本發(fā)明涉及牛蒡子苷元蛋氨酸酯鹽酸鹽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著人類生活環(huán)境、生活水平和生活方式的變化以及醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，疾病譜發(fā)生了顯著的變化，一般性傳染病逐漸被控制，而惡性腫瘤則成為日益常見且嚴(yán)重威脅人類生命和生活質(zhì)量的主要疾病之一。目前在中國(guó)乃至全世界，癌癥已成了導(dǎo)致人類死亡的第二大原因。惡性腫瘤是機(jī)體自身細(xì)胞變得不受控制的增殖和擴(kuò)散的疾病，是一類細(xì)胞增殖、分化異常的疾病。因此，世界衛(wèi)生組織和各國(guó)政府衛(wèi)生部門都把攻克癌癥列為一項(xiàng)首要任務(wù)。

化療是一種全身治療的手段，無論采用什么途徑給藥（口服、靜脈和體腔給藥等），化療藥物都會(huì)隨著血液循環(huán)遍布全身的絕大部分器官和組織。因此，對(duì)一些有全身播撒傾向的腫瘤及已經(jīng)轉(zhuǎn)移的中晚期腫瘤，化療都是主要的治療手段?；熓腔瘜W(xué)藥物治療的簡(jiǎn)稱，這些化學(xué)藥物的抑瘤效果顯著，但其不僅會(huì)殺死癌細(xì)胞，對(duì)機(jī)體內(nèi)的正常細(xì)胞也會(huì)造成危害，影響身體各個(gè)器官的功能，對(duì)免疫系統(tǒng)也有極大的傷害。因此，一些抗癌效果好，毒副作用小的藥物正在逐漸被開發(fā)出來。

牛蒡子苷元，一種木脂內(nèi)酯化合物，是菊科植物牛蒡(Arctium Iappa L. )的干燥成熟果實(shí)牛蒡子的主要活性成分?，F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)公開了牛蒡子苷元用于抗腫瘤的用途，但其口服生物利用度低，嚴(yán)重制約了在臨床上的應(yīng)用。通過對(duì)牛蒡子苷元進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成其氨基酸衍生物，一方面可改善藥物的生物溶解度；另一方面，提高了藥物生物活性。

本發(fā)明提供的牛蒡子苷元蛋氨酸酯鹽酸鹽即為4-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氫呋喃甲基-2-甲氧基苯酚-2-氨基-4-甲硫基丁酸酯鹽酸鹽。

本發(fā)明屬于首次發(fā)現(xiàn)4-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氫呋喃甲基-2-甲氧基苯酚-2-氨基-4-甲硫基丁酸酯鹽酸鹽的抗腫瘤活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種4-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氫呋喃甲基-2-甲氧基苯酚-2-氨基-4-甲硫基丁酸酯鹽酸鹽，其結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明還提供了4-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氫呋喃甲基-2-甲氧基苯酚-2-氨基-4-甲硫基丁酸酯鹽酸鹽的合成方法。

本發(fā)明還提供了4-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氫呋喃甲基-2-甲氧基苯酚-2-氨基-4-甲硫基丁酸酯鹽酸鹽的抗腫瘤作用。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步的描述，然而，這些實(shí)施例不應(yīng)該作為對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。

實(shí)施例14-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氫呋喃甲基-2-甲氧基苯酚-2-氨基-4-甲硫基丁酸酯鹽酸鹽的合成。

稱取0.20g（0.54mmol）牛蒡子苷元、0.27g（1.08mmol）Boc-L-蛋氨酸、0.21g（1.08mmol）1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)、0.03g（0.27mmol）4-二甲氨基吡啶（DMAP）置于100ml旋瓶中，加入10ml乙腈溶液，冰水浴下攪拌溶解，再室溫反應(yīng)2小時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)至反應(yīng)完畢，減壓蒸去溶劑，得到淺黃色粘稠物。將粘稠物用YMC反相填料進(jìn)行柱層析分離，用乙腈/水(55:45)混合溶劑洗脫，收集所需組分，回收有機(jī)溶劑，冷凍干燥，得白色粉末狀化合物。將上述得到白色粉末狀化合物（按m:v=1:20）溶于乙酸乙酯，通入氯化氫氣體，冰水浴反應(yīng)，用裝有碳酸氫鈉溶液的燒杯處理尾氣，通氣時(shí)間為1-3h，TLC檢測(cè)至其完全反應(yīng)，回收乙酸乙酯得白色顆粒狀結(jié)晶，即化合物4-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氫呋喃甲基-2-甲氧基苯酚-2-氨基-4-甲硫基丁酸酯鹽酸鹽。

實(shí)施例2牛蒡子苷元及4-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氫呋喃甲基-2-甲氧基苯酚-2-氨基-4-甲硫基丁酸酯鹽酸鹽在水中的溶解度見表1。

由表1可以看出，牛蒡子苷元經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾后，其修飾產(chǎn)物4-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氫呋喃甲基-2-甲氧基苯酚-2-氨基-4-甲硫基丁酸酯鹽酸鹽水溶性大大增加，改善了牛蒡子苷元溶解度低的缺點(diǎn)，有助于提高生物利用度。

實(shí)施例34-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氫呋喃甲基-2-甲氧基苯酚-2-氨基-4-甲硫基丁酸酯鹽酸鹽對(duì)H22移植瘤小鼠的抑瘤作用和免疫功能的影響。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株

SPF級(jí)ICR小鼠（雄性），體重19-21g，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK（吉）-2011-0004，購自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。小鼠質(zhì)量檢測(cè)單位：吉林省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中心。

1.1.2藥品和試劑

牛蒡子苷元 提取分離制備

牛蒡子苷元蛋氨酸酯鹽酸鹽 合成制備

環(huán)磷酰胺(CTX) 上海華聯(lián)制藥有限公司

尿素氮(BUN)測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所

肌酐(Cr)測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所

腫瘤壞死因子-α( TNE-α)測(cè)試盒 上?；顦飞锟萍加邢薰?/p>

白細(xì)胞介素-2 ( IL-2 ) 測(cè)試盒 上海活樂生物科技有限公司

其他試劑均為分析純

1.1.3儀器

超凈工作臺(tái) 美國(guó)BEKMAN 公司

AL-104型電子分析天平梅特勒-托利多公司

SPECTRA MAX 190全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀美谷分子儀器（上海）有限公司

1.2方法

1.2.1 H22荷瘤小鼠腫瘤模型制備

從液氮中取出H22細(xì)胞凍存管，迅速浸入36℃～38℃水浴中，并不時(shí)搖動(dòng)，使凍存管內(nèi)細(xì)胞快速完全解凍（要在1分鐘內(nèi)）。解凍后用75%酒精擦拭凍存管外表面，去除封口膜，打開凍存管蓋，用吸管吸出細(xì)胞懸液，放于離心管中，補(bǔ)加生理鹽水10mL左右，用吸管輕輕吹打均勻懸浮細(xì)胞。低速離心5min（1000r/min），棄上清液。再重復(fù)上述方法洗滌細(xì)胞2次，加適量生理鹽水均勻懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×10⁷個(gè)/ml。吸取0.25ml細(xì)胞懸液注射到小鼠腹腔內(nèi)，連續(xù)傳兩代。

無菌條件下抽取H22腹水瘤小鼠的腹水，用無菌生理鹽水稀釋后，低速離心5min（1000r/min）。再用生理鹽水洗滌、離心兩次，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×10⁷個(gè)/ml。將小鼠右肩皮膚用75%酒精局部消毒，無菌操作接種0.25mL細(xì)胞懸液于右肩，構(gòu)建小鼠H22腫瘤模型。

1.2.2動(dòng)物分組及處理

75只SPF級(jí)ICR小鼠（雄性，體重19-21g）適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)取15只小鼠作為空白對(duì)照組，正常飼養(yǎng)。剩下60只小鼠右肩接種瘤細(xì)胞懸液，每只0.2 mL。接種次日，將各籠小鼠混勻，隨機(jī)分為模型組，環(huán)磷酰胺（CTX，25 mg/kg）陽性對(duì)照組，牛蒡子苷元（40mg/kg）組（A組），牛蒡子苷元蛋氨酸酯鹽酸鹽（40mg/kg）組（B組），每組15只。采用灌胃方式給藥，每日1次，模型組和空白對(duì)照組以等量的生理鹽水灌胃。各組動(dòng)物給藥連續(xù)給藥14d，最后一次給藥后禁食不禁水16h后斷頸處死，收集血液及組織。

1.2.3檢測(cè)小鼠H22肝癌皮下移植瘤的抑瘤率、免疫器官指數(shù)以及血清相關(guān)指標(biāo)

分別稱取小鼠體重、瘤重量，計(jì)算抑瘤率。分別稱取小鼠體重、瘤重量，計(jì)算抑瘤率。眼球取血后頸椎脫臼處死后，分離血清，按照試劑盒說明測(cè)定血清中尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）水平，并按照Elisa試劑盒說明書進(jìn)行操作測(cè)定肝癌小鼠血清中TNF-α、IL-2的水平。完整剝離瘤體、脾、胸腺，分別稱質(zhì)量，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

抑瘤率=(模型組瘤重量-藥物組瘤重量)/模型組瘤重量

免疫器官指數(shù)=免疫器官重量/體重。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示以x±s表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.01或P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1牛蒡子苷元蛋氨酸酯鹽酸鹽對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響

A、B兩組的H22移植瘤的生長(zhǎng)明顯受到抑制。如表2所示，與模型組相比，A、B兩組的瘤重有顯著減輕，差異極顯著(P＜0.01)。同CTX組相比，B組抑瘤效果無顯著差異（P>0.05）。同A組相比，B組差異極顯著(P＜0.01)，說明B、組抑瘤效果較A組好。CTX組、A組、B組的抑瘤率分別為72.06%，26.26%，55.87%。

2.2牛蒡子苷元蛋氨酸酯鹽酸鹽對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

如表3所示，模型組的胸腺、脾臟指數(shù)與空白組相比均有極顯著升高(P＜0.01)，說明模型組造模成功，數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于胸腺指數(shù)，與CTX組相比，A、B兩組均升高，且A組有顯著差異（P<0.05），B組有極顯著差異(P＜0.01)，說明A、B兩組對(duì)胸腺有一定的保護(hù)作用；與A組相比，B組升高，說明B組對(duì)胸腺的保護(hù)作用較A組好。對(duì)于脾臟指數(shù)，與CTX組相比，A、B兩組均升高，A組有極顯著差異(P＜0.01)，B組差異顯著（P<0.05），說明A、B兩組對(duì)脾有一定的保護(hù)作用；CTX組胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均顯著低于模型組和A、B兩組。說明CTX對(duì)機(jī)體的免疫器官有一定的抑制作用，而A、B兩組對(duì)機(jī)體免疫器官有一定的保護(hù)作用，且B組對(duì)免疫器官的保護(hù)作用比A組好。

2.3牛蒡子苷元蛋氨酸酯鹽酸鹽對(duì)小鼠血清相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

2.3.1牛蒡子苷元蛋氨酸酯鹽酸鹽對(duì)小鼠尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）水平的影響

CTX會(huì)使腎有較低的毒性。如表4所示，模型組的BUN和Cr水平均明顯高于空白組(P<0.01),說明H22肝癌瘤株給小鼠的腎功能造成了明顯的損傷。

對(duì)于BUN、Cr水平，與模型相比，A、B兩組均有降低，差異極顯著(P<0.01)；與CTX組相比，A、B兩組降低；與A組相比，B組有降低，說明B組降低BUN、Cr水平的能力較A組好。從對(duì)腎功能的影響來看，A、B兩組對(duì)小鼠的腎無明顯毒害作用，且能使小鼠已損傷的腎功能有所提高。

2.3.2牛蒡子苷元蛋氨酸酯鹽酸鹽對(duì)小鼠TNF-α、IL-2水平的影響

如表5所示，與空白組相比，模型組的TNF-α水平升高，IL-2水平降低，說明造模成功。

與模型組相比，CTX組和A、B兩組TNF-α水平均降低，且CTX組、A組差異極顯著(P<0.01)，B組差異顯著（P<0.05）；與CTX組相比，A、B兩組TNF-α水平均升高，差異極顯著(P<0.01)。CTX組的TNF-α水平明顯低于空白組,而A、B兩組的TNF-α水平雖然降低，但較接近空白組。與A組相比，B組TNF-α水平較高。

與模型組相比，CTX組IL-2水平下降，差異顯著（P<0.05）；與CTX組相比，A、B兩組均升高，B組差異顯著（P<0.05），且A、B兩組IL-2水平接近空白組。與A組相比，B組IL-2水平較高。

說明A、B兩組能使機(jī)體中異常升高的TNF-α水平相應(yīng)降低，異常降低的IL-2水平相應(yīng)升高，且B組的作用效果較A組好。

牛蒡子苷元蛋氨酸酯鹽酸鹽有很好的的抑瘤效果，同濃度的牛蒡子苷元蛋氨酸酯鹽酸鹽抗腫瘤作用明顯好于牛蒡子苷元。同時(shí)，牛蒡子苷元蛋氨酸酯鹽酸鹽在一定程度上可以保護(hù)肝癌小鼠機(jī)體的免疫器官，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。該結(jié)果為新藥的開發(fā)提供了依據(jù)，也為牛蒡子苷元蛋氨酸酯鹽酸鹽的深入開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。