTX-多柔比星聯(lián)合化療引起的脫發(fā)。圖22B顯示鈣三醇局部制劑在由阿糖胞苷-多柔比星聯(lián)合化療治療的大鼠中對(duì)脫發(fā)的類(lèi)似的保護(hù)結(jié)果。鈣三醇局部制劑在僅由阿糖胞苷治療的大鼠中的保護(hù)效果顯示于圖形22C中。圖23顯示鈣三醇局部制劑(總劑量0.2μg)保護(hù)用MIAC51(綠色白血病細(xì)胞)注射的LongEvans大鼠免受CTX引起的脫發(fā)。圖24顯示，在用MIAC51(綠色白血病細(xì)胞)注射的LongEvans大鼠上進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，鈣三醇局部制劑不保護(hù)癌細(xì)胞免受化療。圖25A和25B顯示從小型豬表皮的角質(zhì)層和表皮其余部分中回收的鈣三醇的估計(jì)水平(ng/mg)。量表示為回收的鈣三醇的平均值±SD。nd＝未檢測(cè)，na＝不適用。圖26顯示施用的鈣三醇劑量與表皮中回收的鈣三醇組織水平之間幾乎線(xiàn)性的相關(guān)性，其中施用的鈣三醇濃度為3到100μg/mL。圖27說(shuō)明鈣三醇對(duì)接受環(huán)磷酰胺的綠色白血病大鼠的第一次毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程的影響。圖27A描繪僅接受環(huán)磷酰胺的大鼠，圖27B描繪接收環(huán)磷酰胺和載體的大鼠，而圖27C描繪接受環(huán)磷酰胺和鈣三醇的大鼠。圖28說(shuō)明鈣三醇對(duì)接受環(huán)磷酰胺的綠色白血病大鼠的第二次毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程的影響。從左到右為僅用環(huán)磷酰胺治療的大鼠、用環(huán)磷酰胺和載體治療的大鼠以及用環(huán)磷酰胺和鈣三醇治療的大鼠。圖29說(shuō)明鈣三醇對(duì)接受環(huán)磷酰胺聯(lián)合多柔比星的綠色白血病大鼠的第一次毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程的影響。圖29A描繪僅接受環(huán)磷酰胺和多柔比星的大鼠，圖29B描繪接收環(huán)磷酰胺、多柔比星和載體的大鼠，而圖29C描繪接受環(huán)磷酰胺、多柔比星和鈣三醇的大鼠。圖30說(shuō)明鈣三醇對(duì)接受環(huán)磷酰胺聯(lián)合多柔比星的綠色白血病大鼠的第二次毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程的影響。從左到右為僅用環(huán)磷酰胺和多柔比星治療的大鼠，用環(huán)磷酰胺、多柔比星和載體治療的大鼠以及用環(huán)磷酰胺、多柔比星和鈣三醇治療的大鼠。圖31說(shuō)明鈣三醇對(duì)接受環(huán)磷酰胺聯(lián)合多柔比星和阿糖胞苷的綠色白血病大鼠的第一次毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程的影響。圖31A描繪僅接受環(huán)磷酰胺、多柔比星和阿糖胞苷的大鼠，圖31B描繪接收環(huán)磷酰胺、多柔比星、阿糖胞苷和載體的大鼠，而圖31C描繪接受環(huán)磷酰胺、多柔比星、阿糖胞苷和鈣三醇的大鼠。圖32說(shuō)明鈣三醇對(duì)接受環(huán)磷酰胺聯(lián)合多柔比星和阿糖胞苷的綠色白血病大鼠的第二次毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程的影響。從左到右為僅用環(huán)磷酰胺、多柔比星和阿糖胞苷治療的大鼠，用環(huán)磷酰胺、多柔比星、阿糖胞苷和載體治療的大鼠以及用環(huán)磷酰胺、多柔比星、阿糖胞苷和鈣三醇治療的大鼠。圖33說(shuō)明鈣三醇對(duì)接受環(huán)磷酰胺聯(lián)合紫杉醇和依托泊苷的綠色白血病大鼠的第一次毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程的影響。圖33A描繪僅接受環(huán)磷酰胺、紫杉醇和依托泊苷的大鼠，圖33B描繪接收環(huán)磷酰胺、紫杉醇、依托泊苷和載體的大鼠，而圖33C描繪接受環(huán)磷酰胺、紫杉醇、依托泊苷和鈣三醇的大鼠。圖34說(shuō)明鈣三醇對(duì)接受環(huán)磷酰胺聯(lián)合紫杉醇和依托泊苷的綠色白血病大鼠的第二次毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程的影響。從左到右為僅用環(huán)磷酰胺、紫杉醇、依托泊苷治療的大鼠，用環(huán)磷酰胺、紫杉醇、依托泊苷和載體治療的大鼠以及用環(huán)磷酰胺、紫杉醇、依托泊苷和鈣三醇治療的大鼠。圖35說(shuō)明鈣三醇對(duì)接受多柔比星聯(lián)合紫杉醇和依托泊苷的綠色白血病大鼠的第一次毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程的影響。圖35A描繪僅接受多柔比星、紫杉醇和依托泊苷的大鼠，圖35B描繪接收多柔比星、紫杉醇、依托泊苷和載體的大鼠，而圖35C描繪接受多柔比星、紫杉醇、依托泊苷和鈣三醇的大鼠。圖36說(shuō)明鈣三醇對(duì)接受多柔比星聯(lián)合紫杉醇和依托泊苷的綠色白血病大鼠的第二次毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程的影響。從左到右為僅用多柔比星、紫杉醇、依托泊苷治療的大鼠，用多柔比星、紫杉醇、依托泊苷和載體治療的大鼠以及用多柔比星、紫杉醇、依托泊苷和鈣三醇治療的大鼠。發(fā)明詳述此處描述的發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)：可預(yù)防或治療脫發(fā)(例如，化療引起的脫發(fā))的維生素D化合物的局部制劑可選擇性地遞送至或積聚在皮膚的表皮層而基本上避免遞送至和/或積聚在較深的真皮層。這可能對(duì)經(jīng)歷化療治療的某些患者有利，其中維生素D化合物的較深積聚可導(dǎo)致化療法功效的降低。這種局部制劑也可能對(duì)具有可由過(guò)量存在的維生素D化合物負(fù)面影響的醫(yī)學(xué)病癥的患者有利，例如患有腎結(jié)石的患者，且其病癥可能一旦經(jīng)歷通過(guò)某種維生素D化合物的鈣動(dòng)員就惡化。因此，在這種患者中，維生素D化合物的理想遞送應(yīng)該是將最小有效量局部遞送至皮膚的表皮層，而不是遞送至富含血管的真皮層。本發(fā)明也部分基于以下發(fā)現(xiàn)：維生素D化合物在相對(duì)低的濃度/劑量時(shí)對(duì)正常角質(zhì)形成細(xì)胞具有溫和的生長(zhǎng)刺激效果，而在相對(duì)高的濃度/劑量時(shí)對(duì)相同細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制效果。因此，本發(fā)明提供具有對(duì)抗脫發(fā)的最佳保護(hù)效應(yīng)，而不引起不合需要的生長(zhǎng)抑制效果的方法和藥物組合物。本發(fā)明還基于以下發(fā)現(xiàn)：維生素D化合物激活或抑制正常角質(zhì)形成細(xì)胞中多個(gè)靶基因的表達(dá)，因此提供了選擇最合適的維生素D化合物用于特定治療用途，以及鑒定具有類(lèi)似生物活性的其他維生素D類(lèi)似物的基礎(chǔ)。盡管不希望被任何特定理論束縛，本發(fā)明制劑可能在最小化藥物對(duì)化療劑的干擾方面是有利的。皮膚的真皮層富含血管，局部藥物滲透該層可以引起藥物干擾全身遞送的化療劑，導(dǎo)致對(duì)癌細(xì)胞的不利的保護(hù)作用。因此，一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)防或治療個(gè)體脫發(fā)的方法，包括將藥物組合物局部施用于個(gè)體，所述藥物組合物包含配制成遞送至表皮而基本上避免真皮遞送和/或積聚的治療有效量的維生素D化合物。術(shù)語(yǔ)“基本上避免真皮遞送和/或積聚”包括與遞送和/或積聚至表皮的維生素D化合物相比，小于約25％的維生素D化合物遞送和/或積聚至真皮，例如當(dāng)與遞送至表皮的量相比，小于約20％、小于約15％、小于約10％、小于約5％、小于約1％或不遞送和/或積聚維生素D化合物至真皮。在一些實(shí)施方式中，約1％到25％的維生素D化合物被遞送和/或積聚至真皮，例如，與遞送和/或積聚至表皮相比，約1％到約20％、約1％到約15％、約1％到約10％或約1％到約5％被遞送和/或積聚至真皮。在一些實(shí)施方式中，維生素D化合物不遞送至和/或積聚在真皮。在一些實(shí)施方式中，遞送至或積聚在真皮中的維生素D化合物的量小于約0.3ng/cm2、小于約0.2ng/cm2或小于約0.1ng/cm2。術(shù)語(yǔ)“脫發(fā)”包括完全或部分毛發(fā)非故意地從個(gè)體的頭或身體脫落，且包括斑禿(AA)、全禿(AT)、普禿(AU)或化療引起的脫發(fā)(CIA)。斑禿可以包括彌散性斑禿、單一部位斑禿、多個(gè)部位斑禿和須部斑禿。在一些實(shí)施方式中，脫發(fā)不包括雄激素性脫發(fā)(雄性脫發(fā)或男性禿)或化療后脫發(fā)(PCA)。脫發(fā)是毛發(fā)從頭或身體的脫落的醫(yī)學(xué)描述，有時(shí)指禿頂?shù)某潭?。與身體毛發(fā)的通常美學(xué)的脫毛不同，脫發(fā)傾向于非故意和不受歡迎的，例如，雄激素性脫發(fā)。然而，它也可以由拔除一個(gè)人自己的毛發(fā)的心理強(qiáng)迫癥(拔毛癖)所引起或自愿的日常發(fā)型的無(wú)法預(yù)料的結(jié)果(從過(guò)緊的馬尾辮或辮子的機(jī)械的“牽拉性脫發(fā)”，或由苛性毛發(fā)松弛劑(hairrelaxer)溶液或熱的燙發(fā)器(hairirons)引起的頭皮燒傷)。在一些情況下，脫發(fā)指示基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)病癥，例如缺鐵癥。當(dāng)毛發(fā)僅在一個(gè)部分脫落時(shí)，它稱(chēng)為“斑禿”。在人類(lèi)斑禿中，毛發(fā)從身體的一些或所有區(qū)域脫落，通常從頭皮脫落。由于它引起頭皮上的禿斑(特別是在第一階段)，因此它有時(shí)被稱(chēng)為斑禿。在1％–2％的病例中，所述病癥可蔓延到整個(gè)頭皮(全禿)或蔓延到整個(gè)表皮(普禿)。具有相似病因的類(lèi)似于AA的病癥也發(fā)生在其他物種中。斑禿的最常見(jiàn)種類(lèi)包括頭皮上一個(gè)或多個(gè)圓點(diǎn)的毛發(fā)脫落。毛發(fā)也可以在整個(gè)頭皮內(nèi)更彌散地脫落，在這種情況下該病癥稱(chēng)為彌散性斑禿。單一部位斑禿描述僅一個(gè)點(diǎn)處的禿發(fā)，其可發(fā)生在頭上任何地方。多個(gè)部位斑禿是指多個(gè)區(qū)域的毛發(fā)脫落。該疾病可能僅限于胡須，在這種情況下其稱(chēng)為須部斑禿。如果個(gè)體頭皮上所有毛發(fā)都脫落，則該疾病稱(chēng)為全禿?！捌斩d”是身體上所有毛發(fā)均脫落，類(lèi)似于與有時(shí)影響全身的化療有關(guān)的毛發(fā)脫落?！靶奂に匦悦摪l(fā)”(也稱(chēng)為雄性脫發(fā)或雄性禿)是雌性和雄性人類(lèi)、黑猩猩和猩猩中毛發(fā)脫落的普遍形式。尤其在男性人類(lèi)中，該病癥也常稱(chēng)為男性型禿發(fā)。從兩邊太陽(yáng)穴以上開(kāi)始，毛發(fā)以界限分明的形式脫落。隨著時(shí)間過(guò)去，發(fā)際后退而形成特征性“M”型。頭冠處的毛發(fā)也變薄。通常僅留下圍繞頭的側(cè)面和后面的發(fā)緣，或該病癥可發(fā)展至全禿。女性的毛發(fā)脫落的形式與男性型禿發(fā)不同。女性中，頭皮內(nèi)全部毛發(fā)變得越來(lái)越薄，但發(fā)際不后退。女性中的雄激素性脫發(fā)極少導(dǎo)致全禿。術(shù)語(yǔ)“預(yù)防脫發(fā)”包括在其發(fā)生之前阻止或抑制與脫發(fā)有關(guān)的毛發(fā)脫落。術(shù)語(yǔ)“治療脫發(fā)”包括降低與脫發(fā)有關(guān)的毛發(fā)脫落的嚴(yán)重性或降低與脫發(fā)有關(guān)的毛發(fā)脫落的程度。在一些實(shí)施方式中，治療脫發(fā)包括改善脫發(fā)。術(shù)語(yǔ)“施用”包括將有效量的一種或多種劑量的維生素D化合物提供給個(gè)體來(lái)預(yù)防或治療脫發(fā)。施用維生素D化合物的給定方案的最佳施用率可由本領(lǐng)域技術(shù)人員用根據(jù)所用的具體化合物、所配制的具體組合物、施用方式、施用的具體位點(diǎn)等而進(jìn)行的常用劑量測(cè)定測(cè)試來(lái)確定。術(shù)語(yǔ)“局部施用”包括將有效量的一個(gè)或多個(gè)劑量的維生素D化合物遞送至個(gè)體皮膚來(lái)治療或預(yù)防脫發(fā)。皮膚包含許多特化細(xì)胞和結(jié)構(gòu)，且具有各種重要的功能，例如作為與環(huán)境接觸的保護(hù)性屏障、有助于維持正常體溫、從環(huán)境集合感覺(jué)信息和在免疫系統(tǒng)中其活性作用。皮膚具有三層：表皮、真皮和皮下組織。表皮是皮膚的外層。不同種類(lèi)皮膚中表皮的厚度是變化的。其在眼瞼處最薄，為約0.05mm，在手掌和腳底處最厚，為約1.5mm。從下到上，表皮包含五層：基底層、棘層、顆粒層、透明層(一些皮膚中有)和角質(zhì)層?；讓邮潜砥そ琴|(zhì)形成細(xì)胞的底層，其通常負(fù)責(zé)更新表皮細(xì)胞。該層僅包含分裂非常頻繁的一行未分化柱形干細(xì)胞。一半細(xì)胞分化并遷移到下一層，從而開(kāi)始成熟過(guò)程。另一半留在基底層并反復(fù)分裂來(lái)補(bǔ)充基底層。遷移到棘層(也稱(chēng)為棘細(xì)胞層)的細(xì)胞從柱形變成多邊形。在該層，細(xì)胞開(kāi)始合成角蛋白。顆粒層或粒層中的細(xì)胞失去其細(xì)胞核，其特征為暗簇形細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)。由于角蛋白和防水脂質(zhì)被產(chǎn)生并有機(jī)化，該層有著許多活性。透明層僅存在于厚皮膚中，其有助于減少角質(zhì)層和顆粒層之間的摩擦力和剪切力。角質(zhì)層中的細(xì)胞稱(chēng)為角質(zhì)層細(xì)胞。這些細(xì)胞變平且主要由為該層提供強(qiáng)度且允許吸收水分的角蛋白組成。角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但該層負(fù)責(zé)保持皮膚的完整性和水合作用，這是非常重要的功能。根據(jù)皮膚的位置，真皮的厚度也是變化的。其在眼瞼處為約0.3mm且在背部為約3.0mm。真皮由始終存在但不以層形式存在的三種組織組成：膠原蛋白、彈性組織和網(wǎng)狀纖維。真皮的兩層是乳頭層和網(wǎng)狀層。上面的乳頭層包含膠原纖維的薄層排列。下面的網(wǎng)狀層較厚，其由與皮膚表面平行排列的厚膠原纖維組成。真皮包含許多特化細(xì)胞和結(jié)構(gòu)。例如，血管和神經(jīng)流過(guò)該層。毛囊也位于該層，其中立毛肌與各毛囊連接。一部分毛囊也包含能夠再生受損表皮的干細(xì)胞。干細(xì)胞可存在于真皮-表皮連接點(diǎn)(DEJ)。脂肪質(zhì)(油)腺和頂泌(氣味)腺與毛囊連接。該層也包含分泌(汗)腺，但它們不與毛囊連接。皮下組織是容納大量血管和神經(jīng)的脂肪組織和結(jié)締組織。該層對(duì)于調(diào)節(jié)皮膚本身和身體的溫度非常重要。該層的尺寸在整個(gè)身體以及人和人之間是變化的。因此，如此處所使用，“表皮”包括其所有五層(如果存在)，包括表皮和真皮之間的連接層(例如，真皮-表皮連接點(diǎn)或DEJ)，以及再生表皮層的干細(xì)胞(例如，濾泡干細(xì)胞和表皮干細(xì)胞)。在一些實(shí)施方式中，維生素D化合物被局部遞送至和/或積聚在表皮，而基本上避免遞送至和/或積聚在真皮。如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“基本上避免真皮遞送和/或積聚”包括不大于約20％、約15％、約10％、約5％或約0％的維生素D化合物遞送至和/或積聚在真皮。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，沒(méi)有可檢測(cè)的維生素D化合物遞送至和/或積聚在真皮。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的維生素D化合物在約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約2周、約3周、約4周、約6周、約8周、約3月、約4月、約5月、約6月、約7月、約8月、約9月、約10月、約11月或約1年的時(shí)期內(nèi)施用于個(gè)體。在一些實(shí)施方式中，在治療期間每天、在選擇性天數(shù)或每三天一次施用本發(fā)明的維生素D化合物。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的維生素D化合物在各治療天內(nèi)一天一次、一天兩次或一天三次施用。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明維生素D化合物的每次給藥施用在個(gè)體的相同位置，或施用在若干不同位置。當(dāng)施用在不同位置時(shí)，各位置的劑量可以相同，或基于如皮膚厚度和藥物滲透差異等因素(如果有)來(lái)調(diào)節(jié)。在某些實(shí)施方式中，在開(kāi)始化療前，將本發(fā)明維生素D化合物一天兩次局部施用至頭皮，連續(xù)施用兩周，來(lái)預(yù)防或降低化療開(kāi)始時(shí)可能發(fā)生的任何CIA的嚴(yán)重程度。術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”包括能夠患有脫發(fā)的那些動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述個(gè)體是哺乳動(dòng)物，例如，貓、狗、靈長(zhǎng)類(lèi)、小鼠、大鼠、兔、牛、馬、山羊、綿羊、豬等。在一些實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物是靈長(zhǎng)類(lèi)，例如，黑猩猩、人、大猩猩、倭黑猩猩、猩猩、猴等。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物是人。在一些實(shí)施方式中，所述個(gè)體正在經(jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷化療治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述個(gè)體還沒(méi)有發(fā)展脫發(fā)癥狀，或在施用之前脫發(fā)還沒(méi)有開(kāi)始。在一些其他實(shí)施方式中，所述個(gè)體患有癌癥。在另一方面，本發(fā)明提供一種通過(guò)將藥物組合物局部施用于個(gè)體來(lái)預(yù)防或治療個(gè)體脫發(fā)的方法，所述藥物組合物包含用于預(yù)防或治療所述個(gè)體脫發(fā)的治療有效量的維生素D化合物，其基本上不干擾或降低共施用的化療劑的功效。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明方法和藥物組合物基本上不降低化療、特別是全身化療的功效。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明方法和藥物組合物增強(qiáng)化療功效。術(shù)語(yǔ)“不干擾共施用的化療劑的功效”包括當(dāng)維生素D化合物與一種或多種化療劑共施用時(shí)，其不妨礙一種或多種化療劑的生物學(xué)或治療學(xué)活性或阻止一種或多種化療劑實(shí)施所需生物學(xué)或治療學(xué)活性的情況。術(shù)語(yǔ)“不降低共施用的化療劑的功效”包括當(dāng)維生素D化合物與一種或多種化療劑共施用時(shí)，其不降低一種或多種化療劑的生物學(xué)或治療學(xué)活性的情況。本發(fā)明方法和藥物組合物可以和對(duì)毛囊或真皮乳頭具有細(xì)胞毒效應(yīng)或能夠減少脫發(fā)的任何化療劑一起使用或聯(lián)合使用。術(shù)語(yǔ)“化療劑”、“化療”和“化學(xué)療法”包括蒽環(huán)類(lèi)(阿霉素/多柔比星、柔紅霉素、表柔比星、伊達(dá)比星、戊柔比星)、5-FU、他莫昔芬、伊立替康、紫杉醇(Taxol)、卡鉑、依托泊苷、癌得星/環(huán)磷酰胺、順鉑、厄洛替尼(特羅凱)、貝伐單抗、吉西他濱、星形孢菌素、長(zhǎng)春新堿、伊馬替尼(格列衛(wèi))、吉非替尼(易瑞沙)、索拉非尼、達(dá)沙替尼、放線(xiàn)菌素D、六甲蜜胺(HMM，六甲基蜜胺)、異環(huán)磷酰胺、博來(lái)霉素、甲氨蝶呤、多西他賽(泰索帝)、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春瑞濱、拓?fù)涮婵?、安吖啶、阿糖胞苷、白消安、美法侖、長(zhǎng)春堿、洛莫司汀(CCNU)、塞替派、吉西他濱、卡氮芥(BCNU)、米托蒽醌、絲裂霉素C、甲基芐肼、6-巰嘌呤、鏈脲佐菌素、氟達(dá)拉濱、雷替曲塞(拓優(yōu)得)、卡培他濱及其等效物。在一些實(shí)施方式中，所述化療是全身化療。本發(fā)明方法和藥物組合物優(yōu)選基本上不降低化療、特別是全身化療的功效。優(yōu)選地，本發(fā)明方法和藥物組合物增強(qiáng)化療功效。本發(fā)明方法和藥物組合物也可以和可引起毛發(fā)變稀的任何激素療法或生物療法一起使用。在一些實(shí)施方式中，維生素D化合物與化療劑共施用。術(shù)語(yǔ)“與化療劑共施用”包括基本上與化療劑的同時(shí)施用維生素D化合物。例如，維生素D化合物可和化療劑共施用；可首先施用維生素D化合物，然后立即施用化療劑，或首先施用化療劑，然后立即施用維生素D化合物。在一些其他實(shí)施方式中，在脫發(fā)發(fā)生前(例如，在毛發(fā)脫落之前)將維生素D化合物施用于個(gè)體。在某些實(shí)施方式中，在開(kāi)始化療后但在脫發(fā)開(kāi)始前將維生素D化合物施用于個(gè)體。在其他實(shí)施方式中，個(gè)體尚未發(fā)展脫發(fā)癥狀(例如，脫發(fā)還未開(kāi)始)。可在化療之前或和化療同時(shí)將維生素D化合物施用于個(gè)體。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”包括必要的或足以預(yù)防或治療個(gè)體脫發(fā)的維生素D化合物的量。所述有效量可根據(jù)受試者的尺寸和體重、疾病種類(lèi)等因素而改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠研究上述因素并在不需要過(guò)度試驗(yàn)的情況下進(jìn)行維生素D化合物的有效量的測(cè)定。本發(fā)明維生素D化合物可以以相當(dāng)于約0.001μg-5μg鈣三醇/cm2的劑量體積局部施用于需要治療的個(gè)體。在某些實(shí)施方式中，該范圍為約0.01μg-0.5μg鈣三醇/cm2，或約0.1μg-0.5μg鈣三醇/cm2。術(shù)語(yǔ)“相當(dāng)于鈣三醇的劑量體積”包括與0.001μg-5μg鈣三醇/cm2具有基本上類(lèi)似的生物學(xué)和/或治療學(xué)活性的維生素D化合物的量。術(shù)語(yǔ)“有效濃度”包括必要的或足以預(yù)防或治療個(gè)體脫發(fā)的局部制劑中維生素D化合物的濃度。在某些實(shí)施方式中，局部制劑中維生素D化合物的濃度是約0.1、0.2、0.5、1.0、2、3、5、10、20、30、50、75、100、150、200或400μg/mL。在某些實(shí)施方式中，維生素D化合物的總劑量相當(dāng)于約0.025-400μg鈣三醇/75kg體重。在某些實(shí)施方式中，該范圍為約0.1-100μg鈣三醇/75kg體重；約0.4-25μg鈣三醇/75體重或約1、2、3、5或10μg鈣三醇/75kg體重。在某些實(shí)施方式中，總劑量的較低范圍為約0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1或2μg鈣三醇/75kg體重。在某些實(shí)施方式中，總劑量的高范圍為約400、200、100、50、25、10、5、2或1μg鈣三醇/75kg體重。又一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)防或治療個(gè)體脫發(fā)的方法，通過(guò)將含有治療有效量維生素D化合物的藥物組合物局部施用于個(gè)體，其中局部施用于個(gè)體的所述維生素D化合物的有效濃度為：(1)約50μg/mL，在給藥至少約連續(xù)25天后不引起毒性；或(2)約100μg/mL，在給藥至少約連續(xù)7天后不引起毒性。由施用維生素D化合物所引起的可能的毒副作用例如可以包括高鈣血癥，其具有包括厭食、骨痛、疲勞、嘔吐、腹瀉、便秘、聚脲、瘙癢、腎衰竭、口中金屬味、蛋白尿、尿管型、azoteri或轉(zhuǎn)移性鈣化的癥狀。在一些實(shí)施方式中，所述維生素D化合物配制成遞送至/積聚在人表皮中，特別是頭皮或頸區(qū)表皮，而基本上避免遞送至/積聚在真皮。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠用實(shí)施例1容易地確定遞送至/積聚在真皮和/或表皮的維生素D化合物或其鹽的量。術(shù)語(yǔ)“維生素D化合物”包括式I化合物及其藥學(xué)可接受的鹽：其中a和b各自獨(dú)立為單鍵或雙鍵；當(dāng)a是雙鍵時(shí)，X是-CH2；或當(dāng)a是單鍵時(shí)，X是氫或羥基取代的烷基；R1是氫、羥基、烷氧基、三烷基甲硅烷基或烷基，任選被一到三個(gè)鹵素、羥基、氰基或-NR’R”基團(tuán)取代；R2是氫、羥基、-O-三烷基甲硅烷基或烷基、烷氧基或鏈烯基，任選被一到三個(gè)鹵素、羥基、氰基或-NR’R”基團(tuán)取代；當(dāng)b是雙鍵時(shí)，R3不存在，或當(dāng)b是單鍵時(shí)，R3是氫、羥基或烷基，或R3和R1連同它們所連接的碳原子可連接形成5-7元碳環(huán)；當(dāng)b是雙鍵時(shí)，R4不存在，或當(dāng)b是單鍵時(shí)，R4是氫、鹵素或羥基；當(dāng)a是雙鍵時(shí)，R5不存在，或當(dāng)a是單鍵時(shí)，R5是氫、鹵素或羥基；R6是烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷基-O-烷基、烷基-CO2-烷基，任選被一到五個(gè)羥基、氧代、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR’R”基團(tuán)取代；R7是烷基，任選被一到三個(gè)羥基、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR’R”基團(tuán)取代；R’和R”各自獨(dú)立為氫、羥基、鹵素、烷基或烷氧基。在一些實(shí)施方式中，R1是羥基，R2是氫或羥基，a是雙鍵，R5不存在，X是-CH2，b是雙鍵，R3和R4不存在，R6是烷基(例如甲基)，且R7是烷基(例如，取代或未取代的烷基，例如，羥基取代的烷基或環(huán)烷基取代的烷基，例如-(CH2)3CH(CH3)2或-(CH2)3COH(CH3)2)或鏈烯基(例如-CH＝CHCH(CH3)CH(CH3)2)。在某些實(shí)施方式中，所述維生素D化合物由式(II)及其藥學(xué)可接受的鹽表示：其中c是單鍵或雙鍵；R1a是氫、三烷基甲硅烷基或烷基，任選被一到三個(gè)鹵素、羥基、氰基或-NR’R”基團(tuán)取代；R2a是氫、羥基、-O-三烷基甲硅烷基、或烷基、烷氧基或鏈烯基，任選被一到三個(gè)鹵素、羥基、氰基或-NR’R”基團(tuán)取代；當(dāng)c是雙鍵時(shí)，R3a、R4a不存在，或當(dāng)c是單鍵時(shí)，R3a、R4a各自獨(dú)立為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，任選被一到三個(gè)羥基或鹵素基團(tuán)取代；R3b、R4b、R5a、R6a、R7a和R8a各自獨(dú)立為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，任選被一到三個(gè)羥基或鹵素基團(tuán)取代；或R6a、R7a和R8a中的任何兩個(gè)可連接形成3-7元碳環(huán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述化合物由式(II)表示，其中R1a、R3a和R4a各自是氫。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述化合物由式(II)表示，其中c表示單鍵。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述化合物由式(II)表示，其中R6a和R8a都是甲基。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述化合物由式(II)表示，其中R1a是氫。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述化合物由式(II)表示，其中R2a是羥基。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述化合物由式(II)表示，其中R7a是羥基。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述化合物由式(II)表示，其中R5a是羥基。在一個(gè)實(shí)施方式中，R1a是氫，R2a是氫或羥基，c是單鍵，R3a、R3b、R4a、R4b和R5a各自是氫，R6a和R7a各自是烷基(例如甲基)，且R8a是氫或羥基。在另一個(gè)實(shí)施方式中，R1a是氫，R2a是氫或羥基，c是雙鍵，R3a和R4a不存在，R3b和R4b是氫，R5a是烷基(例如甲基)，R6a和R7a各自是烷基(例如甲基)，且R8a是氫或羥基。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述維生素D化合物選自以下結(jié)構(gòu)，或其立體異構(gòu)體或藥學(xué)可接受的鹽：在某些實(shí)施方式中，所述維生素D化合物是1,25-二羥基維生素D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維生素D3、1α,24-二羥基維生素D3或MC903。在其他實(shí)施方式中，所述維生素D化合物不是1,25-二羥基維生素D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維生素D3、1α,24-二羥基維生素D3或MC903。維生素D化合物的其他適當(dāng)?shù)念?lèi)似物、代謝物、衍生物和/或模擬物例如包括，1,25-二羥基維生素D3(也稱(chēng)為鈣三醇)、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇，以及例如以下專(zhuān)利中所描述的維生素D化合物的其他維生素D類(lèi)似物、同系物、模擬物和衍生物，每個(gè)專(zhuān)利以引用方式全部合并于此：美國(guó)專(zhuān)利4,391,802(1α-羥基維生素D衍生物)；4,717,721(1α-羥基衍生物，帶有長(zhǎng)度大于膽固醇或麥角固醇側(cè)鏈的17側(cè)鏈)；4,851,401(環(huán)戊并-維生素D類(lèi)似物)；4,866,048和5,145,846(具有炔基、鏈烯基和烷基(alkanyl)側(cè)鏈的維生素D3類(lèi)似物)；5,120,722(三羥基鈣化醇)；5,547,947(氟代-膽鈣化醇化合物)；5,446,035(甲基取代的維生素D)；5,411,949(23-氧雜-衍生物)；5,237,110(19-降-維生素D化合物)；4,857,518(羥基化的24-同維生素D衍生物)。其他適當(dāng)?shù)膶?shí)例包括ROCALTROL(羅氏實(shí)驗(yàn)室)；CALCIJEX可注射鈣三醇；來(lái)自Leo醫(yī)藥的研究藥物，包括EB1089(24a,26a,27a,三同-22,24-二烯-1α,25-(OH)2-D3、KH1060(20-表-22-氧雜-24a,26a,27a-三同-1a,25-(OH)2-D3)、MC1288(1,25-(OH)2-20-表-D3)和MC903(卡泊三醇，1a,24s(OH)2-22-烯-26,27-脫氫-D3)；包括1,25-(OH)2-16-烯-D3、1,25-(OH)2-16-烯-23-炔-D3和25-(OH)2-16-烯-23-炔-D3的羅氏醫(yī)藥藥物；ChugaiPharmaceuticals的22-氧雜鈣三醇(22-氧雜-1α,25-(OH)2-D3；來(lái)自伊利諾州大學(xué)的1α-(OH)-D5；以及來(lái)自InstituteofMedicalChemistry-ScheringAG的藥物，包括ZK161422(20-甲基-1,25-(OH)2-D3)和ZK157202(20-甲基-23-烯-1,25-(OH)2-D3)，1α-(OH)-D2，1α-(OH)-D3、1α-(OH)-D4、25-(OH)-D2，25-(OH)-D3和25-(OH)-D4。其他實(shí)例包括1α,25-(OH)2-26,27-d6-D3、1α,25-(OH)2-22-烯-D3、1α,25-(OH)2-D3、1α,25-(OH)2-D2、1α,25-(OH)2-D4、1α,24,25-(OH)3-D3、1α,24,25-(OH)3-D2、1α,24,25-(OH)3-D4、1α-(OH)-25-FD3、1α-(OH)-25-FD4、1α-(OH)-25-FD2、1α,24-(OH)2-D4、1α,24-(OH)2-D3、1α,24-(OH)2-D2、1α,24-(OH)2-25-FD4、1α,24-(OH)2-25-FD3、1α,24-(OH)2-25-FD2、1α,25-(OH)2-26,27-F6-22-烯-D3、1α,25(OH)2-26,27-F6-D3、1α,25S-(OH)2-26-F3-D3、1α,25-(OH)2-24-F2-D3、1α,25S,26-(OH)2-22-烯-D3、1α,25R,26-(OH)2-22-烯-D3、1α,25-(OH)2-D2、1α,25-(OH)2-24-表-D3、1α,25-(OH)2-23-炔-D3、1α,25-(OH)2-24R-F-D3、1α,25S,26-(OH)2-D3、1α,24R-(OH)2-25F-D3、1α,25-(OH)2-26,27-F6-23-炔-D3、1α,25R-(OH)2-26-F3-D3、1α,25,28-(OH)3-D2、1α,25-(OH)2-16-烯-23-炔-D3、1α,24R,25-(OH)3-D3、1α,25-(OH)2-26,27-F6-23-烯-D3、1α,25R-(OH)2-22-烯-26-F3-D3、1α,25S-(OH)2-22-烯-26-F3-D3、1α,25R-(OH)2-D3-26,26,26-d3、1α,25S-(OH)2-D3-26,26,26-d3和1α,25R-(OH)2-22-烯-D3-26,26,26-d3。其他實(shí)例可在美國(guó)專(zhuān)利6,521,608中找到，其全部?jī)?nèi)容以引用方式合并于此。例如也可參見(jiàn)以下專(zhuān)利號(hào)：6,503,893、6,482,812、6,441,207、6,410,523、6,399,797、6,392,071、6,376,480、6,372,926、6,372,731、6,359,152、6,329,357、6,326,503、6,310,226、6,288,249、6,281,249、6,277,837、6,218,430、6,207,656、6,197,982、6,127,559、6,103,709、6,080,878、6,075,015、6,072,062、6,043,385、6,017,908、6,017,907、6,013,814、5,994,332、5,976,784、5,972,917、5,945,410、5,939,406、5,936,105、5,932,565、5,929,056、5,919,986、5,905,074、5,883,271、5,880,113、5,877,168、5,872,140、5,847,173、5,843,927、5,840,938、5,830,885、5,824,811、5,811,562、5,786,347、5,767,111、5,756,733、5,716,945、5,710,142、5,700,791、5,665,716、5,663,157、5,637,742、5,612,325、5,589,471、5,585,368、5,583,125、5,565,589、5,565,442、5,554,599、5,545,633、5,532,228、5,508,392、5,508,274、5,478,955、5,457,217、5,447,924、5,446,034、5,414,098、5,403,940、5,384,313、5,374,629、5,373,004、5,371,249、5,430,196、5,260,290、5,393,749、5,395,830、5,250,523、5,247,104、5,397,775、5,194,431、5,281,731、5,254,538、5,232,836、5,185,150、5,321,018、5,086,191、5,036,061、5,030,772、5,246,925、4,973,584、5,354,744、4,927,815、4,804,502、4,857,518、4,851,401、4,851,400、4,847,012、4,755,329、4,940,700、4,619,920、4,594,192、4,588,716、4,564,474、4,552,698、4,588,528、4,719,204、4,719,205、4,689,180、4,505,906、4,769,181、4,502,991、4,481,198、4,448,726、4,448,721、4,428,946、4,411,833、4,367,177、4,336,193、4,360,472、4,360,471、4,307,231、4,307,025、4,358,406、4,305,880、4,279,826和4,248,791，各專(zhuān)利的全部?jī)?nèi)容以引用方式合并于此?？墒褂玫钠渌衔锇ňS生素D模擬物，例如美國(guó)專(zhuān)利6,218,430和WO公布2005/037755公開(kāi)的二芳基衍生物，每個(gè)專(zhuān)利的全部?jī)?nèi)容以引用方式合并于此。適于本發(fā)明的非開(kāi)環(huán)甾體類(lèi)維生素D模擬化合物的其他實(shí)例可在美國(guó)專(zhuān)利6,831,106、6,706,725、6,689,922、6,548,715、6,288,249、6,184,422、6,017,907、6,858,595和6,358,939中發(fā)現(xiàn)，每個(gè)專(zhuān)利的全部?jī)?nèi)容以引用方式合并于此?？梢岳玫钠渌m當(dāng)?shù)木S生素D3類(lèi)似物、代謝物和/或衍生物包括美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布2006/0177374中鑒定的那些，其全部?jī)?nèi)容以引用方式合并于此。術(shù)語(yǔ)“維生素D類(lèi)似物”包括結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似于維生素D的化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述維生素D類(lèi)似物是維生素D3類(lèi)似物(例如，結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似于維生素D3的化合物)。術(shù)語(yǔ)“維生素D代謝物”包括維生素D的代謝所涉及的中間體和產(chǎn)物的化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述維生素D代謝物是維生素D3代謝物(例如，為維生素D3的代謝所涉及的中間體和產(chǎn)物的化合物)。術(shù)語(yǔ)“維生素D衍生物”包括可以由母體化合物(例如，維生素D)通過(guò)用另一個(gè)原子或原子團(tuán)替代一個(gè)原子而產(chǎn)生的化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述維生素D衍生物是維生素D3衍生物(例如，可以由維生素D3通過(guò)用另一個(gè)原子或原子團(tuán)替代一個(gè)原子而產(chǎn)生的化合物)。術(shù)語(yǔ)“維生素D模擬物”包括可以在生物學(xué)過(guò)程中化學(xué)模擬維生素D的化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述維生素D模擬物是維生素D3模擬物(例如，可以以在生物學(xué)過(guò)程中化學(xué)模擬維生素D3的化合物)。在攝取魚(yú)肝油或照射酵母后吸收維生素D3。植物和動(dòng)物來(lái)源僅包含非活性維生素D前體，即7-脫氫膽固醇或麥角固醇。7-脫氫膽固醇儲(chǔ)存在皮膚中并可以由陽(yáng)光轉(zhuǎn)化為維生素D3。然而，不管通過(guò)攝取或由紫外線(xiàn)照射皮膚而形成，維生素D必須轉(zhuǎn)化為活性代謝物。維生素D3通過(guò)肝酶轉(zhuǎn)化為25-羥基膽鈣化醇。然后在腎臟形成兩種化合物1,25-二羥基膽鈣化醇和24,25-二羥基膽鈣化醇。維生素D活性代謝物在從腸道、骨沉積和骨重吸收中吸收鈣方面起重要作用。本發(fā)明維生素D化合物共有某些共同的生物活性，例如部分地通過(guò)其上調(diào)或下調(diào)例如正常角質(zhì)形成細(xì)胞(例如HEKa)中某些靶基因表達(dá)的能力而預(yù)防角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的能力。因此，在某些實(shí)施方式中，例如，本發(fā)明維生素D化合物在正常角質(zhì)形成細(xì)胞(例如HEKa)中可具有與等量鈣三醇類(lèi)似或相同的基因調(diào)節(jié)特征。如此處所使用，如果基本上相同摩爾量的維生素D化合物具有基本上相同或同等的生物學(xué)或治療學(xué)活性，“等量”包括相同的摩爾量。然而，當(dāng)不同維生素D化合物的生物學(xué)或治療學(xué)活性不基本上相同或同等時(shí)，術(shù)語(yǔ)“等量”包括與參照維生素D化合物(例如鈣三醇)相比產(chǎn)生基本上相同量的生物學(xué)或治療學(xué)活性的維生素D化合物的量。術(shù)語(yǔ)“基因調(diào)節(jié)特征”包括當(dāng)與適當(dāng)?shù)膶?duì)照相比統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著(例如p＜0.05)調(diào)節(jié)(例如，上調(diào)或下調(diào))的基因目錄或基因譜。例如，一旦使細(xì)胞與維生素D化合物接觸一段預(yù)定時(shí)間(例如24小時(shí))，與模擬品/載體處理的對(duì)照相比，靶細(xì)胞可顯示其mRNA或蛋白表達(dá)水平被調(diào)節(jié)(例如上調(diào)或下調(diào))的基因譜。在檢測(cè)時(shí)調(diào)節(jié)(例如上調(diào)或下調(diào))的基因目錄構(gòu)成該特定時(shí)刻細(xì)胞的基因表達(dá)譜的瞬態(tài)圖。術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似的基因調(diào)節(jié)特征”包括大于50％、60％、70％、80％、90％或更多的所檢測(cè)的靶基因總數(shù)具有基本上相同的基因表達(dá)方向的情況(例如，都是上調(diào)或都是下調(diào)，盡管各基因的上調(diào)和下調(diào)的大小或程度可以不同)。術(shù)語(yǔ)“相同的基因調(diào)節(jié)特征”包括幾乎所有的所檢測(cè)的靶基因具有相同的基因表達(dá)方向的情況(例如，都是上調(diào)或都是下調(diào)，盡管各基因的上調(diào)和下調(diào)的大小或程度可以不同)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明維生素D化合物促進(jìn)其表達(dá)水平被等量的參照維生素D化合物(例如鈣三醇)促進(jìn)的一個(gè)或多個(gè)靶基因的表達(dá)。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明維生素D化合物抑制其表達(dá)水平被等量的參照維生素D化合物(例如鈣三醇)抑制的一個(gè)或多個(gè)靶基因的表達(dá)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明維生素D化合物可以調(diào)節(jié)正常角質(zhì)形成細(xì)胞中蛋白的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)”包括上調(diào)和下調(diào)正常角質(zhì)形成細(xì)胞中的蛋白。在一些實(shí)施方式中，維生素D化合物調(diào)節(jié)HSPA2、HSF4mRNA、HSPB1或DNAJC6mRNA的表達(dá)。例如，在一些實(shí)施方式中，維生素D化合物上調(diào)正常角質(zhì)形成細(xì)胞(例如HEKa)中HSPA2或HSF4mRNA的表達(dá)，和/或下調(diào)HSPB1或DNAJC6mRNA的表達(dá)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明維生素D化合物調(diào)節(jié)正常角質(zhì)形成細(xì)胞中SLC1A1、KCNB2、KCNN4蛋白或SLC1A3蛋白的表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，維生素D化合物可以上調(diào)正常角質(zhì)形成細(xì)胞(例如HEKa)中SLC1A1、KCNB2或KCNN4的表達(dá)，和/或下調(diào)SLC1A3蛋白的表達(dá)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明維生素D化合物可以調(diào)節(jié)表3-1和表3-2中的一種或多種蛋白。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，維生素D化合物可以使例如正常角質(zhì)形成細(xì)胞(例如HEKa)中的表3-1中的一種或多種蛋白的表達(dá)上調(diào)至少約2倍，和/或使表3-2中一種或多種蛋白的表達(dá)下調(diào)至少約2倍。在某些實(shí)施方式中，在正常角質(zhì)形成細(xì)胞(例如HEKa)與維生素D化合物接觸約24小時(shí)后，本發(fā)明維生素D化合物可以誘導(dǎo)表3-3、3-4、3-5或3-6的任何中的一種或多種蛋白的過(guò)度表達(dá)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明維生素D化合物可以誘導(dǎo)正常角質(zhì)形成細(xì)胞(例如HEKa)中GST、角蛋白1、角蛋白17、半乳凝集素1、S100A9(鈣衛(wèi)蛋白)或S100A13的一種或多種的過(guò)度表達(dá)。如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“烷基”包括完全飽和的支鏈或無(wú)支鏈(例如，直鏈或線(xiàn)性)的烴部分，包含1到20個(gè)碳原子，例如，1到7個(gè)碳原子，或1到4個(gè)碳原子。烷基部分的典型實(shí)例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基。此外，術(shù)語(yǔ)“烷基”包括“未取代烷基”和“取代烷基”。烷基部分的取代基的典型實(shí)例是羥基、鹵素、氰基、硝基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、鏈烯氧基、炔氧基、鹵素或氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基)。如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“烷氧基”包括烷基-O-，其中烷基如上述所定義。烷氧基部分的典型實(shí)例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基、環(huán)丙氧基、環(huán)己氧基等。在一些實(shí)施方式中，烷氧基具有約1-7個(gè)碳，例如1-4個(gè)碳。術(shù)語(yǔ)烷氧基包括取代的烷氧基。取代的烷氧基的實(shí)例包括鹵化烷氧基。鹵素取代的烷氧基的實(shí)例是氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯甲氧基、二氯甲氧基和三氯甲氧基。術(shù)語(yǔ)“烷氧基烷基”包括如上述定義的烷基，其中所述烷基被烷氧基取代。此外，術(shù)語(yǔ)“烷氧基烷基”包括“未取代的烷氧基烷基”和“取代的烷氧基烷基”。烷氧基烷基部分的取代基的典型實(shí)例包括但不限于羥基、鹵素、氰基、硝基、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、鏈烯氧基、炔氧基、鹵素或氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基)。術(shù)語(yǔ)“鏈烯基”包括具有至少一個(gè)碳碳雙鍵的支鏈或無(wú)支鏈的烴。鏈烯基部分的典型實(shí)例包括但不限于乙烯基、丙烯-1-基、烯丙基、丁烯基、異丙烯基或異丁烯基。此外，術(shù)語(yǔ)“鏈烯基”包括“未取代的鏈烯基”和“取代的鏈烯基”。鏈烯基部分的取代基的典型實(shí)例包括但不限于羥基、鹵素、氰基、硝基、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、鏈烯氧基、炔氧基、鹵素或氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基)。術(shù)語(yǔ)“炔基”包括具有至少一個(gè)碳碳三鍵的支鏈或無(wú)支鏈的烴。炔基部分的典型實(shí)例包括但不限于乙炔基、丙炔-1-基(丙炔基)、丁炔基、異丙炔基或異丁炔基。此外，術(shù)語(yǔ)“炔基”包括“未取代的炔基”和“取代的炔基”。炔基部分的取代基的典型實(shí)例包括但不限于羥基、鹵素、氰基、硝基、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、鏈烯氧基、炔氧基、鹵素或氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基)。如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”包括具有3-12個(gè)碳原子、例如3-8個(gè)或3-7個(gè)碳原子的飽和或不飽和單環(huán)、二環(huán)或三環(huán)烴基。典型單環(huán)烴基例如包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)戊烯基、環(huán)己基和環(huán)己烯基。典型的二環(huán)烴基例如包括冰片基、吲哚基、六氫吲哚基、四氫萘基、十氫萘基、二環(huán)[2.1.1]己基、二環(huán)[2.2.1]庚基、二環(huán)[2.2.1]庚烯基、6,6-二甲基二環(huán)[3.1.1]庚基和2,6,6-三甲基二環(huán)[3.1.1]庚基、二環(huán)[2.2.2]辛基。三環(huán)烴基的實(shí)例例如包括金剛烷基。術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”包括“未取代的環(huán)烷基”和“取代的環(huán)烷基”。環(huán)烷基部分的取代基的典型實(shí)例包括但不限于羥基、鹵素、氰基、硝基、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、鏈烯氧基、炔氧基、鹵素或氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基)。術(shù)語(yǔ)“芳基”包括環(huán)部分具有6-20個(gè)碳原子的單環(huán)或二環(huán)芳族烴基。芳基部分的典型實(shí)例包括但不限于苯基、萘基、蒽基、菲基或四氫萘基。此外，術(shù)語(yǔ)芳基包括“未取代的芳基”和“取代的芳基”。芳基部分的取代基的典型實(shí)例包括但不限于羥基、鹵素、氰基、硝基、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、鏈烯氧基、炔氧基、鹵素或氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基)。術(shù)語(yǔ)“雜芳基”包括單環(huán)或二環(huán)雜芳基部分，其含有5-10個(gè)選自碳原子的環(huán)成員和選自O(shè)、N或S的1到5個(gè)雜原子。雜芳基的實(shí)例包括但不限于噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、異噻唑基、氧雜-2,3-二唑基、氧雜-2,4-二唑基、氧雜-2,5-二唑基、氧雜-3,4-二唑基、噻-2,3-二唑基、噻-2,4-二唑基、噻-2,5-二唑基、噻-3,4-二唑基、3-、4-或5-異噻唑基、2-、4-或5-噁唑基、3-、4-或5-異噁唑基、3-或5-1,2,4-三唑基、4-或5-1,2,3-三唑基、四唑基、2-、3-或4-吡啶基、3-或4-噠嗪基、3-、4-或5-吡嗪基、2-吡嗪基、2-、4-或5-嘧啶基。雜芳基可以是單-、二-、三-或多環(huán)的。術(shù)語(yǔ)“雜芳基”還包括其中雜芳環(huán)與一個(gè)或多個(gè)芳基、脂環(huán)族或雜環(huán)基環(huán)稠合的基團(tuán)，其中所述基團(tuán)或連接點(diǎn)位于雜芳環(huán)上或稠合的芳環(huán)上。雜芳基部分的典型實(shí)例包括但不限于吲哚基、異吲哚基、吲唑基、吲哚嗪基、嘌呤基、喹嗪基、喹啉基、異喹啉基、噌啉基、2,3二氮雜萘基、萘啶基、喹唑啉基、喹喔啉基、菲啶基、菲羅啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、苯并異喹啉基、噻喃并[2,3-b]呋喃基、呋喃并[3,2-b]吡喃基、5H-吡啶并[2,3-d]-o-噁嗪基、1H-吡唑并[4,3-d]-噁唑基、4H-咪唑并[4,5-d]噻唑基、吡嗪并[2,3-d]噠嗪基、咪唑并[2,1-b]噻唑基、咪唑并[1,2-b][1,2,4]三嗪基、7-苯并[b]噻吩基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、benzoxapinyl、苯并噁嗪基、1H-吡咯并[1,2-b][2]苯并氮雜基(1H-pyrrolo[1,2-b][2]benzazapinyl)、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并三唑基、吡咯并[2,3-b]吡啶基、吡咯并[3,2-c]吡啶基、吡咯并[3,2-c]吡啶基、吡咯并[3,2-b]吡啶基、咪唑并[4,5-b]吡啶基、咪唑并[4,5-c]吡啶基、吡唑并[4,3-d]吡啶基、吡唑并[4,3-c]吡啶基、吡唑并[3,4-c]吡啶基、吡唑并[3,4-d]吡啶基、吡唑并[3,4-b]吡啶基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、吡唑并[1,5-a]吡啶基、吡咯并[1,2-b]噠嗪基、咪唑并[1,2-c]嘧啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[4,3-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡啶并[2,3-d]嘧啶基、吡啶并[2,3-b]吡嗪基、吡啶并[3,4-b]吡嗪基、嘧啶并[5,4-d]嘧啶基、吡嗪基[2,3-b]吡嗪基或嘧啶并[4,5-d]嘧啶基。此外，術(shù)語(yǔ)“雜芳基”包括“未取代的雜芳基”和“取代的雜芳基”?！胺蓟被颉半s芳基”的芳環(huán)可以是未取代的或一個(gè)或多個(gè)環(huán)位置上被取代基取代的，所述取代基包括例如鹵素、羥基、氰基、硝基、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、烷氧基、環(huán)烷氧基、鏈烯氧基、炔氧基、芳氧基、雜芳氧基、雜環(huán)氧基、芳烷氧基、雜芳烷氧基、雜環(huán)基烷氧基、酮類(lèi)(包括烷基羰基、環(huán)烷基羰基、鏈烯基羰基、炔基羰基、芳?；?、芳烷基羰基、雜芳基羰基、雜環(huán)基羰基)、酯類(lèi)(包括烷氧基羰基、環(huán)烷氧基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、雜環(huán)基氧基羰基、烷基羰基氧基、環(huán)烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、雜芳基羰基氧基、雜環(huán)基羰基氧基)、碳酸酯類(lèi)(包括烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、雜芳基氧基羰基氧基)、氨基甲酸酯類(lèi)(包括烷氧基羰基氨基、芳氧基羰基氨基、鏈烯氧基羰基氨基、炔氧基羰基氨基、芳氧基羰基氨基、氨基羰基氧基、烷基氨基羰基氧基、二烷基氨基羰基氧基、芳氨基羰基氧基)、氨甲酰基(包括烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳氨基羰基、芳基烷基氨基羰基、鏈烯氨基羰基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、烷基羰基烷基氨基、芳基羰基氨基、雜芳基羰基氨基)、芳烷基、雜芳烷基、雜環(huán)烷基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳氨基)、磺?；?包括烷基磺?；?、芳基磺?；?、芳烷基磺酰基、雜芳磺?；?、烷氧基磺?；⒎佳趸酋；㈦s芳氧基磺?；h(huán)烷基磺?；㈦s環(huán)基磺?；?、氨磺酰基、亞磺酰氨基、磷酸酯基、膦酸酯基、次膦酸酯基(phosphinato)、硫醚(包括烷基硫、芳基硫、雜芳基硫)、脲基、亞氨基、脒基、硫羧基(包括烷基硫代羰基、芳基硫代羰基)、亞磺?；?包括烷基亞磺?；?、芳基亞磺?；?、羧基，其中前面提到的每一個(gè)烴基可任選被一個(gè)或多個(gè)烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、鹵素、羥基或烷氧基取代。如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)基”或“雜環(huán)”包括未取代或取代、飽和或不飽和的非芳環(huán)或環(huán)體系，例如，其是4-、5-、6-或7-元單環(huán)的、7-、8-、9-、10-、11-或12-元二環(huán)的或10-、11-、12-、13-、14-或15-元三環(huán)體系，且包含至少一個(gè)選自O(shè)、S和N的雜原子，其中所述N和S可任選被氧化為各種氧化態(tài)。在一個(gè)實(shí)施方式中，雜環(huán)基部分代表飽和單環(huán)，其含有5-7個(gè)環(huán)原子，且還任選包含選自O(shè)、S或N的雜原子。雜環(huán)基可連接在雜原子或碳原子。雜環(huán)基可以包括稠合或橋接環(huán)以及螺環(huán)。雜環(huán)基部分的實(shí)例例如包括二氫呋喃基、二氧戊環(huán)基、二氧雜環(huán)己基、二噻烷基、哌嗪基、吡咯烷、二氫吡喃基、氧硫雜環(huán)戊基、二硫戊環(huán)、氧硫雜環(huán)己基、硫代嗎啉代、環(huán)氧乙基、氮丙啶基、氧雜環(huán)丁基、氧雜環(huán)庚烷基(oxepanyl)、氮雜環(huán)丁基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、吡咯烷基、四氫吡喃基、哌啶基、嗎啉代、哌嗪基、氮雜環(huán)庚三烯基(azepinyl)、氧雜環(huán)庚三烯基(oxapinyl)、氧氮雜環(huán)庚烷基、氧硫雜環(huán)己烷基、硫雜環(huán)庚烷基(thiepanyl)、氮雜環(huán)庚烷基、二氧雜環(huán)庚烷基和二氮雜環(huán)庚烷基。術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)基”包括如此處定義的雜環(huán)基團(tuán)，其可被1、2或3個(gè)取代基取代，例如＝O、＝S、鹵素、羥基、氰基、硝基、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、烷氧基、環(huán)烷氧基、鏈烯氧基、炔氧基、芳氧基、雜芳氧基、雜環(huán)氧基、芳烷氧基、雜芳烷氧基、雜環(huán)基烷氧基、酮類(lèi)(包括烷基羰基、環(huán)烷基羰基、鏈烯基羰基、炔基羰基、芳?；⒎纪榛驶?、雜芳基羰基、雜環(huán)基羰基)、酯類(lèi)(包括烷氧基羰基、環(huán)烷氧基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、雜環(huán)基氧基羰基、烷基羰基氧基、環(huán)烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、雜芳基羰基氧基、雜環(huán)基羰基氧基)、碳酸酯類(lèi)(包括烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、雜芳基氧基羰基氧基)、氨基甲酸酯類(lèi)(包括烷氧基羰基氨基、芳氧基羰基氨基、鏈烯氧基羰基氨基、炔氧基羰基氨基、芳氧基羰基氨基、氨基羰基氧基、烷基氨基羰基氧基、二烷基氨基羰基氧基、芳氨基羰基氧基)、氨甲?；?包括烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳氨基羰基、芳基烷基氨基羰基、鏈烯氨基羰基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、烷基羰基烷基氨基、芳基羰基氨基、雜芳基羰基氨基)、芳烷基、雜芳烷基、雜環(huán)烷基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、和烷基芳氨基)、磺酰基(包括烷基磺?；⒎蓟酋；?、芳烷基磺?；?、雜芳磺?；?、烷氧基磺酰基、芳氧基磺?；?、雜芳氧基磺?；h(huán)烷基磺?；?、雜環(huán)基磺?；?、氨磺?；?、亞磺酰氨基、磷酸酯基、膦酸酯基、次膦酸酯基、硫醚(包括烷基硫、芳基硫、雜芳基硫)、脲基、亞氨基、脒基、硫羧基(包括烷基硫代羰基、芳基硫代羰基)、亞磺?；?包括烷基亞磺?；?、芳基亞磺?；?、羧基，其中前面提到的每一個(gè)烴基可任選被一個(gè)或多個(gè)烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、鹵素、羥基或烷氧基取代。術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)烷基”為被雜環(huán)基取代的烷基。該術(shù)語(yǔ)包括未取代的和取代的雜環(huán)烷基部分，其可以被一個(gè)或多個(gè)烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、鹵素、羥基或烷氧基取代。術(shù)語(yǔ)“羰基”或“羧基”包括通過(guò)雙鍵與氧原子連接的碳(C＝O)的化合物或部分。羰基還可以被允許本發(fā)明化合物實(shí)施其預(yù)期功能的任何部分取代。例如，羰基部分可被烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基等取代。含羰基的部分的實(shí)例包括醛類(lèi)、酮類(lèi)、羧酸類(lèi)、酰胺類(lèi)、酯類(lèi)、脲類(lèi)、酐類(lèi)等。術(shù)語(yǔ)“羥基”或“氫氧基”包括具有-OH或-O-的基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“鹵素”包括氟、溴、氯、碘等。術(shù)語(yǔ)“全鹵化”包括其中所有氫被鹵素原子取代的部分。本發(fā)明維生素D化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、溶劑合物或前藥可以含有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱(chēng)中心，因此可產(chǎn)生對(duì)映體、非對(duì)映體和其他立體異構(gòu)形式，其可根據(jù)絕對(duì)立體化學(xué)定義為(R)-或(S)-或者對(duì)于氨基酸而言定義為(D)-或(L)。本發(fā)明意味著包括所有這些可能的異構(gòu)體，以及其外消旋和光學(xué)純形式。光學(xué)活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-或(D)-和(L)-異構(gòu)體可通過(guò)使用手性合成單體或手性試劑來(lái)制備，或通過(guò)使用常規(guī)方法(例如用手性柱的HPLC)來(lái)拆分。當(dāng)本發(fā)明描述的化合物包含烯屬雙鍵或其他幾何不對(duì)稱(chēng)性中心時(shí)，除非另有說(shuō)明，所述化合物旨在包括E和Z兩種幾何異構(gòu)體。同樣地，也旨在包括所有的互變異構(gòu)形式。術(shù)語(yǔ)“立體異構(gòu)體”包括由通過(guò)相同的鍵結(jié)合、但具有不同的三維結(jié)構(gòu)的相同原子組成的化合物，其是不可互換的。本發(fā)明預(yù)期各種立體異構(gòu)體及其混合物，且包括對(duì)映體，對(duì)映體是指其分子互相是非重疊鏡象的兩種立體異構(gòu)體。本發(fā)明包括所有的藥學(xué)可接受的同位素標(biāo)記的維生素D化合物，其中一個(gè)或多個(gè)原子被具有相同原子序數(shù)、但原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不同于通常天然發(fā)現(xiàn)的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)的原子替代。適于包含在本發(fā)明化合物中的同位素的實(shí)例包含氫的同位素，例如2H和3H，碳的同位素，例如11C、13C和14C，氯的同位素，例如36Cl，氟的同位素，例如18F，碘的同位素，例如123I和125I，氮的同位素，13N和15N，氧的同位素，例如15O、17O和18O，磷的同位素，例如32P，和硫的同位素，例如35S。用重同位素例如氘(即2H)取代可賦予由較高的代謝穩(wěn)定性所產(chǎn)生的某些治療學(xué)優(yōu)點(diǎn)，例如，體內(nèi)半衰期增加或劑量要求降低。同位素標(biāo)記的維生素D化合物通?？捎杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)技術(shù)用同位素標(biāo)記的試劑替代之前使用的非標(biāo)記試劑來(lái)制備。術(shù)語(yǔ)“前藥”包括可在生理?xiàng)l件下或通過(guò)溶劑分解轉(zhuǎn)化為本發(fā)明的生物活性化合物的化合物。因此，術(shù)語(yǔ)“前藥”是指藥學(xué)可接受的本發(fā)明化合物的代謝前體。當(dāng)施用于需要其的受試者時(shí)，前藥可能是非活性的，但其在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為本發(fā)明活性化合物。通常前藥在體內(nèi)例如通過(guò)在血液中水解或在內(nèi)臟或肝臟中轉(zhuǎn)化從而快速轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生本發(fā)明母體化合物。前藥化合物通常在哺乳動(dòng)物有機(jī)體中提供溶解性、組織相容性或延遲釋放的優(yōu)點(diǎn)(參見(jiàn)Bundgard,H.,DesignofProdrugs(1985),pp.7-9,21-24(Elsevier,Amsterdam))。前藥的討論在Higuchi,T.等的“Pro-drugsasNovelDeliverySystems,”A.C.S.SymposiumSeries,Vol.14和在BioreversibleCarriersinDrugDesign,ed.EdwardB.Roche,AnglicanPharmaceuticalAssociationaridPergamonPress,1987中提供?！八帉W(xué)可接受的鹽”包括酸和堿加成鹽?！八帉W(xué)可接受的酸加成鹽”是指保持游離堿的生物有效性和性質(zhì)的那些鹽，其不是生物上或其他方面不合需要的，且其與無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸一起形成，所述無(wú)機(jī)酸例如但不限于，鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有機(jī)酸例如但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗壞血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟腦酸、樟腦-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、檸檬酸、環(huán)拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羥基乙磺酸、甲酸、富馬酸、半乳糖二酸、龍膽酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、羥基乙酸、馬尿酸、異丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、馬來(lái)酸、蘋(píng)果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羥基-2-萘酸、煙酸、油酸、乳清酸、草酸、棕櫚酸、撲酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水楊酸、4-氨基水楊酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、對(duì)甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸等?！八帉W(xué)可接受的堿加成鹽”是指保持游離酸的生物有效性和性質(zhì)的那些鹽，其不是生物上或其他方面不合需要的。這些鹽由無(wú)機(jī)堿或有機(jī)堿與游離酸的加成來(lái)制備。來(lái)源于無(wú)機(jī)堿的鹽包括但不限于鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鋁鹽等。優(yōu)選的無(wú)機(jī)鹽是銨、鈉、鉀、鈣和鎂鹽。來(lái)源于有機(jī)堿的鹽包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、環(huán)胺和堿性離子交換樹(shù)脂的鹽，例如氨、異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、二甲乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二環(huán)己基胺、賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、海巴明、膽堿、甜菜堿、苯乙芐胺(benethamine)、芐星(benzathine)、乙二胺、葡糖胺、甲基葡萄糖胺、可可堿、三乙醇胺、氨基丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺樹(shù)脂等。通常結(jié)晶作用產(chǎn)生本發(fā)明化合物的溶劑合物。如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“溶劑合物”是指含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明化合物分子和一個(gè)或多個(gè)溶劑分子的集合體。所述溶劑可以是水，在這種情況下所述溶劑合物可以是水合物?；蛘?，所述溶劑可以是有機(jī)溶劑。因此，本發(fā)明化合物可以以水合物存在，包括一水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等，以及相應(yīng)的溶劑化形式。本發(fā)明化合物可以是真實(shí)的溶劑合物，盡管在其它情況下，本發(fā)明化合物可僅保留不定水(adventitiouswater)或者是水加上一些不定溶劑的混合物。術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”包括本發(fā)明化合物(例如維生素D化合物)和用于將維生素D化合物遞送給個(gè)體的本領(lǐng)域普遍接受的介質(zhì)的制劑。這種介質(zhì)包括所有藥學(xué)可接受的載體、其稀釋劑或賦形劑。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物可以局部施用于任何上皮表面?！吧掀け砻妗卑ǜ采w在身體外表面的組織區(qū)域，或其限定的中空結(jié)構(gòu)，包括但不限于皮膚和粘膜表面。這種上皮表面包括口、咽、食道、肺、眼、耳、鼻、頰、舌、陰道、頸、泌尿生殖器、消化和肛門(mén)直腸表面。組合物可配制成用于局部施用的各種常用形式。例如，這些形式包括半固體和液體劑型(例如液體溶液或懸浮液)、凝膠、霜?jiǎng)?、乳劑、洗液、漿料、粉劑、噴霧劑、泡沫、糊劑、膏劑、油膏、香膏或滴劑。用于局部施用的常用載體包括膠質(zhì)、凝膠及其衍生物、聚乳酸或聚乙醇酸聚合物或其共聚物、纖維素衍生物(例如甲基纖維素、羧甲基纖維素或氧化纖維素)、胍爾豆膠、金合歡膠、刺梧桐樹(shù)膠、黃蓍膠、膨潤(rùn)土、瓊脂、卡波姆、墨角藻、長(zhǎng)角豆、右旋糖酐及其衍生物、印度樹(shù)膠(ghattigum)、鋰蒙脫石、卵葉車(chē)前果殼(ispaghulahusk)、聚乙烯吡咯烷酮、二氧化硅及其衍生物、黃原膠、高嶺土、滑石、淀粉及其衍生物、石蠟、水、植物油和動(dòng)物油、聚乙烯、聚環(huán)氧乙烷、聚乙二醇、聚丙二醇、甘油、乙醇、丙醇、丙二醇(糖醇，醇類(lèi))、不揮發(fā)性油、鈉、鉀、鋁、鎂或鈣鹽(例如氯化物、碳酸鹽、重碳酸鹽、檸檬酸鹽、葡萄糖酸鹽、乳酸鹽、醋酸鹽、葡庚糖酸鹽或酒石酸鹽)。用于局部制劑的標(biāo)準(zhǔn)組合物策略可用于維生素D化合物，從而提高藥物的持續(xù)和停留時(shí)間，并改善所實(shí)現(xiàn)的預(yù)防功效。也可以使用局部透皮貼劑。透皮貼劑具有將本發(fā)明組合物控制遞送至身體的額外優(yōu)點(diǎn)。這種劑型可通過(guò)將試劑溶解或分散在合適介質(zhì)中來(lái)制備。除維生素D化合物之外，粉末和噴霧劑還可以包含載體，例如乳糖、滑石、氫氧化鋁、硅酸鈣和聚酰胺粉末，或這些物質(zhì)的混合物。噴霧劑還可以包含常用推進(jìn)劑，例如氯氟烴和易揮發(fā)未取代烴，例如丁烷和丙烷。通常，水性氣霧劑通過(guò)配制維生素D化合物和常用藥學(xué)可接受的載體和穩(wěn)定劑的水溶液或懸浮液來(lái)制備。所述載體和穩(wěn)定劑根據(jù)具體化合物的要求變化，但通常包括非離子型表面流行性劑(例如，吐溫、普盧蘭尼克(Pluronic)、聚乙二醇等)、蛋白樣血清白蛋白、山梨聚糖酯、油酸、卵磷脂、氨基酸(例如甘氨酸)、緩沖液、鹽、糖或糖醇。氣霧劑通常由等滲溶液制備。本發(fā)明氣霧劑或任何其他的遞送手段的產(chǎn)生可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法完成。例如，就氣霧劑遞送而言，所述化合物以精細(xì)粉碎的形式和含有推進(jìn)劑的任何適當(dāng)?shù)妮d體提供。液化推進(jìn)劑通常在環(huán)境條件下是氣體并在壓力下壓縮。所述推進(jìn)劑可以是本領(lǐng)域任何可接受和已知的推進(jìn)劑，包括丙烷和丁烷，或其他低級(jí)烷烴，例如最多5個(gè)碳的烷烴。將所述組合物容納在含有適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑和閥的容器中，并保持在高壓下直到通過(guò)閥的作用釋放。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述維生素D化合物可以預(yù)防性施用。對(duì)于預(yù)防性施用，維生素D化合物可以在可能的脫發(fā)之前施用。可以最佳化施用時(shí)機(jī)，從而使維生素D化合物的預(yù)防功效最大化。施用時(shí)機(jī)將根據(jù)施用方式、劑量、組合物的穩(wěn)定性和功效、劑量頻率(例如單次施用或多次劑量)而改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定所需的最合適的時(shí)間間隔，從而使維生素D化合物的預(yù)防功效最大化。當(dāng)存在于組合物中，所述維生素D化合物通常以總重量的約0.000001％到約100％、更優(yōu)選約0.001％到約50％、最優(yōu)選約0.01％到約25％的量存在。對(duì)于含有載體的本發(fā)明組合物，所述組合物例如包含約1％到約99％、優(yōu)選約50％到約99％、最優(yōu)選約75％到約99％重量的至少一種載體。此外，本發(fā)明組合物的單個(gè)組分可以預(yù)混合，或各組分可以單獨(dú)添加至根據(jù)預(yù)定劑量的相同環(huán)境中，從而實(shí)現(xiàn)處理組分的所需濃度水平，只要所述組分最終互相緊密混合。而且，本發(fā)明可以基于連續(xù)或間斷方式進(jìn)行施用或遞送。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述制劑包含維生素D活性成分，其配制在約40％(w/w)丙二醇和約60％(w/w)無(wú)水乙醇(200proof,US)以及任選的其他少量藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑，例如約0.4％(w/v)的Phospholipon90G中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述制劑包含維生素D活性成分，其配制在約30％(w/w)丙二醇、約10％(w/w)乙氧基二甘醇或二乙二醇單乙基醚和約60％(w/w)無(wú)水乙醇(200proof,US)以及任選的其他少量藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑，例如約0.4％(w/v)的Phospholipon90G中。在一些實(shí)施方式中，乙醇是無(wú)水200proof(U.S.)未變性乙醇(USP)。此處描述的制劑提供活性維生素D化合物的真皮滲透和遞送水平，并提供預(yù)防脫發(fā)或降低脫發(fā)(特別是化療引起的脫發(fā)(CIA))嚴(yán)重程度的有效手段。在某些實(shí)施方式中，所述藥物組合物包含約40％(w/w)丙二醇(USP級(jí))和約60％(w/w)無(wú)水乙醇(200proof,US)，未變性USP。在一些實(shí)施方式中，所述藥物組合物包含約40％(w/w)丙二醇(即，USP級(jí)或更高)和約60％(w/w)無(wú)水乙醇(200proof,US)，未變性(即，USP級(jí)或更高)。在其他實(shí)施方式中，所述藥物組合物包含約30％(w/w)丙二醇、約10％(w/w)乙氧基二甘醇或二乙二醇單乙基醚和約60％(w/w)無(wú)水乙醇(200proof,US)。在再其他實(shí)施方式中，所述藥物組合物包含約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1％的Phospholipon，例如Phospholipon90G。在其他實(shí)施方式中，丙二醇和/或無(wú)水乙醇的精確百分比(w/w)可基于40％:60％的比率改變。例如。丙二醇與無(wú)水乙醇的％比可以是20:80；25:75；30:70；35:65；36:64；37:63；38:62；39:61；41:59；42:58；43:57；44:56；45:55等。這種其他制劑的功效可使用本領(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù)來(lái)驗(yàn)證，例如實(shí)施例I描述的方法。在某些實(shí)施方式中，制劑中的無(wú)水乙醇可由95％乙醇、96％乙醇、97％乙醇、98％乙醇或99％乙醇替代。在某些實(shí)施方式中，所述藥物組合物也可以包括痕量的其他非活性成分、賦形劑或組分。這種成分的存在基本上不影響維生素D化合物的功效或其真皮滲透/積聚性能。本發(fā)明維生素D化合物配制成用于遞送至表皮而基本上不滲透至真皮層。之前由RocheDermatology開(kāi)發(fā)的不同制劑在以每次施用約500-1000μg的劑量使用時(shí)對(duì)于對(duì)抗CIA無(wú)效，并引起I期研究中大多數(shù)人受試者的皮炎。同樣的Roche制劑在大鼠綠色白血病模型(下文)中也沒(méi)有效果。本發(fā)明的一種典型制劑可根據(jù)以下(非限制性)過(guò)程制備：配方I：1.2μg/g(1.2ppm)的鈣三醇組分％w/w100ppm鈣三醇濃縮物1.2200Proof乙醇58.8丙二醇40總計(jì)100配方I按照如下步驟制備：將鈣三醇溶解在乙醇中；然后添加丙二醇并混合直到所得溶液的外觀透明且均勻。以上制劑的比重為約0.875g/mL。以w/v表示的以上配方的目標(biāo)濃度是1.05μg/mL。配方II：3.6μg/g(3.6ppm)的鈣三醇組分％w/w100ppm鈣三醇濃縮物3.6200Proof乙醇56.4丙二醇40總計(jì)100配方II按照如下步驟制備：將鈣三醇溶解在乙醇中；然后添加丙二醇并混合直到所得溶液的外觀透明且均勻。以上制劑的比重為約0.875g/mL。以w/v表示的以上配方的目標(biāo)濃度是3.15μg/mL。所使用試劑都是USP級(jí)試劑(滿(mǎn)足美國(guó)藥典的要求)。使用本發(fā)明制劑，約0.2μg(以100μL的2μg/mL局部溶液施用)能夠保護(hù)新生大鼠對(duì)抗CIA?；谠撔畔?，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地調(diào)節(jié)基于待治療哺乳動(dòng)物的平均體重的適當(dāng)劑量水平。例如，人受試者中，可使用約2.5μg、5μg、10μg、25μg、50μg、75μg或100μg的鈣三醇(或其他等量的維生素D化合物)的總劑量。初步動(dòng)物毒理學(xué)研究顯示，約100μg的劑量不引起真皮刺激，并顯示優(yōu)異的表皮滲透而基本上沒(méi)有真皮滲透(例如，極少量滲透至真皮)。參見(jiàn)其他劑量信息的描述。實(shí)施例以下實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的某些方面，但不限于任何方面。盡管為了澄清和說(shuō)明，所述實(shí)施例已經(jīng)相當(dāng)詳細(xì)地描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解在不離開(kāi)本發(fā)明的真實(shí)范圍的情況下，可進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)上的多種變化。實(shí)施例1：使用Franz人皮膚有限劑量模型體外經(jīng)皮吸收鈣三醇的評(píng)估設(shè)計(jì)該實(shí)施例來(lái)評(píng)估各種鈣三醇制劑的經(jīng)皮吸收藥代動(dòng)力學(xué)。使用有限劑量技術(shù)和Franz擴(kuò)散池進(jìn)行體外人尸體皮膚測(cè)定吸收。證實(shí)體外人尸體皮膚模型是研究經(jīng)皮吸收和測(cè)定局部施用藥物的藥代動(dòng)力學(xué)的有價(jià)值的工具。該模型使用固定在使皮膚保持在與體內(nèi)通常條件匹配的溫度和濕度下的特別設(shè)計(jì)的擴(kuò)散池中的人尸體皮膚。將有限劑量(例如4-7mg/cm2)的制劑施用于皮膚的外表面，通過(guò)監(jiān)測(cè)接觸皮膚內(nèi)表面的接受室溶液中制劑的出現(xiàn)率來(lái)測(cè)定藥物吸收。然后準(zhǔn)確測(cè)定該模型中定義總吸收量、吸收率和皮膚含量的數(shù)據(jù)。該方法具有準(zhǔn)確預(yù)計(jì)體內(nèi)經(jīng)皮吸收動(dòng)力學(xué)的歷史性先例。因此，人皮膚的體外有限劑量模型可以表征維生素D化合物(例如鈣三醇)的經(jīng)皮吸收藥代動(dòng)力學(xué)。在該實(shí)驗(yàn)中，在三塊相同的皮膚切面上測(cè)試六種含有鈣三醇的制劑，每一制劑施用于三塊不同的尸體皮膚供體中的一塊，用于在48小時(shí)劑量周期內(nèi)測(cè)定鈣三醇的經(jīng)皮吸收。在施用劑量后的預(yù)先選定時(shí)間，移去全部真皮接受室溶液，用新鮮接受室溶液替換，并保存等分試樣用于隨后的分析。另外，回收角質(zhì)層、表皮和真皮并評(píng)估藥物含量。通過(guò)高效液相色譜(HPLC)分析樣品的鈣三醇含量。以下提供此處所使用方法的簡(jiǎn)要描述。死亡24–48小時(shí)內(nèi)獲得的沒(méi)有明顯皮膚病跡象的人尸體軀干皮膚用于該研究。取皮、冷凍保存并密封在不透水的塑料袋中，儲(chǔ)存在＜-70℃直到實(shí)驗(yàn)當(dāng)天。使用前，在約37℃水中融化皮膚，然后用自來(lái)水沖洗以去除來(lái)自表面的任何附著的血和其他物質(zhì)。來(lái)自單個(gè)供體的皮膚切成多塊較小的切面，但其足夠大從而固定在靜態(tài)2.0cm2的Franz擴(kuò)散池中。在每一供體的三塊相同的樣品上測(cè)試各制劑。真皮室裝滿(mǎn)pH為7.4±0.1的磷酸鹽緩沖等滲鹽水(PBS)的儲(chǔ)庫(kù)溶液，使表皮室面向周?chē)鷮?shí)驗(yàn)室環(huán)境。可以將Volpo(Oleth-20)——已知增加水溶性極差化合物的水溶性的非離子型表面活性劑添加到PBS中。儲(chǔ)庫(kù)溶液中的Volpo確保經(jīng)皮吸收期間的擴(kuò)散漏槽條件(diffusionsinkconditions)，且已知不影響測(cè)試皮膚的屏障性能。然后將細(xì)胞放入擴(kuò)散器中，其中以約600RPM的速度磁性攪拌真皮儲(chǔ)庫(kù)溶液，且其溫度保持在使皮膚表面溫度達(dá)到32.0±1.0℃。為確保各皮膚切面的完整性，在施用測(cè)試產(chǎn)品之前測(cè)定其對(duì)氚化水的滲透性。在短暫(0.5-1小時(shí))的平衡期后，通過(guò)滴管將3H2O(NEN,Boston,MA,sp.Act.～0.5μCi/mL)滴在皮膚上部，以覆蓋完全暴露的表面(大約250-500μL)。5分鐘后，去除3H2O水層。30分鐘時(shí)，收集儲(chǔ)庫(kù)溶液并通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)分析放射性含量。認(rèn)為3H2O吸收小于1.56μL-equ/cm2的皮膚樣品是可接受的。所使用的所有皮膚樣品的3H2O吸收小于約0.50μL-equ/cm2(結(jié)果未顯示)。劑量施用和樣品收集：就在給藥前，取前劑量樣品，并用含0.2％Volpo(也稱(chēng)為Oleth-20，用于確保水溶液中藥物的可混和性的非離子型表面活性劑)的0.1×PBS的新鮮溶液替換儲(chǔ)庫(kù)溶液。從Franz池中移去柱狀物(chimney)，使其完全接觸皮膚的表皮表面。然后用正壓分注移液管(positivedisplacementpipette)將所有制劑施用于皮膚切面上，以遞送10μL制劑/cm2。用移液管的特氟綸尖端將劑量在表面上涂開(kāi)。施用后五到十分鐘，替換Franz池的柱狀物部分。在給藥后的預(yù)先選定時(shí)間(6、12、24和48小時(shí))，將儲(chǔ)庫(kù)溶液全部除去，用新鮮儲(chǔ)庫(kù)溶液替換，并保留預(yù)定體積的等分試樣用于隨后的分析。將來(lái)自各供體的單塊皮膚切面固定在池上，其不給藥，但用于評(píng)估從皮膚中擴(kuò)散出來(lái)的物質(zhì)的出現(xiàn)，這可表示內(nèi)源鈣三醇。收集最后的樣品之后，用80:20的乙醇:水洗滌皮膚表面兩次(每次體積1.0mL)，來(lái)收集來(lái)自皮膚表面的未吸收制劑。洗滌后，從腔室中去除皮膚并分成表皮和真皮。在80:20的乙醇:水中提取各層過(guò)夜。通過(guò)高效液相色譜(HPLC)來(lái)定量鈣三醇。簡(jiǎn)言之，在具有Agilent1100SeriesLC/MSD的Hewlett-Packard1100SeriesHPLC系統(tǒng)中進(jìn)行HPLC。由A)水中的0.1％乙酸銨和B)甲醇中的0.1％乙酸銨組成的溶劑系統(tǒng)以0.550mL/min的流速流過(guò)PhenomenexLunaC18(2)柱(100A,3μ100×4.6mm)。用由純標(biāo)準(zhǔn)品每日制得的外標(biāo)曲線(xiàn)將峰面積量化至濃度。收集當(dāng)天不測(cè)試的樣品儲(chǔ)存在-20℃或以下。在預(yù)試研究中，來(lái)自各組的單個(gè)制劑以單個(gè)供體約5μL/cm2劑量給藥于六個(gè)腔室中。在0、2、4、8、12、24、32和48小時(shí)收集接受室溶液。收集最后一批接受室溶液樣品后，如之前所述洗滌表面并收集皮膚用于分析。處理并分析所有樣品的鈣三醇含量。關(guān)鍵研究的最終設(shè)計(jì)基于預(yù)試研究中觀察到的結(jié)果。尤其是，施用劑量、接受室溶液取樣時(shí)間表和取樣處理方法。進(jìn)行這些修正以?xún)?yōu)化關(guān)鍵研究樣品中鈣三醇的檢測(cè)和定量。例如，盡管預(yù)試方法描述儲(chǔ)庫(kù)樣品在2、4、8、12、24、32和48小時(shí)采集，預(yù)試研究后確定，儲(chǔ)庫(kù)樣品將在6、12、24和48小時(shí)采集，以利于更好地檢測(cè)儲(chǔ)庫(kù)樣品中鈣三醇的水平。另外，預(yù)試研究后，確定2cm2施用20μL(劑量為10μL/cm2)將改善儲(chǔ)庫(kù)溶液樣品中鈣三醇的檢測(cè)。然而，未給藥的腔室保持為1cm2。計(jì)算以下參數(shù)：a)總吸收量(所有儲(chǔ)庫(kù)溶液的總和)；b)研究期間內(nèi)滲透的速率和程度；和c)所施用劑量的質(zhì)量平衡。對(duì)于數(shù)據(jù)評(píng)估，a)如果任何樣品＜LLQ(量化下限)，則該樣品可作為非數(shù)據(jù)值處理。對(duì)于放射性樣品(例如，水完整性測(cè)試)，LLQ定義為空白樣品的預(yù)定平均背底。出于研究者的判斷，聲明所有＜LLQ的值是為了計(jì)算關(guān)鍵參數(shù)而測(cè)量的零值或?qū)嶋H值；b)如果值大于來(lái)自其余相同腔室集的相同值的平均±3SD范圍，或如Dean和Dixon異常值測(cè)試所測(cè)定，則確認(rèn)其為可疑的異常值。出于研究者的判斷，將聲稱(chēng)為異常值的值從數(shù)據(jù)的全部總和中去除(但在文中或數(shù)據(jù)表中同樣地進(jìn)行標(biāo)注)；c)在腔室內(nèi)，如果已經(jīng)聲明給定的時(shí)間點(diǎn)值是非數(shù)據(jù)值，或由于其他理由丟失了，用內(nèi)插值替換該時(shí)間點(diǎn)值以計(jì)算相關(guān)參數(shù)。該內(nèi)插值在連接如下相鄰值的線(xiàn)上計(jì)算：-假定3點(diǎn)：(T1,A)、(T2,B)和(T3,C)，其中(B)丟失，-其中T＝時(shí)間且A-C＝測(cè)得的數(shù)據(jù)值-估計(jì)的B＝A-[((A-C)/|T1-T3|)x(|T1-T2|)]對(duì)于統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估，計(jì)算供體內(nèi)相同樣品的平均值并計(jì)算各關(guān)鍵參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差。然后校對(duì)供體內(nèi)平均值并計(jì)算供體間總平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。用Student的t檢驗(yàn)評(píng)估測(cè)試制品之間的差異。使用該方法評(píng)估以下測(cè)試制劑：-A:(1ppm)：將0.2mL(1％(w/v))的100ppm鈣三醇濃縮物(批號(hào)H，見(jiàn)下文)溶解到19.8mL(99％(w/v))的200proof乙醇(1μg/mL)中。-B(1ppm)：首先，將0.2mL(1％(w/v))的100ppm鈣三醇濃縮物(批號(hào)H，見(jiàn)下文)溶解到11.8mL(59％(w/v))的200proof乙醇中；然后添加8mL(40％(w/v))的丙二醇，并混合直到透明且均勻(1μg/mL)。-C(1ppm)：首先將0.2mL(1％(w/v))的100ppm鈣三醇濃縮物(批號(hào)H，見(jiàn)下文)溶解到11.8mL(59％(w/v))的200proof乙醇中；然后添加6mL(30％(w/v))的丙二醇和2mL(10％(w/v))的乙氧基二甘醇，并混合直到透明且均勻(1μg/mL)。-D(3ppm)：首先，將0.6mL(3％(w/v))的100ppm鈣三醇濃縮物(批號(hào)H，見(jiàn)下文)溶解到11.4mL(57％(w/v))的200proof乙醇中；然后添加6mL(30％(w/v))的丙二醇并混合直到透明且均勻；最后添加2mL(10％(w/v))的乙氧基二甘醇并混合直到透明且均勻(3μg/mL)。-E(1ppm)：首先將0.2mL(1％(w/v))的100ppm鈣三醇濃縮物(批號(hào)H，見(jiàn)下文)溶解到11.72mL(58.6％(w/v))的200proof乙醇(DP-04-099)中；然后添加6mL(30％(w/v))的丙二醇并混合直到透明且均勻；然后添加2mL(10％(w/v))的二乙二醇單乙基醚P并混合直到透明且均勻；最后添加0.08mL(0.4％(w/v))的Phospholipon90G濃縮物(批號(hào)G，見(jiàn)下文)并分散入溶液中，混合直到透明且均勻(1μg/mL)。-F(3ppm)：首先將0.6mL(3％(w/v))的100ppm鈣三醇濃縮物(批號(hào)H，見(jiàn)下文)溶解到11.32mL(56.6％(w/v))的200proof乙醇中；然后添加6mL(30％(w/v))的丙二醇并混合直到透明且均勻；然后添加2mL(10％(w/v))的二乙二醇單乙基醚P并混合直到透明且均勻；最后添加0.08mL(0.4％(w/v))的Phospholipon90G濃縮物(批號(hào)G，見(jiàn)下文)并分散入溶液中，混合直到透明且均勻(31μg/mL)。-G：混合50g(50％(w/v))的200proof乙醇和50g(50％(w/v))的Phospholipon90G，并混合直到透明且均勻。-H：將0.01mg(0.01％(w/v))的鈣三醇完全溶解在100mL(99.99％(w/v))的200proof乙醇中。用于該研究的所有試劑都是分析純?cè)噭┑燃?jí)或更高。特定試劑的來(lái)源將在最終報(bào)告正文內(nèi)首次提及各化學(xué)品后標(biāo)注。該研究的結(jié)果概括在以下摘要表中：摘要表：使用人尸體皮膚單次施用48小時(shí)內(nèi)鈣三醇的表皮、真皮和總吸收量經(jīng)皮吸收中鈣三醇含量的供體間平均結(jié)果。平均值±SE作為總質(zhì)量(ng)*零值是指低于檢測(cè)下限的結(jié)果。**推測(cè)從皮膚釋放出內(nèi)源鈣三醇數(shù)據(jù)顯示鈣三醇確實(shí)從所評(píng)估的測(cè)試制劑中滲入(但并非必定透過(guò))體外人尸體皮膚。來(lái)自各供體的未給藥的空白皮膚切面顯示與內(nèi)源鈣三醇一致的HPLC/MS共洗脫峰。所有測(cè)試制劑中基本上相等的且類(lèi)似于非給藥的皮膚切面的存在于儲(chǔ)庫(kù)溶液中的量很可能是從皮膚切面中釋放出來(lái)的內(nèi)源鈣三醇的擴(kuò)散。由于在測(cè)試制劑和非給藥腔室中幾乎觀察不到差異，因此儲(chǔ)庫(kù)溶液中觀察到的量不可能代表從局部施用的測(cè)試制劑中釋放出來(lái)的鈣三醇。如圖1所示，在施用兩種制劑(A和B)的皮膚切面中觀察到作為真皮含量的鈣三醇吸收。未給藥皮膚切面的真皮皮層沒(méi)有觀察到可測(cè)量的水平，因此，這兩種測(cè)試制劑的可測(cè)量的真皮水平解釋為代表從施用劑量的吸收。另外，施用測(cè)試制劑的所有表皮樣品的鈣三醇水平大于未給藥的皮膚切面(約3×到約17×)?；诒砥も}三醇含量的等級(jí)次序?qū)y(cè)試制劑排列如下：D＞F＞E＞C＞B＞A＞＞＞未給藥的皮膚與該等級(jí)次序一致的是包含較高濃度(3μg/mL對(duì)1μg/mL)的鈣三醇的測(cè)試制劑(D和F)顯示較高的表皮含量。在表面洗滌結(jié)果(來(lái)自皮膚表面的其余測(cè)試制品的回收率)中觀察到類(lèi)似的等級(jí)次序。未給藥的空白皮膚切面的表面洗滌中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)鈣三醇。實(shí)施例2：涉及響應(yīng)鈣三醇的表皮細(xì)胞培養(yǎng)物的關(guān)鍵蛋白的鑒別-實(shí)時(shí)PCR(RTPCR)本實(shí)施例和以下幾個(gè)實(shí)施例提供關(guān)于鈣三醇的活化通道中的蛋白或基因的同一性的附加信息。這些實(shí)驗(yàn)允許鑒別表皮細(xì)胞對(duì)維生素D化合物的細(xì)胞響應(yīng)涉及的作用機(jī)制以及關(guān)鍵蛋白/基因。尤其是，發(fā)現(xiàn)使角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞系HEKa與鈣三醇接觸引起細(xì)胞過(guò)程的顯著影響。此處描述的實(shí)驗(yàn)集中在鈣三醇誘導(dǎo)的鈣通道轉(zhuǎn)運(yùn)的變化和調(diào)節(jié)熱休克蛋白的變化所涉及的關(guān)鍵蛋白/基因的鑒別。實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)方法用于該實(shí)施例來(lái)鑒別離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和熱休克蛋白涉及的基因的mRNA水平的變化。使用PCR陣列作為篩選工具，評(píng)估了可能提供對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣三醇的生物作用模式的理解的分子靶譜。用實(shí)時(shí)PCR量化評(píng)估m(xù)RNA水平的變化，從而評(píng)估含有80個(gè)通道特異性靶標(biāo)(參見(jiàn)附件)的預(yù)選子集中的mRNA水平。PCR陣列分析利用兩組基因，即與熱休克蛋白有關(guān)的基因(SABiosciences)和與神經(jīng)科學(xué)離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)的基因(SABioscience)。細(xì)胞培養(yǎng)：使初級(jí)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(HEKa)保持在Epilife培養(yǎng)基(CascadeBiologics,Inc.,PortlandOR)連同人角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑(CascadeBiologics,Inc.,PortlandOR)中。細(xì)胞在37℃下在含有5％CO2的條件下生長(zhǎng)。HEKa細(xì)胞的D3處理：用0.1μg/mL的鈣三醇或?qū)φ蛰d體處理HEKa細(xì)胞。為產(chǎn)生0.1μg/mL的鈣三醇的最終濃度，將1mg鈣三醇溶解在2mL乙醇中，并將1μL的所得原液添加到5mL培養(yǎng)基中。用含有1μL乙醇的5mL培養(yǎng)基處理載體對(duì)照組的細(xì)胞。處理開(kāi)始后3、6、16、24、48或72小時(shí)收獲細(xì)胞。RNA分離：在不同處理時(shí)間用RNeasy微型試劑盒(Qiagen,Inc.,ValenciaCA)根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)溶解細(xì)胞從而分離RNA。在260nm處測(cè)定光密度來(lái)量化RNA。第一鏈合成：使用RT2第一鏈合成試劑盒(SABiosciences.,FrederickMD)根據(jù)廠商建議由1μg總RNA合成第一鏈cDNA。實(shí)時(shí)PCR：用水稀釋來(lái)自第一鏈合成的產(chǎn)物，與SYBR綠色主要混合物(greenmastermix)(SABiosciences.,FrederickMD)混合并裝載到PCR陣列上。在BioradCFX96上在PCR陣列(熱休克蛋白陣列和神經(jīng)科學(xué)和離子通道陣列)(SABiosciences,FrederickMD)上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。使用可在SABiosciences網(wǎng)址上獲得的PCR陣列數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。下表2-1顯示鈣三醇處理后在HEKa細(xì)胞中調(diào)節(jié)的熱休克蛋白基因陣列上的基因。結(jié)果僅顯示在兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中調(diào)節(jié)的那些基因。表2-1：由維生素D3處理調(diào)節(jié)的熱休克蛋白陣列的基因HEKa細(xì)胞中mRNA水平通過(guò)鈣三醇處理調(diào)節(jié)的兩個(gè)基因是HSPB1和HSPA2。HSPB1是27kDa蛋白，其不僅在細(xì)胞膜中表達(dá)，而且在細(xì)胞溶質(zhì)、線(xiàn)粒體和高爾基體中表達(dá)。HSPA2是存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞核中的70kDa蛋白，且其通過(guò)HSF1調(diào)節(jié)。HSPB1和HSPA2都涉及細(xì)胞凋亡。HSF4由視黃酸調(diào)節(jié)且涉及細(xì)胞分化。DNAJC6屬于HSP40組蛋白。它存在于網(wǎng)格蛋白包被的囊泡和細(xì)胞質(zhì)中。類(lèi)似地，由三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)獲得的神經(jīng)科學(xué)和離子通道陣列結(jié)果概括于表2-2中。表2-2：由維生素D3處理調(diào)節(jié)的神經(jīng)科學(xué)和離子通道陣列中的基因一致地觀察到谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和鉀通道中的變化。已知SLC1A1(也稱(chēng)為EAAC1或EAAT3)主要負(fù)責(zé)將刺激性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)膜。已經(jīng)在神經(jīng)系統(tǒng)外的組織(例如心臟和皮膚)中發(fā)現(xiàn)該溶質(zhì)載體蛋白。在大鼠角質(zhì)形成細(xì)胞中，有證據(jù)顯示傷口愈合中涉及谷氨酸信號(hào)和SLC1A1(Genever等.,1999)。SLC1A1被利魯唑(Riluzole，一種目前用于黑素瘤臨床試驗(yàn)的藥物)(ClinicalTrials.gov,Mosby’sDrugConsult,第13版)抑制表明SLC1A1在皮膚細(xì)胞中的生物作用。假設(shè)SLC1A1與受損運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的抗凋亡機(jī)制(Kiryu-Seo等,2006)有關(guān)，該實(shí)驗(yàn)中觀察到的HEKa細(xì)胞中的SLC1A1被D3處理上調(diào)提示潛在的保護(hù)性機(jī)制通道連接。SLC1A3(也稱(chēng)為EAAT1或EA6)是另一種溶質(zhì)載體，其允許鈉依賴(lài)性谷氨酸和天冬氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。通常在腦的膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，這種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白涉及清理谷氨酸的突觸間隙，從而阻止后突觸神經(jīng)元的延長(zhǎng)的去極化作用。已知SLC1A3能與膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)和磷酸二酯6B(PDE6B)相互作用。有可能SCL1A3涉及降低細(xì)胞毒性。KCNN4是鉀中間體/小電導(dǎo)鈣激活通道，亞家族N，成員4。其活化后，細(xì)胞膜被超極化，流入細(xì)胞中的鈣增加。這種鉀通道局限于神經(jīng)系統(tǒng)之外的許多組織中。KCNB2，鉀電壓門(mén)控通道，Shab相關(guān)亞家族，成員2，在鈣三醇處理后約24小時(shí)上調(diào)。這種鉀通道在調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、胰島素分泌和平滑肌收縮中很重要。盡管鈣三醇用于這些實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于理解本發(fā)明其他維生素D化合物(例如上文描述的那些)也可以在調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)中顯示類(lèi)似活性。在某些實(shí)施方式中，預(yù)期本發(fā)明維生素D化合物顯示與這些實(shí)驗(yàn)中的鈣三醇類(lèi)似或相同的基因調(diào)節(jié)作用，例如，上調(diào)由鈣三醇類(lèi)似地上調(diào)的一個(gè)或多個(gè)靶基因的表達(dá)(mRNA和/或蛋白)，或下調(diào)由鈣三醇類(lèi)似地下調(diào)的一個(gè)或多個(gè)靶基因的表達(dá)(mRNA和/或蛋白)。實(shí)施例3：涉及響應(yīng)鈣三醇的表皮細(xì)胞培養(yǎng)物的關(guān)鍵蛋白的鑒別-抗體陣列也通過(guò)利用能夠篩選超過(guò)700種潛在靶蛋白的變化的抗體微陣列來(lái)評(píng)估經(jīng)鈣三醇刺激的蛋白變化的評(píng)價(jià)。在該實(shí)驗(yàn)中，采用含有對(duì)抗超過(guò)700種靶蛋白的抗體的抗體微陣列(PanoramaXP725抗體陣列，Sigma)來(lái)評(píng)估用鈣三醇分別處理約3、6或24小時(shí)的HEKa細(xì)胞中蛋白濃度/水平的變化。簡(jiǎn)言之，首先收獲經(jīng)處理的HEKa細(xì)胞，然后提取以獲得可溶解的蛋白上清液。來(lái)自各樣品(1mg/mL)的兩部分所提取的蛋白樣品(總共約1mg)各自用熒光染料(分別是Cy3和Cy5)標(biāo)記。從蛋白樣品中去除過(guò)量染料，所得標(biāo)記樣品用于微陣列培養(yǎng)。為測(cè)定相對(duì)于較早時(shí)間點(diǎn)(例如，在第3小時(shí))而言較晚的時(shí)間點(diǎn)(例如，在第6或第24小時(shí))的特定靶蛋白的表達(dá)水平，用不同的標(biāo)簽來(lái)標(biāo)記樣品(例如，3小時(shí)提取物用Cy3標(biāo)記，6小時(shí)或24小時(shí)提取物用Cy5標(biāo)記)。然后混合包含等量總蛋白的兩種標(biāo)記的樣品(例如，Cy3標(biāo)記的3小時(shí)樣品分別與Cy5標(biāo)記的6小時(shí)或24小時(shí)樣品混合)。用微陣列芯片(根據(jù)廠商推薦的方案)培養(yǎng)后，芯片經(jīng)洗滌并干燥。然后用熒光激光掃描器掃描微陣列來(lái)測(cè)定Cy3和Cy5染料的相對(duì)熒光強(qiáng)度。如果特定種類(lèi)的靶蛋白的量隨著時(shí)間增加(或減少)，微陣列將保留與較晚時(shí)間點(diǎn)(例如，Cy5)有關(guān)的較多(或較少)染料。例如，在該實(shí)驗(yàn)中，最早時(shí)間點(diǎn)(例如，3小時(shí))用作基線(xiàn)來(lái)測(cè)定兩個(gè)較晚時(shí)間點(diǎn)(例如，6小時(shí)對(duì)24小時(shí))時(shí)相對(duì)的蛋白表達(dá)水平。如果6-24小時(shí)之間陣列保留較多的Cy5，則所述時(shí)間期間內(nèi)靶蛋白的表達(dá)水平增加。相反，如果第6小時(shí)至第24小時(shí)保留的Cy5降低，則靶蛋白表達(dá)水平降低。使用該方法的初次分析集中在相對(duì)的表達(dá)水平變化＞2倍(增加或降低)的那些靶蛋白上。總的說(shuō)來(lái)，使用鈣三醇處理(24小時(shí))的HEKa細(xì)胞的抗體陣列實(shí)驗(yàn)鑒別了以下靶蛋白(表3-1和3-2)，其響應(yīng)維生素鈣三醇而明顯改變表達(dá)水平：表3-1：鈣三醇處理后蛋白水平增加(＞2倍)的靶蛋白表3-2：鈣三醇處理后蛋白水平降低(＞2倍)的靶蛋白CrkII獨(dú)立生長(zhǎng)因子1絲氨酸蘇氨酸蛋白磷酸酶1b組織蛋白酶D轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子bpanWAVE蛋白酪氨酸磷酸酶PESTCD4024小時(shí)鈣三醇處理的HEKa細(xì)胞的評(píng)估和相同的蛋白抗體陣列法鑒別了明顯上調(diào)的大約五十種蛋白。這些蛋白通常屬于四類(lèi)：(i)轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞周期控制(表3-3)；(ii)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架和粘著蛋白(表3-4)；(iii)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白(表3-5)；和(iv)神經(jīng)細(xì)胞分化和阿爾茨海默病(表3-6)。表3-3：與細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)錄控制有關(guān)的過(guò)表達(dá)蛋白(鈣三醇處理24小時(shí)后)表3-4：與結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架和粘著有關(guān)的過(guò)表達(dá)蛋白(鈣三醇處理后24小時(shí))表3-5：與細(xì)胞凋亡控制有關(guān)的過(guò)表達(dá)蛋白(鈣三醇處理后24小時(shí))表3-6：與神經(jīng)細(xì)胞分化和阿爾茨海默病有關(guān)的過(guò)表達(dá)蛋白(鈣三醇處理后24小時(shí))實(shí)施例4：涉及響應(yīng)鈣三醇的表皮細(xì)胞培養(yǎng)基的關(guān)鍵蛋白的鑒別-蛋白質(zhì)組分析用鈣三醇處理一系列HEKa培養(yǎng)物，在與鈣三醇3接觸3、6和24小時(shí)后收獲細(xì)胞沉淀。然后用蛋白質(zhì)組學(xué)方法(例如2-D凝膠和Western印跡分析)分析細(xì)胞沉淀。在如下所述的該實(shí)驗(yàn)中，用0.1μg/mL的鈣三醇處理HEKa細(xì)胞，并用2-D凝膠電泳和相關(guān)的比較分析來(lái)處理3、6和24小時(shí)獲得的樣品(結(jié)果未顯示)。比較研究中總共進(jìn)行大約458個(gè)蛋白斑點(diǎn)的分析，比較對(duì)照樣品和處理3、6和24小時(shí)的處理樣品。鑒別顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異變化的六個(gè)斑點(diǎn)。切除這些斑點(diǎn)，其蛋白含量通過(guò)胰島素消化以及質(zhì)譜表征來(lái)進(jìn)行序列鑒定。結(jié)果(表4-1)顯示，來(lái)自HEKa異常增生上皮細(xì)胞(keritinocyte)樣品的六組斑點(diǎn)包含純的內(nèi)源角蛋白，這與角蛋白通常作為常見(jiàn)污染物觀察到相反。鑒定出兩種S100蛋白與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和半乳凝集素1一起正被強(qiáng)烈地調(diào)節(jié)。有證據(jù)證明半乳凝集素1是糖基化的。表4-1基于2-D凝膠電泳研究鑒定的正被鈣三醇強(qiáng)烈調(diào)節(jié)的蛋白這兩種S100蛋白(A9和A13)屬于鈣防衛(wèi)蛋白家族蛋白。該家族中有著21種不同類(lèi)型的低分子量蛋白。這些S100蛋白結(jié)合鈣(EF-手性基序)，且各類(lèi)型以細(xì)胞特異性方式和依賴(lài)于環(huán)境因素的水平表達(dá)。多種疾病與S100蛋白水平的改變有關(guān)(心肌病、神經(jīng)變性和炎性疾病以及癌癥)。注意到S100蛋白也在抗體陣列結(jié)果中鑒別，因?yàn)槠湟唤?jīng)與鈣三醇接觸就上調(diào)。實(shí)施例5：鈣三醇對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)的影響用不同濃度的鈣三醇處理一系列HEKa培養(yǎng)物，并在預(yù)定生長(zhǎng)時(shí)期后分析HEKa細(xì)胞的生長(zhǎng)行為。所有實(shí)驗(yàn)在96孔板形式中進(jìn)行。各孔包含于約100μL介質(zhì)中的相同量的HEKa細(xì)胞(通常為2,000-5,000細(xì)胞/孔)。將鈣三醇溶解在乙醇中制成原液。用生長(zhǎng)介質(zhì)以1:2連續(xù)稀釋原液，覆蓋4.0μg/mL到約15.5ng/mL的范圍(9個(gè)測(cè)試濃度)。將約100μL的各測(cè)試濃度的鈣三醇加入相應(yīng)測(cè)試孔中，使得最終體積為約200μL/孔。該測(cè)試的鈣三醇濃度為2.0-0.008μg/mL(例如，對(duì)應(yīng)于96孔板的第2欄到第10欄)。第11欄用作陰性對(duì)照(不含鈣三醇)。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次。如圖2所示，將鈣三醇以約0.008-2.0μg/mL的濃度范圍滴定到HEKa細(xì)胞中。HEKa細(xì)胞能很好地耐受最低水平的鈣三醇，且鈣三醇似乎能適度刺激HEKa細(xì)胞生長(zhǎng)(約10-20％)。然而，當(dāng)鈣三醇濃度為約1.0μg/mL或更高時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制。HEKa細(xì)胞對(duì)鈣三醇的總體劑量反應(yīng)在大約六周時(shí)期內(nèi)的一系列十九個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中是一致的(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例6：鈣三醇對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng)與正常角質(zhì)形成細(xì)胞HEKa中觀察到的不同，沒(méi)有觀察到所測(cè)試的大部分癌細(xì)胞系或永生化細(xì)胞系的明顯的生長(zhǎng)刺激或生長(zhǎng)抑制作用，所述細(xì)胞系包括SkBr-3(乳腺癌，Her2過(guò)表達(dá))、SKMEL-28(黑素瘤)、PaCa2(胰腺癌)、NCI-ES-0808和NIH-3T3(永生化成纖維細(xì)胞)。這種癌細(xì)胞系/永生細(xì)胞系所顯示的一種典型的生長(zhǎng)曲線(xiàn)顯示于圖3，為胰腺癌細(xì)胞系PaCa2的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。注意到PaCa2的生長(zhǎng)在很寬的鈣三醇濃度范圍內(nèi)不受影響。類(lèi)似地，兩種測(cè)試癌細(xì)胞系MCF-7(含p53突變體的乳腺癌)和HepG2(肝癌)，在低維生素D3濃度(0.05-0.25μg/mL)下響應(yīng)鈣三醇刺激，且在高鈣三醇濃度(＞0.5μg/mL)下響應(yīng)鈣三醇抑制。參見(jiàn)圖4。這些數(shù)據(jù)表明當(dāng)所述主題維生素D化合物施用于正常角質(zhì)形成細(xì)胞(例如HEKa)直到某一濃度極限時(shí)，也許能促進(jìn)這些正常角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)不促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)。超過(guò)該濃度極限，維生素D化合物事實(shí)上可抑制正常角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)。實(shí)施例7：鈣三醇對(duì)HEKa細(xì)胞對(duì)抗各種化療藥物的保護(hù)效應(yīng)該實(shí)施例顯示，極少例外地，本發(fā)明維生素D化合物可保護(hù)正常角質(zhì)形成細(xì)胞(例如HEKa)對(duì)抗大多數(shù)類(lèi)型的一線(xiàn)化療藥物的細(xì)胞毒作用。尤其是，測(cè)試了十七種抗癌藥來(lái)評(píng)價(jià)鈣三醇對(duì)這些藥物的細(xì)胞毒作用的效應(yīng)。藥物名稱(chēng)及其各自的作用機(jī)制列于下表中。表7-1：HEKa細(xì)胞中鈣三醇的化學(xué)保護(hù)活性的測(cè)試藥物在第一系列的實(shí)驗(yàn)中，許多基于激酶抑制劑的藥物在分析中用于設(shè)計(jì)來(lái)評(píng)估0.1μg/mL鈣三醇為HEKa細(xì)胞提供保護(hù)作用的能力。這些藥物包括：厄洛替尼(特羅凱)，一種EGFRTyr激酶抑制劑；吉非替尼(易瑞沙)，一種EGFRTyr激酶抑制劑；索拉非尼，若干Tyr激酶的抑制劑(Raf,VEGF-R2,c-kit,PDGR-R)；達(dá)沙替尼，一種BCR/ABLTyr激酶抑制劑；和星形孢菌素，一種相對(duì)非特異性的激酶抑制劑。這些實(shí)驗(yàn)中獲得的劑量曲線(xiàn)顯示的總趨勢(shì)為，在低藥物劑量水平(與影響進(jìn)行全身遞送化療的患者皮膚的劑量不同)，鈣三醇提供某種生長(zhǎng)刺激并保護(hù)HEKa細(xì)胞(參見(jiàn)圖5-9)。另外，似乎與更非特異性激酶抑制劑相比，鈣三醇具有對(duì)抗較特異性激酶抑制劑的更明顯的保護(hù)作用。類(lèi)似地，鈣三醇也具有對(duì)抗低劑量水平的烷化劑(例如順鉑和卡鉑)的中等保護(hù)水平(參見(jiàn)圖10和11)。伊立替康可能通過(guò)與拓?fù)洚悩?gòu)酶I相互作用而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。在存在鈣三醇的情況下也觀察到對(duì)抗伊立替康的正性保護(hù)作用(圖12)。紫杉醇是有絲分裂的抑制劑。0.1μg/mL鈣三醇的存在確實(shí)提供對(duì)抗紫杉醇的某些保護(hù)作用(圖13)。嘧啶抗代謝物基的藥物，例如5-氟尿嘧啶(5-FU)，以若干方式起作用，但主要作為胸苷酸合酶抑制劑。5-FU阻斷DNA復(fù)制所需的胸腺嘧啶脫氧核苷的合成。因此已經(jīng)局部使用5-氟尿嘧啶來(lái)治療光化學(xué)(日光)角質(zhì)物質(zhì)和一些類(lèi)型的皮膚基底細(xì)胞癌。當(dāng)存在0.1μg/mL的鈣三醇時(shí)，至少觀察到對(duì)抗5-FU的輕微保護(hù)作用(圖14)。吉西他濱是脫氧胞苷的2’碳上的氫原子被氟原子取代的核苷類(lèi)似物。類(lèi)似于氟尿嘧啶和其他嘧啶類(lèi)似物，在DNA復(fù)制期間吉西他濱取代了核酸的這種結(jié)構(gòu)塊(buildingblocks)之一(在這種情況下是胞嘧啶核苷)。吉西他濱用于治療多種癌：非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌和乳腺癌。圖15顯示當(dāng)存在0.1μg/mL鈣三醇時(shí)，至少觀察到對(duì)抗吉西他濱的輕微保護(hù)作用。另一方面，鈣三醇似乎不提供對(duì)抗多柔比星的細(xì)胞毒作用的明顯保護(hù)作用(圖16)。另外，對(duì)抗他莫昔芬的任何保護(hù)作用弱(圖17)。他莫昔芬競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合至腫瘤及其他組織靶的雌激素受體上，產(chǎn)生降低DNA合成和抑制雌激素作用的核復(fù)合物。與上述數(shù)據(jù)一致，圖18的數(shù)據(jù)表明HEKa角質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)受鈣三醇刺激，且在HEKa細(xì)胞中觀察到對(duì)抗5-FU的一些保護(hù)水平。有趣的是，在三種測(cè)試的癌細(xì)胞系Hep-G2、PaCa-2和SKMEL-28中，5-FU處理的ED50曲線(xiàn)明顯不同于也含有0.1μg/mL鈣三醇補(bǔ)充劑的那些。注意到Hep-G2細(xì)胞被鈣三醇處理輕微刺激，然而甚至在存在鈣三醇的情況下，其5-FUED50曲線(xiàn)沒(méi)有明顯變化。類(lèi)似地，使以下4種測(cè)試癌細(xì)胞系：Hep-G2、MCF-7、PC-3和PaCa-2與2–至0.1μg/mL的鈣三醇接觸兩代不改變這些細(xì)胞對(duì)其他藥物(例如，阿霉素、順鉑和厄洛替尼)的響應(yīng)。以上這些結(jié)果表明，鈣三醇可以在化療(例如使用5-FU)期間保護(hù)正常角質(zhì)形成細(xì)胞(例如HEKa)，不對(duì)抗抗癌細(xì)胞的化療的功效。與在HEKa細(xì)胞中觀察到的非常類(lèi)似，鈣三醇似乎幾乎不改變多柔比星對(duì)抗癌癥/永生細(xì)胞(例如SkBr-3、SKMEL-28、PaCa-2、MCF-7、NCI-ES-0808、Hep-G2和NIH-3T3)的細(xì)胞毒作用(參見(jiàn)圖19)。另外，也研究商業(yè)藥物和鈣三醇的可能的協(xié)同作用。在這些實(shí)驗(yàn)中，從比細(xì)胞培養(yǎng)的最終所需濃度高4倍的濃度開(kāi)始，連續(xù)稀釋所選的商業(yè)藥物。同時(shí)，制備0.4μg/mL的鈣三醇原液，然后與連續(xù)稀釋的藥物混合(以1:1比率)。然后藥物/鈣三醇混合物經(jīng)培養(yǎng)至少15分鐘，然后加入細(xì)胞培養(yǎng)基中(比率為100μL比100μL)。因此，鈣三醇的最終濃度為0.1μg/mL。藥物治療周期通常為三天。在三天結(jié)束時(shí)，在280nm處讀出96孔板的背底，然后向各孔加入20μL的“SubstrateCellTiter96AqueousOneSolutionReagent”(Promega)。將平板返回到37℃孵化器中，每小時(shí)讀出490nm處的其OD，直到OD到達(dá)約1.5。減去預(yù)底物OD讀數(shù)計(jì)算出凈OD增加。通過(guò)比較不同濃度的OD相對(duì)于對(duì)照孔(不含藥物)的OD來(lái)計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的影響。繪制凈OD的結(jié)果隨藥物濃度的變化并用于確定ED50值。HEKa細(xì)胞結(jié)果的分析表明鈣三醇和大多數(shù)測(cè)試藥物之間沒(méi)有相互作用，所述測(cè)試藥物包括5-FU、多柔比星、他莫昔芬、伊立替康、紫杉醇、卡鉑、星形孢菌素、長(zhǎng)春新堿、順鉑、厄洛替尼、吉西他濱、伊馬替尼、吉非替尼、索拉非尼和達(dá)沙替尼。當(dāng)在其他細(xì)胞上測(cè)試藥物組合時(shí)，也獲得相同結(jié)果。因此，不希望束縛于任何具體理論，似乎鈣三醇和以上藥物的作用機(jī)制是不同的。實(shí)施例8：用鈣三醇預(yù)處理細(xì)胞：存在和不存在化療藥物的情況下鈣三醇的細(xì)胞基測(cè)定試驗(yàn)用于評(píng)估細(xì)胞活力的上述細(xì)胞基試驗(yàn)用于該實(shí)施例來(lái)評(píng)估鈣三醇對(duì)抗所選化療藥物的作用的潛在保護(hù)作用。使各細(xì)胞系在0.1μg/mL鈣三醇存在下生長(zhǎng)兩代細(xì)胞。然后這些預(yù)處理細(xì)胞用于建立細(xì)胞基試驗(yàn)。另外，未經(jīng)處理的細(xì)胞用于在相同藥物/鈣三醇濃度下建立平行實(shí)驗(yàn)。這允許并列比較在施用化療藥物之前與鈣三醇長(zhǎng)時(shí)間接觸的潛在作用。五種細(xì)胞系的每一種在0.1μg/mL鈣三醇的存在下生長(zhǎng)兩代細(xì)胞后，僅HEKa細(xì)胞明顯影響其總體生長(zhǎng)和形態(tài)。四種癌細(xì)胞系繼續(xù)生長(zhǎng)，且不改變其總體形態(tài)外觀。然而，與鈣三醇長(zhǎng)時(shí)間接觸后，HEKa細(xì)胞停止生長(zhǎng)，且其形態(tài)變成以一個(gè)方向伸長(zhǎng)，與鈣三醇處理前較多的支化外觀相反。對(duì)于該細(xì)胞系，一批新的細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)并在鈣三醇存在下僅與單代接觸，然后在化療藥物存在下進(jìn)行測(cè)試。選擇三種常用化療藥物(多柔比星、順鉑和厄洛替尼)來(lái)評(píng)估鈣三醇處理的細(xì)胞。檢測(cè)到商業(yè)藥物和鈣三醇的可能的協(xié)同或保護(hù)作用。在這些實(shí)驗(yàn)中，從比細(xì)胞培養(yǎng)的最終所需濃度高4倍的濃度開(kāi)始，連續(xù)稀釋所選的商業(yè)藥物。制備0.4μg/mL的鈣三醇原液，然后加入連續(xù)稀釋的藥物(以1:1比率)。然后藥物和鈣三醇的混合物培養(yǎng)至少15分鐘，然后加入細(xì)胞中(比例為100μL比100μL)。因此，鈣三醇的最終濃度為0.1μg/mL。根據(jù)之前描述的辦法進(jìn)行試驗(yàn)，從而提供一致性并允許直接比較。結(jié)果基于測(cè)定活細(xì)胞的總數(shù)。結(jié)果(未顯示)表明鈣三醇預(yù)處理對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)物的化學(xué)保護(hù)作用而言不是必需的。預(yù)處理組和同時(shí)處理組之間的結(jié)果幾乎相同。因此，局部施用鈣三醇可以與化療的全身遞送同時(shí)施用。不要求分階段施用。實(shí)施例9：通過(guò)新穎的鈣三醇制劑保護(hù)免受化療引起的脫發(fā)(CIA)脫發(fā)是化療的最令人煩惱的副作用之一，目前還沒(méi)有治療學(xué)干預(yù)。顯示新生大鼠是研究化療引起的脫發(fā)(CIA)的優(yōu)異模型，因?yàn)樯L(zhǎng)期毛囊模式與人類(lèi)似。在本研究中，以劑量和時(shí)間依賴(lài)性方式，以局部制劑(40％(w/w)丙二醇，USP；和60％(w/w)無(wú)水酒精，200proof，未變性USP)遞送開(kāi)環(huán)甾體化合物鈣三醇(USP等級(jí))來(lái)治療/預(yù)防CIA。具體地，從HarlanLaboratories,Inc購(gòu)買(mǎi)LongEvans和SpragueDawley大鼠和幼仔。根據(jù)適用的動(dòng)物處理規(guī)章制度來(lái)收容并喂養(yǎng)大鼠。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前使幼仔馴化48小時(shí)。每天將開(kāi)環(huán)甾體化合物鈣三醇制劑(見(jiàn)上文)或載體對(duì)照(不含鈣三醇)局部施用在頭和頸部區(qū)域，從第5天開(kāi)始，連續(xù)施用6天。將大鼠與其同窩仔畜和鼠媽媽分離6小時(shí)。隨后，用肥皂和水洗凈經(jīng)治療區(qū)域，使幼仔返回其窩。在第13天，大鼠接受依托泊苷(1.5mg/kg每天，施用3天)或環(huán)磷酰胺(CTX)(37.5mg/kg施用一次)或環(huán)磷酰胺(35mg/kg，施用一次)和多柔比星(2.5mg/kg每天，施用3天)的組合。所有化療劑從Sigma購(gòu)買(mǎi)并且以總體積0.1mL腹膜內(nèi)(i.p.)施用。最后化療劑量后10天記錄脫發(fā)。對(duì)于移植綠色白血病的大鼠的實(shí)驗(yàn)，出生后第5天，將大鼠任意分成三組，每組45只。所有大鼠接受0.1mL不含血清(SF)RPMI中的1×105綠色白血病細(xì)胞系MIAC51(i.p.)。在37℃下在5％CO2，100％濕度孵化器中在添加L-谷氨酰胺和10％胎牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)MIAC51。細(xì)胞生長(zhǎng)到50％融合時(shí)(1.5×106mL)，將其收集在50mL錐形管中，在室溫下以600g×10min離心并以1×106/mL的濃度再懸浮在SF-RPMI中。第1組大鼠不再接受進(jìn)一步治療。第2組大鼠接受局部載體并在第13天接受CTX。第3組大鼠接受局部鈣三醇制劑(0.1μg)并在第13天接受CTX。如同上述進(jìn)行局部施用。出生后第23天，從所有大鼠中采集血樣并進(jìn)行差別處理。處死患白血病的大鼠，保留沒(méi)有白血病的大鼠并在第31天進(jìn)行第二次差別處理，在任何時(shí)間點(diǎn)如果發(fā)現(xiàn)白血病，通過(guò)CO2窒息處死動(dòng)物。結(jié)果表明接受依托泊苷的組中觀察到全身脫毛。相反，在用0.1μg鈣三醇治療6小時(shí)的大鼠中，所有動(dòng)物中觀察到部分局部保護(hù)。在接受0.3μg鈣三醇的組中，實(shí)現(xiàn)全身保護(hù)。參見(jiàn)圖20A和20B。在接受環(huán)磷酰胺的大鼠中，對(duì)照大鼠變得完全脫毛，而接受0.1μg鈣三醇的大鼠獲得與依托泊苷組觀察到的類(lèi)似保護(hù)。類(lèi)似地，施用0.3μg鈣三醇導(dǎo)致環(huán)磷酰胺治療大鼠的全身保護(hù)。參見(jiàn)圖21。采用其他化療或聯(lián)合化療法的類(lèi)似結(jié)果顯示于圖22A、22B、22C和23中。在移植綠色白血病的大鼠的單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中，初步結(jié)果顯示局部施用鈣三醇不保護(hù)癌細(xì)胞免受環(huán)磷酰胺的作用。參見(jiàn)圖24?？傊?，用主題制劑中的鈣三醇預(yù)處理提供對(duì)抗CIA的保護(hù)而不保護(hù)癌細(xì)胞。局部鈣三醇以劑量依賴(lài)性方式預(yù)防由單一化療以及聯(lián)合化療引起的CIA。另外，局部鈣三醇預(yù)防CIA，而不保護(hù)癌細(xì)胞免受化療的細(xì)胞毒作用。實(shí)施例10：接受多種化療法的綠色白血病大鼠中局部鈣三醇的CIA保護(hù)該研究驗(yàn)證局部鈣三醇溶液對(duì)多進(jìn)程化療引起脫發(fā)的動(dòng)物模型的保護(hù)作用。用于該研究的大鼠攜帶MIAC51，一種由胃灌注20-甲基膽蒽然后將綠色白血病細(xì)胞注射入大鼠幼仔而發(fā)展的大鼠綠色白血病細(xì)胞系。MIAC51細(xì)胞系引起惡性粒細(xì)胞性白血病，具有人綠色白血病的特征(白血病、白血病腹水和綠色白血病形成)。參見(jiàn)Jimenez等,Science238:1278-1280(1987)。迄今為止，還沒(méi)有有效的體外或非脊椎動(dòng)物模型來(lái)測(cè)試化療引起的脫發(fā)(CIA)。在最常用的模型中，由Jimenez等開(kāi)發(fā)的新生大鼠顯示與人的直接相關(guān)性(IntJCancer1996；65:97-103，以引用方式合并于此)。隨后，開(kāi)發(fā)了第二生長(zhǎng)期階段可通過(guò)修剪毛發(fā)誘導(dǎo)的大鼠模型，從而可測(cè)試多進(jìn)程化療。該模型可用于測(cè)試頻繁使用的脫發(fā)化療，包括環(huán)磷酰胺、多柔比星、紫杉醇、依托泊苷和阿糖胞苷及其組合。當(dāng)測(cè)試化療引起的脫發(fā)的保護(hù)劑時(shí)，首先確定測(cè)試制品是否將保護(hù)毛囊以及保護(hù)癌細(xì)胞免受化療和/或干擾治療。由Jimenez等開(kāi)發(fā)的白血病的新生大鼠模型提供同時(shí)測(cè)試維生素D化合物對(duì)白血病的發(fā)展、治療白血病、與化療劑潛在的相互作用的任何效應(yīng)，以及維生素D化合物對(duì)預(yù)防化療引起的脫發(fā)的效應(yīng)的時(shí)機(jī)。該模型也回答了測(cè)試試劑在同一動(dòng)物中的多次循環(huán)是否會(huì)導(dǎo)致多次保護(hù)毛囊。另外，通過(guò)采用加顏色的LongEvans大鼠，該研究也允許確定測(cè)試試劑是否保護(hù)毛色。鈣三醇制劑是透明無(wú)水液體，其在包含USP級(jí)丙二醇(40％w/)和無(wú)水乙醇，200proof(60％w/w)的載體中含有USP級(jí)鈣三醇。這些研究中的鈣三醇的濃度為約0.2μg/100μL(2μg/mL)。在冰上接受測(cè)試制品，并一經(jīng)獲得立即儲(chǔ)存在4-5℃。然后將批次再分成4.5mL試管，同時(shí)保持在冰上。因?yàn)閯?dòng)物組不會(huì)小于40/變量，各4.5mL單位的測(cè)試制品將在4-5℃下包裝在聚丙烯管中，加上批號(hào)。測(cè)試制品的4.5mL試管將保持在暗箱中，僅從冰箱中取出每一實(shí)驗(yàn)所需的量。包裝在4.5mL試管中的測(cè)試制品的樣品將以定時(shí)間隔測(cè)試，以確定鈣三醇水平。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，試管將保持在冰上，同時(shí)治療大鼠。載體由USP級(jí)丙二醇(40％w/w)和USP級(jí)無(wú)水和未變性無(wú)水乙醇，200proof(60％w/w)組成。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，如同測(cè)試制品一樣準(zhǔn)確處理對(duì)照載體。測(cè)定測(cè)試制品和載體本身。各測(cè)試組由該研究統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的40只動(dòng)物組成。該數(shù)目包括模型損耗，并考慮減少動(dòng)物數(shù)目的任何不測(cè)事件。當(dāng)動(dòng)物5天大時(shí)，用MIAC51注射所有動(dòng)物。測(cè)試五(5)次化療法：環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺/多柔比星、環(huán)磷酰胺/多柔比星/阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺/紫杉醇/依托泊苷和多柔比星//紫杉醇/依托泊苷。測(cè)試組是：不進(jìn)行化療、單獨(dú)化療、化療+載體、化療+測(cè)試制品＝160只動(dòng)物/每次化療法。因此，所使用動(dòng)物的最終估計(jì)數(shù)目如下：5種聯(lián)合化療法×160只動(dòng)物＝800幼仔/大鼠。對(duì)于采用第二生長(zhǎng)期階段成年大鼠模型的實(shí)驗(yàn)，僅使用沒(méi)有癌癥的動(dòng)物(例如，在化療后存活的那些)，而處死有著早期白血病跡象的動(dòng)物。Shay’s綠色白血病MIAC51細(xì)胞系的培養(yǎng)：如之前所述，在37℃下在具有100％濕度的5％CO2孵化器中培養(yǎng)MIAC51(Science1987；238:1278-80)。細(xì)胞在非組織培養(yǎng)物處理的燒瓶(Falcon)中在添加L-谷氨酰胺和10％胎牛血清(GibcoInvitrogen,Carlsbad,CA)的RPMI1640培養(yǎng)基(GibcoInvitrogen,Carlsbad,CA)中生長(zhǎng)。將細(xì)胞注入動(dòng)物之前，使它們生長(zhǎng)至50％融合并收集在錐形管中。然后在室溫下以600g離心細(xì)胞10分鐘，并以不含胎牛血清的RPMI1640中1×106的濃度再懸浮。然后在無(wú)菌條件下將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到29量規(guī)(ga).1/2cc胰島素注射器中。注射MIAC51：注射MIAC51時(shí)所有幼仔都是五天大，并用手控制住。輕輕拉出右腿，用酒精藥簽清潔該區(qū)域。然后腹膜內(nèi)注入MIAC51。注射器中的針頭、針筒和細(xì)胞是無(wú)菌的，且新的注射器用于各次注射。白血病的早期跡象的發(fā)展通常在第21-33天觀察到。因此，在第23和31天進(jìn)行血涂片。在第31天僅剃去沒(méi)有癌癥的動(dòng)物的毛發(fā)，而處死其余動(dòng)物。在新生大鼠的第一生長(zhǎng)期階段施用測(cè)試制品和對(duì)照制品：在各窩大鼠的約2cm2的頭和頸部區(qū)域局部施用載體或測(cè)試制品。對(duì)于5和6天大的大鼠，以4等分的25μL分四次施用100μL，以考慮其較小尺寸。以校準(zhǔn)的微量移液管用200μL的無(wú)菌尖端施用測(cè)試制品或載體。一旦測(cè)試制品或載體滴在頭的表面上，用戴手套的手指將其擦入直到全部吸收。然后立即將另一等分試樣施用在頭上，重復(fù)該過(guò)程，直到施用完100μL總測(cè)試制品或載體。對(duì)于7、8、9和10天大的動(dòng)物，施用50μL的等分試樣，施用兩次。在年齡較大的動(dòng)物中，可以以一次劑量施用100μL。測(cè)試制品的施用施加在頭和頸部，并用耐溶劑的腈手套用右食指擦入10秒。該施用法的原理是對(duì)于不同年齡，飽和速率可能不同，且測(cè)試制品或載體的遞送也可能不同。一旦溶液完全滲透入皮膚，將幼仔單獨(dú)裝在專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)有單獨(dú)小室的籠中6小時(shí)。然后用溫和的實(shí)驗(yàn)室洗手皂(Soft-CideEC,VWRinternational)洗滌幼仔，并用紙巾小心擦干。在新生大鼠的第一生長(zhǎng)期階段施用化療劑：四十只幼仔各自接受化療法，40只各自接受化療法和測(cè)試制品，40只各自接受化療法和載體。作為對(duì)照，40只動(dòng)物不接受化療。獲得各窩的平均重量并用于制備適當(dāng)濃度的化療劑。采用29ga.1/2cc胰島素注射器根據(jù)動(dòng)物重量以約100μL的體積腹膜內(nèi)注入化療劑。當(dāng)注射時(shí)，輕輕拉出各幼仔的右腿并用酒精藥簽清潔該區(qū)域。在成年大鼠的第二生長(zhǎng)期階段施用測(cè)試制品和對(duì)照制品：用手控制在第31天根據(jù)血涂片的血液學(xué)分析證實(shí)沒(méi)有患上癌癥的存活大鼠，并剃去頭和頸部區(qū)域的毛發(fā)(2-3cm2)。九天后，當(dāng)大鼠為40天大到45天大(包括端點(diǎn))時(shí)，將載體或測(cè)試制品施用于頭和頸部區(qū)域。以一次劑量將100μL的量施用于頭和頸部，并用耐溶劑的腈手套用右食指擦入10秒。一旦溶液完全滲透入皮膚，將單個(gè)大鼠單獨(dú)裝在籠中。然后用溫和的實(shí)驗(yàn)室洗手皂(Soft-CideEC,VWRinternational)洗滌大鼠，并用紙巾小心擦干。在成年大鼠的第二生長(zhǎng)期階段施用化療劑：各組接受5種不同的化療法中的一種，對(duì)于接受聯(lián)合阿糖胞苷的組別在第47天開(kāi)始并在第53天結(jié)束。獲得平均重量并用于制備適當(dāng)濃度的化療劑。采用29ga.1/2cc胰島素注射器根據(jù)動(dòng)物重量以約100μL的體積腹膜內(nèi)注入化療劑。對(duì)于施用化療劑，用手控制大鼠，不使用麻醉。用酒精藥簽清潔注射區(qū)域。施用途徑：測(cè)試制品和載體經(jīng)皮施用?；焺└鼓?nèi)注射。施用的頻率和持續(xù)時(shí)間以及劑量水平和體積：對(duì)于第一和第二生長(zhǎng)期周期，每天施用測(cè)試制品和載體，施用6天。測(cè)試制品在丙二醇/乙醇中含有濃度為2μg/mL的鈣三醇，載體僅含有丙二醇/乙醇載體?；谥亓恳约s100μL的體積腹膜內(nèi)施用化療劑。目視觀察和脫發(fā)等級(jí)：總(頭和頸)或全身脫發(fā)采用以下等級(jí)分級(jí)：0＝?jīng)]有脫發(fā)；1+＝0-25％脫發(fā)；2+＝25-50％脫發(fā)；3+＝50-75％脫發(fā)；4+＝75-100％脫發(fā)。每天采用目視觀察等級(jí)來(lái)分級(jí)脫發(fā)，同時(shí)進(jìn)行常規(guī)籠子觀察。另外，一旦全部窩或成年大鼠脫落毛發(fā)，該規(guī)模補(bǔ)充了攝像文件。實(shí)施例11：真皮吸收研究：在Gottingen中局部施用鈣三醇溶液并體外量化豬皮膚中的鈣三醇豬經(jīng)常用于涉及經(jīng)皮途徑遞送的毒性研究，因?yàn)樨i皮膚非常類(lèi)似于人皮膚。因此，該研究中采用豬來(lái)評(píng)估經(jīng)皮施用7天后鈣三醇局部制劑在Gottingen中的真皮耐受性和真皮滲透性。以0(安慰劑)、1、3、10和30μg/mL的劑量濃度在五個(gè)單獨(dú)的施用部位將測(cè)試制品和安慰劑制品施用于三只雌性和三只雌性Gottingen的一個(gè)治療組。分別以0(安慰劑)和100μg/mL的劑量濃度在兩個(gè)單獨(dú)的使用部位將測(cè)試制品或安慰劑制品施用于一只雄性微型豬的額外治療組。以4mg/cm2的施用量(相當(dāng)于6cm×6cm測(cè)試區(qū)域144mg，或166μL的測(cè)試溶液，其含有各種濃度的活性成分和載體)施用安慰劑制品或測(cè)試制品，兩組的每一施用部位每天施用兩次，相隔約6小時(shí)，在研究期間持續(xù)7天。對(duì)所有動(dòng)物每天進(jìn)行兩次關(guān)于發(fā)病率、死亡、損傷以及食物和水的利用度的觀察。每天進(jìn)行臨床觀察。測(cè)試前以及給藥后每天進(jìn)行皮膚反應(yīng)的評(píng)估。測(cè)試前和結(jié)束時(shí)(第7天)測(cè)量并記錄體重。測(cè)試前進(jìn)行體檢。在研究結(jié)束時(shí)，進(jìn)行尸檢并收集并保存經(jīng)治療和未經(jīng)治療的皮膚切面。進(jìn)行每一皮膚部位，以及靠近經(jīng)治療部位的未經(jīng)治療的皮膚部位的顯微鏡檢查。結(jié)果表明以0、1、3、10、30和100μg/mL的濃度將鈣三醇局部制劑經(jīng)皮施用于Gottingen可以很好耐受。在存活率、臨床表現(xiàn)、真皮刺激、體重、任何治療部位皮膚的目視檢查或顯微鏡檢查上均沒(méi)有觀察到治療的效應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。來(lái)自組織分布研究的數(shù)據(jù)表明在大部分角質(zhì)層和表皮樣品的其他部分中可檢測(cè)到鈣三醇，但在真皮樣品中檢測(cè)不到(其中有一例例外：?jiǎn)沃恍坌晕⑿拓i中施用100μg/mL劑量)。在該組實(shí)驗(yàn)中，雄性的鈣三醇組織水平似乎高于雌性。在表皮中觀察到最清晰的施用劑量與組織水平的相關(guān)性，其中隨著鈣三醇濃度從3μg/mL增加到100μg/mL，組織水平幾乎線(xiàn)性增加。尤其是，以1、3、10、30和100μg/g的預(yù)配制濃度使用安慰劑(丙二醇(USP)和無(wú)水乙醇(未變性)，200proof-U.S.,USP的40/60混合物(w/w))和鈣三醇局部制劑。測(cè)試制品以純品施用(不稀釋)。安慰劑和測(cè)試制品的制劑以各自所要求的濃度分配，一天施用一次，并儲(chǔ)存在室溫下。總共三只雄性和三只雌性實(shí)驗(yàn)性Gottingen(約4到5個(gè)月大)來(lái)源于MarshallBioResources,NorthRose,NewYork。隨后從原集群(stockcolony)中運(yùn)來(lái)一只額外的雄性(收到時(shí)約4.5個(gè)月大)。采用簡(jiǎn)單的隨機(jī)化過(guò)程，將四只雄性和三只雌性動(dòng)物(體重分別為11.75到15.55kg，14.50到16.65kg，隨機(jī)性)分配至安慰劑組和治療組。每天真皮施用兩次安慰劑和測(cè)試制品，相隔約6小時(shí)，在研究期間持續(xù)7天。劑量濃度為0、1、3、10、30和100μg/mL，以4mg/cm2的施用量(相當(dāng)于144mg或166μL的測(cè)試溶液)施用。在開(kāi)始施用前(對(duì)于第1組和第2組分別為第4和第5天)，采用電動(dòng)剪毛機(jī)修剪施用部位的毛發(fā)。注意避免擦傷皮膚。各動(dòng)物的背面被分成第1組五處施用部位和第2組兩處施用部位。各施用部位約為6×6cm，各部位間距至少為2cm。用玻璃攪拌棒或適當(dāng)?shù)膬x器將安慰劑和測(cè)試制品制劑均勻施用在指定施用部位。在給藥之前，用自來(lái)水潤(rùn)濕的軟紙巾(即)輕輕去除來(lái)自之前劑量的剩余測(cè)試制品。研究結(jié)束時(shí)，從腹部正中切口體現(xiàn)皮膚，收集并保存經(jīng)治療和未經(jīng)治療的皮膚切面。首先各6x6cm給藥部位的切面用溫和的肥皂和水混合物(例如，水或等效物中的1％象牙皂)進(jìn)行徹底的表面洗滌，來(lái)去除任何殘余的局部測(cè)試制劑。然后用乙醇擦凈經(jīng)洗滌皮膚切面，并切除至(包括)脂肪層。如果待切除面積大于給藥面積，則給藥面積用消不去的墨水區(qū)分以描繪給藥的皮膚區(qū)域。平放1.5cmx1.5cm切面，包在雙層莎倫包裝膜(或等效物)中并在液氮中快速冷凍。樣品儲(chǔ)存在-70℃并由快遞在干冰上連夜運(yùn)送，用于分析。視情況而定鑒定各皮膚切面(例如，動(dòng)物鑒定、研究數(shù)目、日期等)。一旦到達(dá)分析場(chǎng)所，將皮膚切面置于不透水的塑料袋中并浮在溫水(約30℃-35℃)中融化。用蒸餾去離子水輕輕沖洗各皮膚切面以去除任何殘留的測(cè)試制品和血。通過(guò)人工手術(shù)刀消融去除所有皮下組織(例如，脂肪)。在給藥區(qū)域的中部?jī)?nèi)，劃出四塊單個(gè)1cm2圓(相同)，隨后鑒定各部位并記錄實(shí)際面積。然后用1cm2沖頭從皮膚片上切除相同的測(cè)試部位。稱(chēng)重皮膚切面并記錄重量。剝離各相同的劃界區(qū)域的角質(zhì)層(TransporeTM,3M)足夠多的次數(shù)(～10-～20)直到大約10％-25％的區(qū)域表面顯示反光。該過(guò)程去除角質(zhì)層和任何殘留的表面劑量。剝離角質(zhì)層后，通過(guò)在60℃下加熱約1-1.5分鐘將皮膚分成表皮(無(wú)角質(zhì)層，簡(jiǎn)稱(chēng)為“表皮”)和真皮。然后用精尖鑷子或手術(shù)刀撥開(kāi)皮膚層。稱(chēng)重表皮和真皮并記錄重量。對(duì)于提取，在1mL無(wú)水乙醇(Sigma-Aldrich,USP/NF級(jí)別)中提取所有皮膚樣品。在5mL乙腈(EMD,HPLC級(jí)別)中提取剝離的條帶。所有提取在室溫下進(jìn)行約24小時(shí)。通過(guò)真空離心干燥500μL量的剝離的條帶提取物并在100μL無(wú)水乙腈中重構(gòu)。也干燥表皮提取物并在100μL的80:20乙醇:水中重構(gòu)。通過(guò)反向高效液相色譜(HPLC)和紫外和質(zhì)譜檢測(cè)儀量化鈣三醇。檢測(cè)下限估計(jì)為0.4ng/mL。從角質(zhì)層(剝離的條帶)、表皮和真皮中量化的鈣三醇的結(jié)果概括在表11-1到11-4。圖25A和25B分別說(shuō)明角質(zhì)層和表皮中的水平，圖26說(shuō)明僅雄性中的表皮水平。角質(zhì)層數(shù)據(jù)以?xún)煞N不同的單位提供，用ng/cm2來(lái)反映隨樣品面積變化的剝離的角質(zhì)層樣品中回收的鈣三醇的量，并以μg/mg組織來(lái)估計(jì)。然而，以μg/mg報(bào)告的濃度通過(guò)分離層之前的差別的總樣品重量減去樣品的表皮和真皮的重量(而不是實(shí)際重量，由于其粘至剝離的角質(zhì)層上)來(lái)確定。表皮和真皮樣品以組織濃度(ng/mg)報(bào)告，采用樣品除以表層的實(shí)際濕重測(cè)定的量。表11-1動(dòng)物的回收的鈣三醇的角質(zhì)層(ng/cm2)平均值±SD(n＝動(dòng)物數(shù)[重復(fù)4次/動(dòng)物])治療雄性微型豬雌性微型豬未經(jīng)治療0±0*(1)na安慰劑30.2±35.0(4)0±0(3)1μg/mL56.1±17.4(3)0.76±13(3)3μg/mL62.4±7.91(3)1.12±1.49(3)10μg/mL59.6±14.1(3)1.65±1.80(3)30μg/mL54.6±32.5(3)20.2±11.7(3)100μg/mL118.1±11.4(1)na·0表示結(jié)果低于檢測(cè)限·na＝不適用表11-2估計(jì)的回收的鈣三醇的角質(zhì)層(ng/mg)平均值±SD(n＝動(dòng)物數(shù)[重復(fù)4次/動(dòng)物])治療雄性微型豬雌性微型豬未經(jīng)治療0±0*(1)na安慰劑0.92±1.07(4)0±0(3)1μg/mL1.54±0.79(3)0.03±0.05(3)3μg/mL1.63±0.25(3)0.04±0.06(3)10μg/mL2.02±0.39(3)0.05±0.04(3)30μg/mL1.51±0.89(3)0.64±0.37(3)100μg/mL4.52±1.21(1)na·0表示結(jié)果低于檢測(cè)限·na＝不適用表11-3回收的鈣三醇的表皮(ng/mg)平均值±SD(n＝動(dòng)物數(shù)[重復(fù)4次/動(dòng)物])治療雄性微型豬雌性微型豬未經(jīng)治療0±0*(1)na安慰劑0.12±0.23(4)0±0(3)1μg/mL0.16±0.28(3)0±0(3)3μg/mL0.14±0.23(3)0±0(3)10μg/mL0.23±0.20(3)0.02±0.04(3)30μg/mL0.38±0.33(3)0.34±0.24(3)100μg/mL2.09±1.0(1)na·0表示結(jié)果低于檢測(cè)限·na＝不適用表11-4回收的鈣三醇的真皮(ng/mg)平均值±SD(n＝動(dòng)物數(shù)[重復(fù)4次/動(dòng)物])治療雄性微型豬雌性微型豬未經(jīng)治療0.08±0.01(1)na安慰劑0.02±0.03(4)0±0*(3)1μg/mL0±0(3)0±0(3)3μg/mL0±0(3)0±0(3)10μg/mL0±0(3)0±0(3)30μg/mL0±0(3)0±0(3)100μg/mL0.13±0.04(1)na·0表示結(jié)果低于檢測(cè)限·na＝不適用數(shù)據(jù)表明，在大部分角質(zhì)層和表皮樣品中可檢測(cè)到鈣三醇，但在真皮樣品中檢測(cè)不到(其中有一例例外：?jiǎn)沃恍坌晕⑿拓i中施用100μg/mL劑量)。這與實(shí)施例1中描述的Franz人皮膚有限模型獲得的結(jié)果一致。所評(píng)估的組織樣品之中，通常，雄性微型豬的鈣三醇組織水平似乎大于雌性微型豬。在角質(zhì)層中觀察到鈣三醇的最高濃度。盡管角質(zhì)層含量是估計(jì)值，其較高濃度可以反映鈣三醇深入皮膚氣孔的存在，其不能被表面洗滌過(guò)程去除，或可歸因于鈣三醇在親脂性極強(qiáng)的角質(zhì)層基質(zhì)中的溶解性。然而，在表皮中觀察到最清晰的施用劑量與組織水平的相關(guān)性，其中隨著鈣三醇濃度從3μg/mL增加到100μg/mL，組織水平幾乎線(xiàn)性增加。實(shí)施例12：接受多進(jìn)程化療的綠色白血病大鼠中的局部溶液研究收到時(shí)LongEvans大鼠(HarlanLaboratories,Inc)為3天大。收到時(shí)和每天用電子秤(AmericanScientificProductsTL410s)獲得動(dòng)物重量，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前收容大鼠兩天。然后隨機(jī)將動(dòng)物分成四組。所有大鼠接受如下所述的MIAC51。第1組(n＝27)不接受進(jìn)一步治療。第2組(n＝40)僅接受化療劑。第3組(n＝40)接受化療劑和如下描述的局部載體。第4組(n＝40)接受化療劑和局部鈣三醇。治療從出生后第6天開(kāi)始。將0.1mL量的局部鈣三醇施用于大鼠的頭和頸上。對(duì)于第一生長(zhǎng)期周期，在第6和7天，以25μl體積施用載體或鈣三醇四次，以避免飽和。在第8、9、10和11天施用50μl體積兩次。對(duì)于第二生長(zhǎng)期周期，在第40到45天用0.1mL的載體或鈣三醇每天治療大鼠。對(duì)于每次施用，需要在2cm2區(qū)域中用腈檢查手套覆蓋的右食指擦入10秒。治療完成后，各大鼠各自分開(kāi)6小時(shí)。隨后用溫和洗手皂(SoftCIDE-ECfromVWRInternational)和蒸餾水洗滌各大鼠的頭和頸。然后將幼仔放回它們的母親身邊并送回動(dòng)物室。對(duì)于第二生長(zhǎng)期周期，將成年大鼠放回裝有它們的同窩幼仔的籠中并送回動(dòng)物室。出生后第5天所有大鼠腹膜內(nèi)接受0.1ml不含血清(SF)RPMI中的1x105MIAC51。在37℃下在5％CO2，100％濕度孵化器中在添加L-谷氨酰胺和10％胎牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)MIAC51。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到50％融合時(shí)(1.5×106mL)，將其收集在50mL錐形管中，在室溫下以600g離心10min并在注射前以1×106/mL的濃度再懸浮在SF-RPMI中。出生后第23天，從所述大鼠中采集血樣并進(jìn)行差別處理。處死患上白血病的大鼠，沒(méi)有白血病的大鼠用于下一步實(shí)驗(yàn)。在第31天進(jìn)行第二次差別處理，處死白血病動(dòng)物。存活動(dòng)物剃去2cm2區(qū)域，然后施用第二組載體或鈣三醇治療，并在15天后施用第二進(jìn)程的化療。在第二和第一生長(zhǎng)期階段，化療劑治療后十天記錄脫發(fā)。各大鼠脫發(fā)程度通過(guò)以下等級(jí)來(lái)確定：0＝?jīng)]有脫發(fā)；1+＝0-25％脫發(fā)；2+＝25-50％脫發(fā)；3+＝50-75％脫發(fā)；4+＝75-100％脫發(fā)。實(shí)驗(yàn)化合物：用載體(40％重量的丙二醇和60％重量的無(wú)水200proof乙醇)將2.3μg/g的鈣三醇稀釋到2μg/ml的最終濃度。再分1mL的小瓶并保存在4℃的冰箱中。對(duì)于各實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程期間取出一瓶2.3μg/g鈣三醇和載體并放置在冰上。去掉不用的制劑。A.僅環(huán)磷酰胺施用化療劑幼年大鼠：第13天，用1/2cc胰島素注射器29G1/2”(B-D)使所有大鼠腹膜內(nèi)接受總體積為0.1mL的H2O/甘露醇混合物中的環(huán)磷酰胺(CTX)(SigmaAldrich,Lot#068k1131)37.5mg/kg。成年大鼠：對(duì)于化療的第二進(jìn)程，用1/2cc胰島素注射器29G1/2”(B-D)將總體積為0.1mL的H2O/甘露醇混合物中的150mg/kg環(huán)磷酰胺腹膜內(nèi)施用于47天大的麻醉大鼠(50mg/kg氯胺酮/5mg/kg賽拉嗪)。結(jié)果見(jiàn)表12-1和12-2。具體地，在第一輪化療后(表12-1和圖27)，僅接受環(huán)磷酰胺或環(huán)磷酰胺加載體的所有大鼠具有嚴(yán)重脫發(fā)(+4)。相反，接受環(huán)磷酰胺加鈣三醇的所有大鼠不顯示任何脫發(fā)跡象，與對(duì)照組類(lèi)似。在第二輪化療后獲得類(lèi)似結(jié)果，如表12-2所示(也參見(jiàn)圖28)。表12-1：用環(huán)磷酰胺(CTX)治療的大鼠在第一輪化療后的脫發(fā)程度表12-2：用環(huán)磷酰胺(CTX)治療的大鼠在第二輪化療后的脫發(fā)程度此外，該實(shí)驗(yàn)表明接受鈣三醇的局部制劑的大鼠的存活率基本上類(lèi)似于僅接受化療或化療加載體的大鼠。如表12-3所示，用環(huán)磷酰胺和鈣三醇的局部制劑治療的動(dòng)物的存活率(25％)類(lèi)似于僅用環(huán)磷酰胺治療的大鼠(20％)和用環(huán)磷酰胺和載體治療的大鼠(23％)。表12-3：用環(huán)磷酰胺(CTX)治療的大鼠在兩輪化療后的存活率總之，在環(huán)磷酰胺組中，鈣三醇在兩個(gè)周期中均提供100％的CIA保護(hù)，且不干擾20-25％范圍內(nèi)的治愈率。B.環(huán)磷酰胺和多柔比星施用化療劑幼年大鼠：第13天，用1/2cc胰島素注射器29G1/2”(B-D)使所有大鼠腹膜內(nèi)接受總體積為0.1mL的H2O/甘露醇混合物中的環(huán)磷酰胺(CTX)(SigmaAldrich,Lot#068k1131)37.5mg/kg。第13、14和15天，大鼠I.P.接受0.1mL蒸餾水中的2.5mg/kg鹽酸多柔比星(SigmaAldrich,Lot#038k1349)(ADM)。成年大鼠：對(duì)于化療的第二進(jìn)程，在第47天用1/2cc胰島素注射器29G1/2”(B-D)將總體積為0.1mL的H2O/甘露醇混合物中的150mg/kg環(huán)磷酰胺腹膜內(nèi)施用于麻醉大鼠(50mg/kg氯胺酮/5mg/kg賽拉嗪)。對(duì)于化療的第二進(jìn)程，如上所述，第47到49天大鼠接受20mg/kgADM。結(jié)果見(jiàn)表12-4和12-5。具體地，在第一輪化療后(表12-4和圖29)，僅接受環(huán)磷酰胺和多柔比星或環(huán)磷酰胺和多柔比星加載體的所有大鼠具有嚴(yán)重脫發(fā)(+4)。相反，接受環(huán)磷酰胺和多柔比星加鈣三醇的所有大鼠不顯示任何脫發(fā)跡象，與對(duì)照組類(lèi)似。在第二輪化療后獲得類(lèi)似結(jié)果，如表12-5所示(也參見(jiàn)圖30)。表12-4：用環(huán)磷酰胺(CTX)和多柔比星(ADM)治療的大鼠在第一輪化療后的脫發(fā)程度表12-5：用環(huán)磷酰胺(CTX)和多柔比星(ADM)治療的大鼠在第二輪化療后的脫發(fā)程度此外，該實(shí)驗(yàn)表明接受鈣三醇的局部制劑的大鼠的存活率基本上類(lèi)似于僅接受化療或化療加載體的大鼠。如表12-6所示，用環(huán)磷酰胺和多柔比星加鈣三醇的局部制劑治療的動(dòng)物的存活率(50％)類(lèi)似于僅用化療治療的大鼠(53％)和用化療加載體治療的大鼠(55％)。表12-6：用環(huán)磷酰胺(CTX)和多柔比星(ADM)治療的大鼠在兩輪化療后的存活率總之，在環(huán)磷酰胺和多柔比星組中，鈣三醇在兩個(gè)周期中均提供100％的CIA保護(hù)，且不干擾50-55％范圍內(nèi)的治愈率。C.環(huán)磷酰胺、多柔比星和阿糖胞苷施用化療劑幼年大鼠：第13天，用1/2cc胰島素注射器29G1/2”(B-D)使所有大鼠腹膜內(nèi)接受總體積為0.1mL的H2O/甘露醇混合物中的環(huán)磷酰胺(CTX)(SigmaAldrich,Lot#068k1131)30mg/kg。第13、14和15天，大鼠腹膜內(nèi)接受0.1mL蒸餾水中的2.0mg/kg鹽酸多柔比星(SigmaAldrich,Lot#038k1349)(ADM)，第13-19天，大鼠接受50mg/kg阿糖胞苷。成年大鼠：對(duì)于化療的第二進(jìn)程，將100mg/kg環(huán)磷酰胺施用于麻醉大鼠(50mg/kg氯胺酮/5mg/kg賽拉嗪)持續(xù)1天，施用20mg/kg多柔比星持續(xù)3天且施用100mg/kg阿糖胞苷持續(xù)7天。結(jié)果見(jiàn)表12-7和12-8。具體地，在第一輪化療后(表12-7和圖31)，僅接受環(huán)磷酰胺、多柔比星和阿糖胞苷或環(huán)磷酰胺、多柔比星和阿糖胞苷加載體的所有大鼠具有嚴(yán)重脫發(fā)(+4)。相反，接受環(huán)磷酰胺、多柔比星和阿糖胞苷加鈣三醇的所有大鼠不顯示任何脫發(fā)跡象，與對(duì)照組類(lèi)似。在第二輪化療后獲得類(lèi)似結(jié)果，如表12-8所示(也參見(jiàn)圖32)。表12-7：用環(huán)磷酰胺(CTX)、多柔比星(ADM)和阿糖胞苷(ARA-C)治療的大鼠在第一輪化療后的脫發(fā)程度表12-8：用環(huán)磷酰胺(CTX)、多柔比星(ADM)和阿糖胞苷(ARA-C)治療的大鼠在第二輪化療后的脫發(fā)程度此外，該實(shí)驗(yàn)表明接受鈣三醇的局部制劑的大鼠的存活率基本上類(lèi)似于僅接受化療或化療加載體的大鼠。如表12-9所示，用環(huán)磷酰胺、多柔比星和阿糖胞苷加鈣三醇的局部制劑治療的動(dòng)物的存活率(78％)類(lèi)似于僅用化療治療的大鼠(80％)和用化療加載體治療的大鼠(75％)。表12-9：用環(huán)磷酰胺(CTX)、多柔比星(ADM)和阿糖胞苷(ARA-C)治療的大鼠在兩輪化療后的存活率總之，在環(huán)磷酰胺、多柔比星和阿糖胞苷組中，鈣三醇在兩個(gè)周期中均提供100％的CIA保護(hù)，且不干擾75-80％范圍內(nèi)的治愈率。D.環(huán)磷酰胺、紫杉醇和依托泊苷施用化療劑幼年大鼠：第13天，用1/2cc胰島素注射器29G1/2”(B-D)使所有大鼠腹膜內(nèi)接受總體積為0.1mL的H2O/甘露醇混合物中的環(huán)磷酰胺(CTX)(SigmaAldrich,Lot#068k1131)37.5mg/kg。第11-13天，大鼠同時(shí)接受0.1mL二甲亞砜(SigmaAldrich,Lot#078K1428)中的2.5mg/kg紫杉醇(Taxol)和在特定溶劑(參見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序)和HBSS中稀釋的1.5mg/kg依托泊苷(VP-16)(SigmaAldrich,Lot#047K1162)。成年大鼠：對(duì)于化療的第二進(jìn)程，在第47天用1/2cc胰島素注射器29G1/2”(B-D)將總體積為0.1mL的H2O/甘露醇混合物中的150mg/kg環(huán)磷酰胺腹膜內(nèi)施用于麻醉大鼠(50mg/kg氯胺酮/5mg/kg賽拉嗪)。對(duì)于化療的第二進(jìn)程，如上所述，第45到48天大鼠接受10mg/kg紫杉醇和15mg/kgVP-16。結(jié)果見(jiàn)表12-10和12-11。具體地，在第一輪化療后(表12-10和圖33)，僅接受環(huán)磷酰胺、紫杉醇和依托泊苷或環(huán)磷酰胺、紫杉醇和依托泊苷加載體的所有大鼠具有嚴(yán)重脫發(fā)(+4)。相反，接受環(huán)磷酰胺、紫杉醇和依托泊苷加鈣三醇的所有大鼠不顯示任何脫發(fā)跡象，與對(duì)照組類(lèi)似。在第二輪化療后獲得類(lèi)似結(jié)果，如表12-11所示(也參見(jiàn)圖34)。表12-10：用環(huán)磷酰胺(CTX)、紫杉醇和依托泊苷治療的大鼠在第一輪化療后的脫發(fā)程度表12-11：用環(huán)磷酰胺(CTX)、紫杉醇和依托泊苷治療的大鼠在第二輪化療后的脫發(fā)程度此外，該實(shí)驗(yàn)表明接受鈣三醇的局部制劑的大鼠的存活率基本上類(lèi)似于僅接受化療或化療加載體的大鼠。如表12-12所示，用環(huán)磷酰胺、紫杉醇和依托泊苷加鈣三醇的局部制劑治療的動(dòng)物的存活率(83％)類(lèi)似于僅用化療治療的大鼠(83％)和用化療加載體治療的大鼠(78％)。表12-12：用環(huán)磷酰胺(CTX)、紫杉醇和依托泊苷治療的大鼠在兩輪化療后的存活率總之，在環(huán)磷酰胺、紫杉醇和依托泊苷組中，鈣三醇在兩個(gè)周期中均提供100％的CIA保護(hù)，且不干擾78-83％范圍內(nèi)的治愈率。E.多柔比星、紫杉醇和依托泊苷施用化療劑幼年大鼠：第13-15天，用1/2cc胰島素注射器29G1/2”(B-D)使所有大鼠腹膜內(nèi)接受總體積為0.1mL的蒸餾水中的鹽酸多柔比星(SigmaAldrich,Lot#038k1349)(ADM)2.5mg/kg。同時(shí)，大鼠接受2.5mg/kg紫杉醇(Taxol)(SigmaAldrich,Lot#078k1428)和1.5mg/kg依托泊苷(VP-16)(SigmaAldrich,Lot#047K1162)。成年大鼠：對(duì)于化療的第二進(jìn)程，在第47-49天用1/2cc胰島素注射器29G1/2”(B-D)將總體積為0.1mL的上述化療劑腹膜內(nèi)施用于麻醉大鼠(50mg/kg氯胺酮/5mg/kg賽拉嗪)。第二進(jìn)程的劑量如下：20mg/kgADM,10mg/kg紫杉醇和15mg/kgVP-16。結(jié)果見(jiàn)表12-12和12-14。具體地，在第一輪化療后(表12-13和圖35)，僅接受多柔比星、紫杉醇和依托泊苷或多柔比星、紫杉醇和依托泊苷加載體的所有大鼠具有嚴(yán)重脫發(fā)(+4)。相反，接受多柔比星、紫杉醇和依托泊苷加鈣三醇的所有大鼠不顯示任何脫發(fā)跡象，與對(duì)照組類(lèi)似。在第二輪化療后獲得類(lèi)似結(jié)果，如表12-14所示(也參見(jiàn)圖36)。表12-13：用多柔比星(ADM)、紫杉醇和依托泊苷治療的大鼠在第一輪化療后的脫發(fā)程度表12-14：用多柔比星(ADM)、紫杉醇和依托泊苷治療的大鼠在第二輪化療后的脫發(fā)程度此外，該實(shí)驗(yàn)表明接受鈣三醇的局部制劑的大鼠的存活率基本上類(lèi)似于僅接受化療或化療加載體的大鼠。如表12-15所示，用多柔比星、紫杉醇和依托泊苷加鈣三醇的局部制劑治療的動(dòng)物的存活率(80％)類(lèi)似于僅用化療治療的大鼠(80％)和用化療加載體治療的大鼠(83％)。表12-15：用多柔比星(ADM)、紫杉醇和依托泊苷治療的大鼠在兩輪化療后的存活率總之，在多柔比星、紫杉醇和依托泊苷組中，鈣三醇在兩個(gè)周期中均提供100％的CIA保護(hù)，且不干擾80-83％范圍內(nèi)的治愈率。實(shí)施例13：Gottingen中局部鈣三醇的4周經(jīng)皮毒性研究對(duì)照、載體和測(cè)試制品的制備：新鮮對(duì)照制品：分配USP注射用0.9％氯化鈉用于每周研究并冷藏。載體，即丙二醇的40/60重量混合物(w/w)，USP和乙醇(未變性，無(wú)水)200ProofUSP，和包含比重為0.875的鈣三醇(USP)的測(cè)試制品按收到的原樣使用，不調(diào)節(jié)純度。所收到的測(cè)試制品的濃度為5.07、10.31和55.34μg/mL。測(cè)試制品以純品施用(不稀釋)。分配載體和測(cè)試制品用于每周研究并冷藏。有時(shí)，在研究期間根據(jù)需要分配額外的測(cè)試物質(zhì)。施用：施用前，從動(dòng)物背后夾住毛發(fā)。對(duì)照動(dòng)物具有兩個(gè)測(cè)試部位：部位1用載體治療，部位2用鹽水治療。各部位為450cm2，以脊柱兩邊分開(kāi)，并用去不掉的標(biāo)記在角落進(jìn)行標(biāo)記。平均分開(kāi)對(duì)照組的兩個(gè)測(cè)試部位。如有必要，再次夾住毛發(fā)。注意避免擦傷皮膚。皮膚研究期間，每天兩次施用對(duì)照制品、載體和測(cè)試制品，相隔約6小時(shí)，持續(xù)4周(連續(xù)29天)。用玻璃攪拌棒或適當(dāng)?shù)膬x器將制劑均勻地施加在施用部位。在下一次給藥前用自來(lái)水潤(rùn)濕的Wypall輕輕去除任何殘留的測(cè)試物質(zhì)。如有必要，用干凈的干燥Wypall擦干部位。施用于所有動(dòng)物的劑量是1800mg的適當(dāng)制劑。劑量濃度是5.07、10.31和55.34μg/mL并以2.1mL的劑量體積施用。以與治療組相同的方式將對(duì)照制品和載體施用于對(duì)照組。對(duì)照動(dòng)物的給藥體積是1.0mL載體和0.9mL鹽水。由于所觀察到的臨床征象的嚴(yán)重性，接受55.34μg/mL的所有動(dòng)物在第23天不給藥。第24天所有動(dòng)物恢復(fù)給藥。結(jié)果：進(jìn)行該研究來(lái)評(píng)估當(dāng)每天兩次經(jīng)皮施用鈣三醇局部溶液、持續(xù)4周時(shí)的潛在亞慢性毒性。四只動(dòng)物/性別/組別的Gottingen中的三個(gè)試驗(yàn)組分別以5.07、10.31和55.34μg/mL的劑量濃度施用鈣三醇局部溶液。四只動(dòng)物/性別的一個(gè)另外組作為對(duì)照，接受載體，即丙二醇的40/60重量混合物(w/w)，USP和乙醇(未變性，無(wú)水)200ProofUSP，和對(duì)照制品，即USP注射用0.9％氯化鈉。以450cm2測(cè)試部位內(nèi)4mg/cm2的劑量將鈣三醇局部溶液或載體經(jīng)皮施用至所有組別中，一天兩次，連續(xù)29天。對(duì)所有動(dòng)物每天進(jìn)行兩次關(guān)于發(fā)病率、死亡、損傷以及食物和水的利用度的觀察。每周進(jìn)行臨床觀察。每周測(cè)量并記錄體重。在第1周期間每次給藥后進(jìn)行皮膚刺激得分，然后在第2到第4周期間每周兩次(第二次劑量后)進(jìn)行皮膚刺激得分，記錄施用部位的變化。測(cè)試前以及在最終尸檢前的所有存活動(dòng)物中進(jìn)行眼底檢查。測(cè)試前進(jìn)行體檢。測(cè)試前、給藥前、第1天第一次給藥后和最后一周給藥期間進(jìn)行心電圖檢查、測(cè)試前以及最終尸檢前從所有動(dòng)物中收集血樣和尿樣，用于臨床病理學(xué)評(píng)價(jià)。在指定時(shí)間點(diǎn)在第1天和第27天從所有存活動(dòng)物中收集血樣，用于測(cè)定測(cè)試制品的血漿濃度。從測(cè)試種類(lèi)的濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)中測(cè)定測(cè)試制品的毒理動(dòng)力學(xué)(TK)參數(shù)。在研究結(jié)束時(shí)進(jìn)行尸檢，記錄器官重量并用顯微鏡檢查選定的組織。在研究的第28天，處死接受55.34μg/mL濃度的一只瀕死雄性動(dòng)物。處死前觀察到該動(dòng)物具有活動(dòng)減少、食欲不振和震顫。該動(dòng)物的發(fā)病原因被認(rèn)為是接近于致死水平的高鈣血水平。所有剩余的微型豬存活到研究第30天的預(yù)定結(jié)束時(shí)間。在研究的第3和第4周期間，接受55.34μg/mL濃度的大部分微型豬中觀察到活動(dòng)減少、食欲不振、嘔吐和震顫。在研究的最后一周或最后兩周期間，接受55.34μg/mL濃度的雄性和雌性動(dòng)物中觀察到輕微刺激。接受5.07和10.31μg/mL治療的雄性和雌性動(dòng)物的平均體重和體重增加與對(duì)照相當(dāng)。接受55.34μg/mL濃度的所有雄性和雌性動(dòng)物在研究的最后兩周期間失去大量體重，且該周期內(nèi)雄性和雌性動(dòng)物的平均體重明顯降低。測(cè)試前和最終眼底檢查時(shí)沒(méi)有觀察到任何動(dòng)物中的眼底異常。鈣三醇局部溶液不引起定性心電圖異常，但在最終的給藥前和給藥后時(shí)間間隔內(nèi)組平均心率有著輕微增加。毫無(wú)疑問(wèn)，心率增加與研究期間這些微型豬的鈣水平明顯增加有關(guān)。定量心電圖參數(shù)上沒(méi)有觀察到鈣三醇局部溶液的其他劑量相關(guān)作用。在最終評(píng)價(jià)時(shí)雄性或雌性動(dòng)物中沒(méi)有觀察到鈣三醇局部溶液相關(guān)的血液病學(xué)、凝固或尿分析變化。在55.34μg/mL濃度觀察到以下臨床化學(xué)變化，最顯著的是所觀察到的接近致死水平的高鈣水平。所觀察到的另一個(gè)變化是低的氯化物值，和高膽固醇、葡萄糖、脲氮和三酸甘油酯值。鈣三醇局部溶液相關(guān)的宏觀病理學(xué)發(fā)現(xiàn)局限于接受55.34μg/mL濃度的一只雌性動(dòng)物的胃黏膜，其由輕微的不規(guī)則表面組成。與對(duì)照相比，觀察到接受55.34μg/mL濃度的兩種性別的動(dòng)物的腎臟重量的絕對(duì)和相對(duì)增加以及胸腺重量的減少。直接的鈣三醇局部溶液相關(guān)的微觀發(fā)現(xiàn)存在于骨、腎臟、心臟、經(jīng)治療的皮膚、胸腺和甲狀腺。另外，直接的鈣三醇局部溶液相關(guān)的發(fā)現(xiàn)包括多中心的血管變化和多中心的粘膜礦化。間接的測(cè)試制品相關(guān)的微觀發(fā)現(xiàn)存在于胰腺。這些微觀變化存在于兩種性別動(dòng)物中，且限于接受55.34μg/mL濃度劑量的動(dòng)物。股骨、胸骨和肋骨的微觀變化限于骨干皮層質(zhì)骨和骨腔。它們的特征為骨營(yíng)養(yǎng)不良和嗜堿性基質(zhì)的沉淀。腎微觀觀察的特征為礦化、管狀變性/再生和亞急性炎癥。心肌層的微觀觀察是肌纖維礦化、亞急性炎癥和血管變化。另外，一只雄性動(dòng)物和一只雌性動(dòng)物具有心臟礦化。觀察到多中心的粘膜/上皮礦化，嚴(yán)重程度按照以下順序降低：胃黏膜、肺、喉、氣管、前列腺、唾液頜下腺內(nèi)和膀胱內(nèi)。鈣三醇局部溶液相關(guān)的血管變化是普遍的，且主要影響小到中等大小的血管。它們主要在心臟和骨腔內(nèi)觀察到，偶爾在不同器官/體系中觀察到。經(jīng)治療皮膚的微觀變化的特征為表皮增生和角化過(guò)度以及真皮的血管周混合細(xì)胞炎癥。胸腺、甲狀腺和胰腺的微觀變化的特征分別為淋巴貧化、濾泡細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)和增生以及單細(xì)胞壞死。在該研究基礎(chǔ)上，以55.34μg/mL濃度觀察到的臨床化學(xué)和微觀變化為基礎(chǔ)，認(rèn)為沒(méi)有觀察到不良反應(yīng)的水平(NOAEL)是10.31μg/mL。參考文獻(xiàn)：Diker-CohenT,KorenR,LibermanUA,RavidAVitaminDprotectskeratinocytesfromapoptosisinducedbyosmoticshock,oxidativestress,andtumornecrosisfactor.”AnnNYAcadSci.2003Dec；1010:350-3.(ClinicalTrials.gov,Mosby'sDrugConsult,第13版).GeneverPG,MAxfield,SJ,KennovinGD,MaltmanJ,BowgenCH,RaxworthyMJ,SkerryTM.Evidenceforanovelglutamate-mediatedsignalingpathwayinkeratinocytes.JInvestDermatol.1999Mar；112(3):337-42.Kiryu-SeoS,GamoK,TachibanaT,TanakaK,KiyamaH.UniqueantiapoptoticactivityofEAAC1ininjuredmotorneurons.TheEMBOJournal(2006)25,3411–3421.NollenEA,BruntsingJF,RoelofsenH,WeberLa,KampingaHH.Invivochaperonactivityofheatshcokprotein70andthermotolerance.MolCellBiol1999；19:2069-79.RocchiP,JugpalP,SoA,SinnemanS,EttingerS,FazliL,NelsonC,GleaveM.SmallinterenceRNAtargetingheatshcokprotein27inhibitsthegrowthofprostaticcelllinesandinducesapoptosisviacaspase3activationinvitroBJUInt2006.MarenholzI,HeizmannCW,FritzG(2004).S100proteinsinmouseandman:fromevolutiontofunctionandpathology(includinganupdateofthenomenclature).Biochem.Biophys.Res.Commun.322(4):1111–22.所有引用的參考文獻(xiàn)以引用方式合并。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3