本發(fā)明涉及神經(jīng)藥理學和化學制藥領域，尤其涉及單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白及其在制備藥物載體和制備預防和治療阿爾茨海默病藥物中的應用。

背景技術：

阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是發(fā)生在老年人群中最常見的以進行性癡呆為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。臨床表現(xiàn)為認知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力進行性減退，伴有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。目前AD在老年人群中的發(fā)病率僅次于心血管病、癌癥和腦卒中，已成為排名第四位的致死病因。隨著人口老齡化進程的加劇，該類疾病的發(fā)病率日益上升?！妒澜绨柎暮Ｄ蟾妗分赋?，癡呆患者人數(shù)預計每20年增長近一倍，將由2010年的3600萬增至2050年的1.15億，且58％的患者居住于中低收入國家，到2050年，這一數(shù)字將增至71％；報告稱，每年癡呆相關費用總計6040億美元，約為全球國內(nèi)生產(chǎn)總值(GDP)的1％。AD已成為人類健康和生存質(zhì)量的嚴重威脅，是日益嚴重的公共衛(wèi)生問題和經(jīng)濟問題。

目前臨床上使用的AD治療藥物本質(zhì)上為對癥治療，包括乙酰膽堿酯酶(AchE)抑制劑他克林、多奈哌齊、利斯的明、加蘭他敏和谷氨酸NMDA受體拮抗劑美金剛，僅能短期內(nèi)改善膽堿能缺失導致的學習、記憶功能下降，但不能改變AD的病理進程。因此，亟需尋找和建立具有AD疾病修飾作用的新型防治方法。

老年斑和神經(jīng)元纖維纏結是的重要病理特征。老年斑的主要組成物質(zhì)是β-淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)，而神經(jīng)元纖維纏結主要由過度磷酸化的Tau蛋白組成。Aβ是由39～43個氨基酸組成的多肽，Aβ_1-40和Aβ_1-42是其兩種主要類型，來源于淀粉樣前體蛋白(APP)。Aβ，尤其是Aβ_1-42具有高度聚集能力，經(jīng)神經(jīng)元產(chǎn)生分泌后，會迅速聚集，形成可溶狀態(tài)的寡聚體，而后進一步聚集形成Aβ纖維而沉積在腦內(nèi)。當前的研究明確Aβ是AD的核心致病物質(zhì)，其中Aβ寡聚體的神經(jīng)毒性最強。Aβ在腦內(nèi)過度產(chǎn)生和沉積，引起其周邊神經(jīng)元突觸功能障礙、Tau蛋白過度磷酸化、氧化應激和繼發(fā)炎性反應，導致神經(jīng)元變性死亡，最終導致認知功能障礙。這就是目前廣泛接受的AD病因假說——Aβ級聯(lián)假說(amyloidβ-cascade hypothesis)。由此，Aβ及其聚集體特別是寡聚體成為AD最重要的疾病生物標記物，而如何降低腦內(nèi)Aβ水平也成為防治AD的重點。

Aβ的沉積是由于Aβ的產(chǎn)生—清除平衡被破壞所致，因此減少產(chǎn)生和促進清除是降低腦內(nèi)Aβ水平的關鍵手段。自20世紀90年代開始，首先探討的是通過抑制Aβ產(chǎn)生的關鍵酶(β分泌酶和γ分泌酶)活性來減少Aβ的產(chǎn)生。但是，由于β分泌酶和γ分泌酶同時參與眾多底物的代謝過程，簡單地抑制其活性會因干擾神經(jīng)元的正常生理功能而產(chǎn)生嚴重不良反應。γ分泌酶抑制劑(包括禮來的semagacestat和施貴寶的avagacestat)在臨床試驗中相繼失敗，使得APP代謝調(diào)節(jié)劑的研發(fā)熱情跌至冰點。

占AD患者發(fā)病率90％-95％的是遲發(fā)型病人。這些病人腦內(nèi)Aβ產(chǎn)生速度與正常人相同，而Aβ清除速率明顯低于正常對照。由此，加快腦內(nèi)Aβ清除成為AD防治最重要的方向。目前針對Aβ的清除策略研究最多的主要為被動免疫治療法。被動免疫采用與Aβ有著特異性，高親和力的抗體，通過抗體包含的Fc片段介導抗體與Aβ結合的復合物被巨噬細胞攝取而清除。然而，被動免疫治療本身存在一些重要的問題：(1)Aβ-抗體免疫復合物誘發(fā)的不良反應：Aβ作為自身抗原，與進入腦內(nèi)的抗體形成免疫復合物后，將可能誘發(fā)繼發(fā)免疫反應而導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和血管壁的損傷，引起腦內(nèi)炎癥、腦微血管出血和血管源性腦水腫等不良反應；(2)目前有效的抗體都是針對Aβ氨基端的特異性抗體，由于Aβ氨基端的序列位于Aβ前體蛋白(APP)的胞外段，因此這些抗Aβ氨基端的抗體也會與神經(jīng)元的APP結合而導致正常神經(jīng)元遭到免疫攻擊。同時，包括bapineuzumab等Aβ抗體臨床試驗的失敗表明，盡管Aβ抗體能有效清除Aβ，但對于改善AD患者的認知功能作用較差?？赡艿脑蛟谟贏β聚集引發(fā)的繼發(fā)性病理過程例如神經(jīng)突觸功能障礙和神經(jīng)元丟失等，一旦被觸發(fā)，便可獨立于Aβ而加重AD的病理進程；而臨床上，當AD患者出現(xiàn)疾病癥狀時，其神經(jīng)系統(tǒng)功能已經(jīng)受到不可逆性損傷，此時如果只注重于Aβ的清除，也難以改善AD患者的病理表現(xiàn)。因此，亟需探索既具有促進Aβ清除，同時又能保護神經(jīng)元或者抑制其他繼發(fā)性病理過程發(fā)展的AD多模式治療策略。

納米載體被應用于開發(fā)針對腫瘤和獲得性免疫缺陷癥等疾病的多模式治療策略。對于AD的多模式治療方法，納米載體需要有較高的血腦屏障(brain-blood barrier,BBB)穿透性，或者借由繞開血腦屏障的遞藥方式，和與Aβ的高親和力以實現(xiàn)靶向遞藥。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種提高重組脂蛋白與Aβ的親和力，提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重組脂蛋白和藥物的濃度，促進Aβ清除的同時保護神經(jīng)元的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)修飾的重組脂蛋白。

本發(fā)明的第二個目的在于提供單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾的重組脂蛋白在制備藥物載體中的應用。

本發(fā)明的第三個目的在于提供單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾的重組脂蛋白在制備治療或預防Aβ沉積有關的疾病的藥物中的應用。

為實現(xiàn)以上第一個目的，本發(fā)明公開以下技術方案：一種單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾的重組脂蛋白，其特征在于，所述重組脂蛋白由單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂、脂質(zhì)和載脂蛋白構成，所述單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂占總脂質(zhì)摩爾數(shù)的1％-30％。

作為一個優(yōu)選方案，所述單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂占總脂質(zhì)摩爾數(shù)的1％-20％，更優(yōu)選1％-18％，1-15％，1-10％，2％-25％，2％-20％，2％-18％，2％-15％，3％-25％，3％-20％，3％-18％，3％-15％，4％-25％，4％-20％，5％-20％。

作為一個優(yōu)選方案，所述載脂蛋白質(zhì)量占處方含量的1-60％。

作為一個優(yōu)選方案，所述載脂蛋白質(zhì)量占處方含量的1-50％。

作為一個優(yōu)選方案，所述載脂蛋白質(zhì)量占處方含量的1-40％，1-30％，1-25％，1-20％，優(yōu)選2-60％，3-60％，4-60％，5-60％，優(yōu)選2-50％，3-50％，4-50％，5-50％，更優(yōu)選2-40％，3-40％，4-30％，5-30％，2-25％，3-25％，4-25％，5-30％，5-25％，5-20％，1-4％。

作為一個優(yōu)選方案，所述脂質(zhì)是蛋磷脂、豆磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、心磷脂、溶血磷脂、鞘氨醇、神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、腦苷脂、膽固醇、膽固醇酯、甘油酯及其衍生物中的一種或多種。

作為一個優(yōu)選方案，所述脂質(zhì)不包含膽固醇或膽固醇酯。

作為一個優(yōu)選方案，所述載脂蛋白是ApoE及其模擬肽、ApoA-I及其模擬肽、ApoA-II及其模擬肽、ApoC及其模擬肽中的一種或多種。尤其優(yōu)選ApoE及其模擬肽中的一種或多種，ApoE包括ApoE2，ApoE3和ApoE4。

所述單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白的粒徑范圍為1-500nm，優(yōu)選5-100nm。

所述重組脂蛋白的制備方法采用薄膜水化法、注入法、復乳法、熔融法、冷凍干燥法、逆向蒸發(fā)法、高壓乳勻法或超聲法及Ca²⁺融合法。

為實現(xiàn)本發(fā)明第二個目的，本發(fā)明公開以下技術方案：單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾的重組脂蛋白在制備藥物載體中的應用。所述的藥物可以是治療任何疾病的藥物，包括小分子化學藥物，大分子多肽、蛋白、基因藥物中的一種或者多種。所述的基因藥物包含核酸類藥物，如核酸、核苷酸、核苷和堿基及其衍生物和類似物等，包括siRNA、microRNA或反義核酸等。

作為一個優(yōu)選方案，所述藥物載體是指經(jīng)鼻腔給藥的載體。鼻腔給藥制劑輔料包含水、氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、磷酸鈉、四硼酸鈉、醋酸鈉、碳酸氫鈉、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙甲纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚卡波非、明膠、海藻酸、聚乙烯酸、聚氧化乙烯、硫酸軟骨素鈉、透明質(zhì)酸鈉、殼聚糖、亞硫酸氫鈉、硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、苯扎氯銨、氯丁醇、硫柳汞、醋酸苯汞、硝酸苯汞、對羥基苯甲酸甲酯、苯乙醇、甘露醇、葡萄糖、甘油、木糖醇中的一種或者幾種。

作為一個優(yōu)選方案，所述藥物是指治療或預防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，比如治療或預防阿爾茨海默病的藥物。

為實現(xiàn)本發(fā)明第三個目的，本發(fā)明公開以下技術方案：單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾的重組脂蛋白在制備治療或預防Aβ沉積有關的疾病的藥物中的應用。

作為一個優(yōu)選方案，所述Aβ沉積有關的疾病是指阿爾茨海默病。

作為一個優(yōu)選方案，所述藥物是指經(jīng)鼻腔給藥的藥物。

本發(fā)明所指的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白，其中脂質(zhì)是指除GM1外的其他脂質(zhì)，總脂質(zhì)是指包括GM1在內(nèi)的所有脂質(zhì)。

本發(fā)明所指的Aβ沉積有關的疾病是指阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、克羅伊茨費爾特-雅各布病和糖尿病、腦中風等疾病引起Aβ沉積并導致的認知障礙。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1)本發(fā)明首次提出采用單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白，并給出具有優(yōu)良效果的各組分含量。

2)GM1修飾的重組脂蛋白與未修飾的重組脂蛋白相比，與Aβ的親和力明顯增加，對AD的治療效果也增加。

3)GM1修飾的重組脂蛋白同時也具有載藥特性，能夠?qū)⑺幬镙d帶到單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白上，起到治療多種疾病，特別是Aβ沉積有關的疾病或者中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用。

4)特別是GM1修飾的重組脂蛋白與未修飾的重組脂蛋白相比，鼻腔給藥時具有更高的鼻粘膜吸收效率和腦內(nèi)遞釋特性。

5)GM1使重組脂蛋白更為穩(wěn)定，不易聚集；在脂質(zhì)中可以不添加膽固醇，卻能實現(xiàn)比常規(guī)添加膽固醇同等甚至更好的效果，這樣的改進可避免膽固醇在體內(nèi)酯化引起的重組脂蛋白載藥泄漏和腦內(nèi)過量遞送膽固醇可能產(chǎn)生不良反應等缺點。

6)更為重要的是，合適含量的GM1可以使載脂蛋白ApoE在總處方中的用量顯著下降，并維持或增強載藥、Aβ親和力和治療等效果。

附圖說明

圖1為(A)未修飾單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的重組脂蛋白；(B)單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾的重組脂蛋白的透射電鏡照片，標尺：20nm。

圖2為(A)重組脂蛋白與Aβ_1-42單體的結合曲線；(B)重組脂蛋白與Aβ_1-42寡聚體的結合曲線；(C)單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白與Aβ_1-42單體的結合曲線；(D)單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白與Aβ_1-42寡聚體的結合曲線。

圖3為在原代小膠質(zhì)細胞上重組脂蛋白和單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白對(A)Aβ_1-42攝取情況，(B)Aβ_1-42降解情況和(C)重組脂蛋白和單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白與Aβ_1-42的共定位情況。^*p<0.05,^**p<0.01,^****p<0.0001與重組脂蛋白存在顯著性差異。

圖4為16HBE細胞系對單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白的細胞攝取情況。

圖5為在小鼠腦注射Aβ模型上研究對比重組脂蛋白和單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白經(jīng)鼻給藥對Aβ腦內(nèi)清除的作用：(A)小鼠腦內(nèi)由游離的Aβ_1-42量(即被降解的Aβ_1-42量)占總注射量的百分比表示；(B)腦注射10min和30min后，小鼠腦內(nèi)經(jīng)血腦屏障向外周清除的Aβ_1-42量，表示為腦外排指數(shù)。n＝3-5，*p<0.05,**p<0.01，與對照組存在顯著性差異。

圖6為在小鼠腦注射Aβ模型上研究對比重組脂蛋白和單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白靜脈注射對Aβ腦內(nèi)降解的作用，以小鼠腦內(nèi)由游離的Aβ_1-42量(即被降解的Aβ_1-42量)占總注射量的百分比表示。

圖7為載NAP單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白的神經(jīng)保護作用。原代神經(jīng)元與Aβ_1-42寡聚體以及NAP融合肽溶液，載NAP單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白，單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白或培養(yǎng)液(空白對照)共孵育48h?？疾焐窠?jīng)元細胞數(shù)量(A)、平均神經(jīng)突起長度(B)以及平均分支點數(shù)量(C)。^*p<0.05,^**p<0.01,^***p<0.001，^****p<0.0001，與Aβ_1-42對照組存在顯著性差異。

圖8為注射給藥2周，Morris水迷宮實驗考察重組脂蛋白，單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白和載NAP單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白對AD模型小鼠潛伏期的影響，^*p<0.05,^***p<0.001表明與空白對照組存在顯著性差異；^#p<0.05，表明與單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白組存在顯著性差異。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1.單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾提高重組脂蛋白的單分散性

(1)制備

占總脂質(zhì)摩爾百分比5％、10％、20％的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂摻入到占總脂質(zhì)摩爾百分比95％、90％、80％的二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿中，加氯仿溶解，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，脂膜加pH7.4磷酸鹽緩沖液水化，超聲均質(zhì)得到單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾的脂質(zhì)體(脂質(zhì)總質(zhì)量4mg)。加入0.8mg的ApoE，輕輕混勻，置于震蕩搖床于100rpm 37℃孵育36h，得到單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白。

(2)表征

激光粒度儀測定粒徑和zeta電位，結果顯示，未孵育ApoE的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾脂質(zhì)體粒徑為55.17±5.11nm，經(jīng)過ApoE孵育形成單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白(單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷占總脂質(zhì)摩爾百分比5％、10％和20％)，粒徑均減小為25nm以下，zeta電勢為-14.20±0.66mV、-20.20±0.36mV和-26.41±0.42mV；而未加單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾的重組脂蛋白粒徑為24.64±3.59nm，zeta電勢為-8.06±0.78mV。

磷鎢酸負染，透射電鏡觀察形態(tài)，結果顯示(圖1)，未加單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾的重組脂蛋白粒徑在20nm左右，部分堆疊形成蠶蛹狀；而單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾的重組脂蛋白粒徑同樣也在20nm左右，但分散性更好，未觀察到多個堆疊的現(xiàn)象。分析原因可能是單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾的重組脂蛋白表面zeta電勢更負，粒子間因靜電排斥，更不容易聚集，單分散性更好。

實施例2.單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾提高重組脂蛋白對的Aβ親合力

(1)制備

占總脂質(zhì)摩爾百分比5％、10％、20％的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂摻入到占總脂質(zhì)摩爾百分比95％、90％、80％的二棕櫚酰磷脂酰膽堿中(脂質(zhì)總質(zhì)量4mg)，ApoE 0.8mg，同實施例1制備單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白。

占總脂質(zhì)摩爾百分比5％的心磷脂摻入到占總脂質(zhì)摩爾百分比95％的二棕櫚酰磷脂酰膽堿中(總脂質(zhì)質(zhì)量4mg)，ApoE 0.8mg，同上制備心磷脂修飾重組脂蛋白。

占總脂質(zhì)摩爾百分比10％硫苷脂摻入到占總脂質(zhì)摩爾百分比90％的二棕櫚酰磷脂酰膽堿中(總脂質(zhì)質(zhì)量4mg)，ApoE 0.8mg，同上制備硫苷脂修飾重組脂蛋白。

(2)表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)實驗驗證單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白的Aβ親合特性。

CM5芯片采用氨基偶聯(lián)的方式將Aβ單體或者寡聚體固定：在用0.2M EDC和0.05M NHS對芯片表面進行活化后，將Aβ單體或者寡聚體稀釋于pH4.0醋酸鈉緩沖溶液中，使Aβ濃度為23μM，以30μl/min的速度注入420s，再用pH 8.5的乙醇胺進行封閉。參比通道活化后直接用乙醇胺封閉。親和力測試采用雙信道模式檢測：重組脂蛋白稀釋于pH 7.4 10mM PBS中，以30μl/min的速度注入到參比通道以及固定了Aβ的通道。接觸時間為100s或300s，解離時間為400s。結果用Biacore T200Evaluation Softeware程序進行分析，運用1:1結合模型計算親和力值。結果顯示，占總脂質(zhì)摩爾百分比5％、10％、20％的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾的重組脂蛋白與Aβ_1-42單體(monomer)、寡聚體(oligomer)均呈高親和力結合(圖2)，動態(tài)法計算占總脂質(zhì)摩爾百分比5％的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾的重組脂蛋白與Aβ_1-42單體、寡聚體的親和力常數(shù)KD值，分別為(1.7±1.90)×10^-10和(1.51±0.02)×10^-10M，比未修飾重組脂蛋白與Aβ_1-42單體、寡聚體的親和力(親和力常數(shù)KD值(9.97±2.81)×10^-9和(9.47±4.37)×10^-9)分別提高了58和62倍，表明單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的修飾提高了重組脂蛋白與Aβ親和特性。

而同時檢測未孵育ApoE的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾脂質(zhì)體和ApoE蛋白自身與Aβ_1-42的單體、寡聚體的親和力，結果顯示，未孵育ApoE的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾脂質(zhì)體與Aβ_1-42的單體以及寡聚體的親和常數(shù)分別為1.50×10^-8M以及4.04×10^-8M；ApoE蛋白與Aβ_1-42單體的親和常數(shù)為2.95×10^-8M，而與Aβ_1-42寡聚體的結合的信號太弱難以計算。同法制備的5％心磷脂修飾重組脂蛋白與Aβ_1-42的單體以及寡聚體的親和常數(shù)分別為(14.96±2.51)×10^-9和(6.06±4.66)×10^-9M；同法制備的10％硫苷脂修飾重組脂蛋白與Aβ_1-42的單體以及寡聚體的親和常數(shù)分別為68.26×10^-9×10^-9和(18.15±7.34)×10^-9M。上述結果表明單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的修飾特異提高了重組脂蛋白對Aβ的親和力。

表1 不同重組脂蛋白與Aβ的親和力的比較

實施例3.單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾提高重組脂蛋白介導的小膠質(zhì)細胞對Aβ的攝取和降解

(1)制備

占總脂質(zhì)摩爾百分比5％的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂摻入到占總脂質(zhì)摩爾百分比95％的磷脂酰膽堿和磷脂酸混合物中(脂質(zhì)總質(zhì)量4mg)，ApoE 0.4mg，同實施例1制備單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白。

(2)單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白促進原代小膠質(zhì)細胞對Aβ的攝取

將FAM熒光標記的Aβ_1-42加入至種植有小膠質(zhì)細胞的96孔板中，分別將重組脂蛋白、單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白用DMEM稀釋加入至種植有原代小膠質(zhì)細胞的96孔板中，至終濃度0、0.01、0.05、0.5和2μg/mL，F(xiàn)AM熒光標記Aβ_1-42終濃度為2μg/mL。于37℃細胞培養(yǎng)箱中共孵育4h。之后3.7％甲醛于37℃固定10min，Hoechst染核8min，PBS洗3遍后，用高內(nèi)涵的TargetActivation程序進行拍攝以及定量分析。結果如圖3A所示，單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白顯著提高了原代小膠質(zhì)細胞對FAM熒光標記Aβ_1-42的攝取。

(3)ELISA法考察單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白對原代小膠質(zhì)細胞降解Aβ的影響

以DMEM稀釋Aβ_1-42至4μg/ml，加入至種植有小膠質(zhì)細胞的24孔板中，再加入用DMEM稀釋的重組脂蛋白、單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白至終濃度為0、1、10、100μg/mL，Aβ_1-42的終濃度為2μg/ml。37℃孵育4h后，裂解刮取細胞，進行后續(xù)檢測或-80℃保存。

取儲存于-80℃的1mg/ml人Aβ_1-42標準儲備液，以稀釋緩沖液稀釋至0，6.25，12.5，25，50，100，200pg/ml作為標準曲線。樣品以稀釋緩沖液稀釋80倍。按照ELISA產(chǎn)品說明書進行實驗和結果測定并BCA法檢測蛋白總濃度測定細胞裂解液中的蛋白總量。結果表示為細胞裂解液中的Aβ_1-42濃度與蛋白總濃度的比值。結果如圖3B所示，結果表明重組脂蛋白經(jīng)單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾后，可濃度依賴性增加原代小膠質(zhì)細胞對Aβ_1-42的降解，同時GM1的加入使ApoE的含量可以明顯降低。

實施例4.單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白在體外鼻粘膜細胞模型中的攝取情況

以16HBE細胞系為體外鼻粘膜細胞模型，考察單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白的細胞攝取情況。

(1)制備

同實施例1制備單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾的重組脂蛋白。

(2)16HBE細胞系對單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白的細胞攝取情況。

16HBE接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后可進行實驗。用DMEM稀釋制劑溶液至50、100、250、500和800μg/ml，加入至上述96孔板中，于37℃孵育4h。孵育結束后，3.7％甲醛固定，PBS洗后用Hoechst染核，用高內(nèi)涵進行定量分析。結果表明占總脂質(zhì)摩爾百分比5％的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾的重組脂蛋白的細胞攝取量與未修飾重組脂蛋白相當(圖4)。

實施例5.單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白經(jīng)鼻腔給藥的腦內(nèi)遞送效率

同實施例1制備單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾程度從占脂質(zhì)摩爾百分比5％升高至10％、20％、30％、40％的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾的重組脂蛋白。

采用Bolton-Hunter法將¹²⁵I標記于單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白上。ICR小鼠鼻腔給藥，結果顯示，脂質(zhì)摩爾百分比占5％的¹²⁵I標記單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白在皮層和海馬中的制劑達峰濃度濃度(C_max)為0.0434％ID/g，高出¹²⁵I標記的未修飾重組脂蛋白75％，AUC_all為0.2956％ID/g·h，高出未修飾重組脂蛋白85％；在血中的AUC_all為9.8650％ID/g·h，高出未修飾重組脂蛋白80％。而兩種制劑的AUC_{Cortex+Hippocampus}/AUC_blood相近，提示單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白比未修飾重組脂蛋白具有更高的鼻粘膜吸收效率。然而隨著單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾程度從5％升高至10％、20％、30％、40％，其制劑的腦內(nèi)遞釋特性沒有明顯升高，反而有一定下降趨勢，脂質(zhì)摩爾百分比占20％的¹²⁵I標記單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組高密度脂蛋白的腦內(nèi)分布量略高于未修飾重組高密度脂蛋白(升高25.9％)，脂質(zhì)摩爾百分比占30％的¹²⁵I標記單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組高密度脂蛋白的腦內(nèi)分布量與未修飾重組高密度脂蛋白相當(102.3％)，而脂質(zhì)摩爾百分比占40％的¹²⁵I標記單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組高密度脂蛋白的腦內(nèi)分布量低于未修飾重組高密度脂蛋白(87.2％)。

表2.未修飾重組脂蛋白、單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾的重組脂蛋白經(jīng)鼻給藥后在小鼠體內(nèi)的藥動學參數(shù)。

實施例6.單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白促進Aβ在小鼠腦內(nèi)的清除

(1)制備

占總脂質(zhì)摩爾百分比5％的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂摻入到占總脂質(zhì)摩爾百分比95％的磷脂酰膽堿和磷脂酰膽堿混合物中(脂質(zhì)總質(zhì)量4mg)，ApoE0.8mg，同實施例1制備單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白。

(2)采用小鼠腦注射Aβ模型研究單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白對Aβ腦內(nèi)清除的作用

ICR小鼠隨機分為3組，每組分別鼻腔或靜脈注射給予重組脂蛋白、單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白，對照組給予PBS。給藥30min后進行腦定位注射：將¹²⁵I標記Aβ_1-42以及含有¹⁴C的菊粉([¹⁴C]inulin)混合，用人工腦脊液稀釋，精確定位注射入小鼠海馬區(qū)。分別于腦定位注射10min以及30min后處死小鼠，取小鼠大腦進行檢測。其中一半腦組織稱重后于γ計數(shù)儀上檢測¹²⁵I標記Aβ_1-42的放射量，之后加入3倍體積的10％三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)沉淀組織，離心后去除上清，檢測未被降解的¹²⁵I標記Aβ_1-42的放射量。圖5A表明單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白鼻腔給藥在短時間內(nèi)顯著促進了Aβ_1-42的腦內(nèi)降解；圖5B表示鼻腔給藥單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白顯著促進小鼠腦內(nèi)Aβ_1-42跨血腦屏障向外周清除。相比之下，單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白靜脈注射短時間(5min)內(nèi)對Aβ_1-42的腦內(nèi)降解無明顯促進作用，而未修飾重組高密度脂蛋白對Aβ_1-42的腦內(nèi)降解有一定促進作用(圖6),推測可能是單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白靜脈注射入腦量在短時間內(nèi)不及未修飾重組高密度脂蛋白所致，需要較長時間(30min)才能起到降解促進作用。而經(jīng)鼻給藥的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白短時間內(nèi)即可增加Aβ_1-42降解并促進腦內(nèi)Aβ_1-42跨血腦屏障向外周清除。

實施例7.載藥單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白的神經(jīng)保護作用

(1)制備

占總脂質(zhì)摩爾百分比5％、10％、20％的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂摻入到占總脂質(zhì)摩爾百分比95％、90％、80％的二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿中，加氯仿溶解，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，脂膜加pH7.4磷酸鹽緩沖液水化，超聲均質(zhì)得到單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾的脂質(zhì)體(脂質(zhì)總質(zhì)量4mg)。加入0.05-1mg的NAP融合肽，4℃孵育過夜，再加入0.5-5mg ApoE3，繼續(xù)超聲50min。產(chǎn)品冷卻至室溫，孵育過夜，制備載NAP的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白。

(2)載NAP單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白的神經(jīng)保護作用

Aβ_1-42寡聚體用神經(jīng)元培養(yǎng)液稀釋至20μM，加入到種植有原代神經(jīng)元的96孔板中，再加入NAP融合肽溶液、載NAP單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白或單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白，Aβ_1-42寡聚體的終濃度為10μM，空白對照組只加入神經(jīng)元培養(yǎng)液。于37℃共孵育48h后，用含有3.7％甲醛的PBS固定細胞，加入TritonX-100透膜15min，用含有1％BSA的PBS在37℃封閉30min，加入MAP2抗體4℃孵育過夜，加入Alexa Fluor488熒光二抗，于37℃孵育1h，Hoechst染核。用高內(nèi)涵對原代神經(jīng)元細胞進行檢測，并用NeuroProfiling程序進行分析。結果如圖7A-7C所示，載NAP單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白顯著逆轉(zhuǎn)了Aβ_1-42寡聚體誘導的神經(jīng)毒性，體現(xiàn)在神經(jīng)元數(shù)量、平均神經(jīng)突起長度以及平均分支點數(shù)量的提高。

實施例8.載BACE-siRNA的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白減少SH-SY5Y細胞β分泌酶表達

同實施例1制備單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白，BACE-siRNA連接膽固醇，插入脂膜中。SH-SY5Y細胞培養(yǎng)至80％匯合度，以siRNA濃度為1μM轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染48h后，Western blot檢測細胞β分泌酶表達，Image J軟件統(tǒng)計計算條帶灰度值。結果顯示，載BACE-siRNA的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白轉(zhuǎn)染使SH-SY5Y細胞β分泌酶表達下降40％。

實施例9.載姜黃素的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白減輕Cu²⁺-Aβ復合物引起的小膠質(zhì)細胞炎癥

姜黃素和脂質(zhì)溶于一定比例氯仿-甲醇混合溶劑中，同實施例1方法制備單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白。Cu²⁺-Aβ以1∶1摩爾比例37℃孵育24h制備復合物。原代小膠質(zhì)細胞加入5μM的Cu²⁺-Aβ復合物孵育24h，TNF-α含量提高100％，而加入Cu²⁺-Aβ復合物和載姜黃素的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白同時孵育的原代小膠質(zhì)細胞TNF-α含量與未處理組相當，表明載姜黃素的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白有效減輕了Cu²⁺-Aβ復合物引起的小膠質(zhì)細胞炎癥。

實施例10.單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白與載帶藥物協(xié)同改善AD模型動物的空間學習記憶能力

(1)制備

同實施例7制備載NAP的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白。

(2)單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白與載帶藥物協(xié)同改善AD模型動物的空間學習記憶能力

采用Morris水迷宮實驗考察單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白和載NAP單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白對AD模型動物的空間學習記憶能力的改善作用。AD模型小鼠隨機分組，每組7-8只，按如下方式進行鼻腔給藥：空白對照組和AD模型組：給予PBS溶液，10μl/只/天；AD模型組：給予PBS溶液，10μl/只/天；藥物溶液組：給與NAP融合肽溶液組，24μg/kg/天；重組脂蛋白組：給予重組脂蛋白溶液，5mg/kg/天(脂質(zhì)濃度)；單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白組：給予單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白溶液，5mg/kg/天(脂質(zhì)濃度)；載藥單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白組：給予載NAP單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白組溶液，即5mg/kg/天(脂質(zhì)濃度)。每天連續(xù)鼻腔給藥至14天。

Morris水迷宮，水池直徑120cm，高50cm，水深25cm，水溫22±1℃。沿水池圓周等分為四個入水點，它們的連接線將圓形水池等分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共4個象限區(qū)域，在Ⅰ象限中心放置一個9cm黑色平臺。平臺低于水面約1cm。水池底、平臺及四壁均以食用染料涂成黑色使平臺不可見。采用Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)2.0監(jiān)測并記錄小鼠的游泳軌跡。定位航行試驗(Hidden platform test)：用于訓練和測量小鼠的空間學習能力,與小鼠連續(xù)給藥4周后休息2天開始，歷時5天。將平臺固定于Ⅰ象限中央，按照隨機的原則分別從Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的入水點將小鼠面向池壁放入水中，計算機監(jiān)測并記錄小鼠從入水開始尋找至找到并爬上黑色平臺的路線、所需時間(潛伏期)及游泳速度等。如果小鼠60s內(nèi)未找到平臺，需將其引領到平臺，并停留30s,這時潛伏期記為60s。每天訓練4次/只，每次訓練間隔30s。

結果如圖8所示，藥物溶液組和重組脂蛋白在5天的訓練過程中，潛伏期未呈現(xiàn)出顯著性的下降。單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白在第5天的訓練中潛伏期顯著低于AD模型組，表明單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白對AD模型小鼠的學習記憶能力有一定改善作用。經(jīng)過14天鼻腔給予載NAP單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白，AD模型小鼠在空間探索實驗中的潛伏期在第3天開始表現(xiàn)出了下降的趨勢，在第5天的訓練中，相較于AD模型組，潛伏期顯著縮短(33.9±2.1s)，并且相比于未載藥的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白，潛伏期縮短了12％。表明載藥單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白可能通過單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白和神經(jīng)保護肽的多模式作用進一步增強對AD的疾病修飾作用。

實施例11.單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾可在降低重組脂蛋白中載脂蛋白含量情況下保持對Aβ的高親和力

占總脂質(zhì)摩爾百分比10％的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂摻入到占總脂質(zhì)摩爾百分比90％的二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(4mg)中，加入占脂質(zhì)質(zhì)量2.5％、5％、10％或20％(0.1、0.2、0.4、0.8mg)的ApoE3，同上制備單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白。表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)實驗檢測單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白的Aβ親合特性，發(fā)現(xiàn)加入占脂質(zhì)質(zhì)量2.5％、5％、10％、20％的ApoE3的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白對Aβ的親和力常數(shù)分別為0.19×10^-9M、0.64×10^-9M、0.80×10^-9M和0.52×10^-9M，表明在單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂摻入情況下，載脂蛋白比例即使大大降低，依然能保持或增強重組脂蛋白對Aβ的親合特性。

實施例12.單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾提高重組脂蛋白介導的Aβ多肽疫苗的腦內(nèi)遞送

同上制備單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白，加入¹²⁵I標記的Aβ多肽疫苗共孵育5min?；旌衔镬o脈注射，注射后1h后取腦，γ計數(shù)器檢測腦內(nèi)¹²⁵I標記的Aβ多肽疫苗的放射性強度。結果顯示，與Aβ多肽疫苗單獨注射相比，單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白共孵育將Aβ多肽疫苗的入腦量提高76.47％，而未修飾重組脂蛋白共孵育僅將Aβ多肽疫苗的入腦量提高11.44％。該結果表明，僅通過簡單共孵育，單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂修飾重組脂蛋白即可有效提高本身具有腦內(nèi)轉(zhuǎn)運特性的多肽藥物的入腦量，提示其對其他難以入腦的藥物可能具有更強的腦內(nèi)遞送促進作用。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。