本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種無(wú)穩(wěn)定劑及制備過程無(wú)有機(jī)溶劑的喜樹堿類藥物的納米晶、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

喜樹堿類藥物包括喜樹堿、10-羥基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿、9-硝基喜樹堿等，均為難溶性藥物，均具有內(nèi)酯環(huán)和較好的抗腫瘤活性，其中10-羥基喜樹堿(10-HCPT)臨床應(yīng)用最為廣泛。

喜樹堿類藥物是從中國(guó)喜樹中提取的具備抗癌作用的微量生物堿及其衍生物，屬于細(xì)胞周期特異性藥物，主要作用于DNA合成期(S-期)。HCPT為拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topo I)特異性抑制劑，通過抑制DNA超螺旋結(jié)構(gòu)松弛過程中的再連接步驟，導(dǎo)致單鏈和雙鏈DNA斷裂，觸發(fā)細(xì)胞死亡。臨床主要用于原發(fā)性肝癌、胃癌、頭頸部癌、腺原性上皮癌、白血病、膀胱癌等惡性腫瘤的放化療；毒性反應(yīng)主要表現(xiàn)在泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及造血功能的抑制等，但其毒性明顯低于喜樹堿，特別是泌尿系統(tǒng)反應(yīng)少，臨床上易被接受。

目前，以羥基喜樹堿為代表的喜樹堿類藥物主要以注射液在臨床上的應(yīng)用，注射液在臨床應(yīng)用上存在的主要問題有：(1)半衰期短(靜脈注射分布半衰期(t1/2a)為4.5min，消除半衰期(t1/2β)為29min)，需反復(fù)給藥或延長(zhǎng)療程，導(dǎo)致劑量限制性毒性-骨髓抑制和消化道毒性也隨之增加。(2)靜脈給藥后主要分布于膽囊，而癌癥常發(fā)組織器官如肝、肺、胃等組織的分布并不理想。(3)羥基喜樹堿脂溶性水溶性都不好，制成水溶性鈉鹽的抗癌活性降低90％，毒副作用增大；穩(wěn)定性差，藥物的內(nèi)酯環(huán)對(duì)光、pH敏感，抗腫瘤生物學(xué)功能較強(qiáng)的閉環(huán)內(nèi)脂結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為功能較弱的開環(huán)羧酸鹽結(jié)構(gòu)，藥理活性大大下降。由于上述原因，阻礙了羥基喜樹堿充分發(fā)揮抗腫瘤作用，限制了其臨床應(yīng)用。

目前國(guó)內(nèi)外已有采用溶劑揮發(fā)法制備羥基喜樹堿豆磷脂納米凍干制劑的方法，該方法制備的羥基喜樹堿豆磷脂納米凍干制劑雖在一定程度上能夠克服現(xiàn)有注射液的不足，但是該方法需用大量的低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑，對(duì)環(huán)境保護(hù)不利，且易導(dǎo)致有機(jī)溶劑在制劑中殘留，影響藥物的治療效果。

利用喜樹堿內(nèi)酯環(huán)可以加堿開環(huán)溶于水，加酸環(huán)合析出的性質(zhì)，也可以制備得到喜樹堿類藥物的納米晶組合物，但所述工藝均需在制備和最終產(chǎn)品中加入輔料穩(wěn)定劑，且納米粒徑也較大，凍干后復(fù)溶性不好，不利于臨床應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種制備方法簡(jiǎn)便無(wú)污染、重復(fù)性好、易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)、能實(shí)現(xiàn)羥基喜樹堿和其他喜樹堿類藥物的體內(nèi)外緩釋、改善其體內(nèi)分布、增強(qiáng)抗癌療效的納米晶組合物及其制備方法和用途。

本發(fā)明提供了一種喜樹堿類藥物的納米晶組合物，其特征在于：所述的納米晶組合物僅由喜樹堿類藥物組成，無(wú)任何穩(wěn)定劑。

所述的喜樹堿類藥物，是喜樹堿或具有喜樹堿骨架的衍生物，選自10-羥基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿、9-硝基喜樹堿。

所述的喜樹堿類藥物納米晶組合物的粒徑為100-500nm，優(yōu)選粒徑范圍在100-150nm。

其中，喜樹堿類藥物基本上以內(nèi)酯型形式存在；藥物具有緩釋作用，無(wú)突釋現(xiàn)象。

本發(fā)明還提供了一種制備所述的喜樹堿類藥物納米晶組合物的方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：

(1)喜樹堿類藥物溶于堿溶液中，制備成喜樹堿鹽溶液；

(2)超聲條件下，在喜樹堿鹽溶液中滴加酸溶液，進(jìn)行梯度酸化；

(3)高速離心，至上清檢測(cè)不到納米晶存在，除去制備過程中產(chǎn)生的鹽，收集沉淀后加水混懸；

(4)必要時(shí)高壓勻質(zhì)進(jìn)一步減小粒徑；

并且，所述步驟中不包括添加穩(wěn)定劑的步驟。

進(jìn)一步地，步驟(1)所述的堿溶液可以是氫氧化鈉、氫氧化鉀無(wú)機(jī)強(qiáng)堿溶液，也可以是碳酸鈉、磷酸鈉、碳酸鉀、磷酸鉀無(wú)機(jī)弱堿溶液。

步驟(1)所得喜樹堿鹽溶液的pH可在8-14之間，優(yōu)選范圍在9-12。

步驟(1)藥物在堿溶液中的濃度為5-20mg/mL之間，優(yōu)選范圍為10-15mg/mL。

步驟(2)中超聲溫度為常溫，功率為150-300W，酸溶液可以是稀鹽酸或者醋酸。

步驟(2)當(dāng)pH＝4時(shí)喜樹堿類藥物會(huì)完全轉(zhuǎn)化成內(nèi)酯型，這時(shí)加酸的總體積為V；采用梯度滴加的方法：最初以2mL/min的速度滴加50％V，接著以1.0mL/min的速度滴加25％V，然后0.5mL/min的速度滴加15％V，10000rpm離心10min，后取出上清，繼續(xù)以0.5mL/min的速度滴加10％V至pH＝4。

步驟(3)中高速離心條件為10000-20000rpm離心10～20min，收集沉淀是將兩次酸沉后的沉淀一起收集后加水復(fù)溶。

步驟(4)中高壓勻質(zhì)條件為溫度20～30℃，壓力500-4000bar，其中理想勻質(zhì)條件為25℃、2000～2500bar、≥8次循環(huán)。

步驟(3)或步驟(4)之后還可以通過冷凍干燥、噴霧冷凍干燥或噴霧干燥進(jìn)一步固化，所用凍干保護(hù)劑可以是P188、PVP、乳糖、麥芽糖、半乳糖、甘露醇中的一種或兩種以上的組合。其中，優(yōu)選P188為凍干保護(hù)劑；凍干保護(hù)劑的用量為納米晶重量的5-50％，優(yōu)選納米晶重量的25％是凍干保護(hù)劑。

本發(fā)明還提供了一種用途，所述的喜樹堿類藥物納米晶組合物在制備注射劑中的用途，其特征在于所述的注射劑包括注射液和無(wú)菌粉針。

進(jìn)一步地，水相分散介質(zhì)可用高濃度的葡萄糖水溶液調(diào)成5％葡萄糖生理等滲體系，適應(yīng)臨床應(yīng)用。

羥基喜樹堿納米晶凍干粉可加入適量的無(wú)菌藥用5％葡萄糖水溶液稀釋，重建成供靜脈給藥用的分散體系，適應(yīng)臨床使用。

注射給藥后，納米晶可以較傳統(tǒng)注射劑獲得更好的藥物濃度、更長(zhǎng)的血漿半衰期和更高的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)，以及在肝、肺、腫瘤組織更高的藥物分布(AUC)。給藥后，納米晶可以獲得較市售注射劑更好的抗腫瘤效果。

本發(fā)明的納米晶組合物經(jīng)荷瘤小鼠藥效實(shí)驗(yàn)證明，表現(xiàn)出較市售喜樹堿注射液好得多的抗腫瘤藥效，用于腫瘤治療是一種很有前途的藥物遞送系統(tǒng)。

附圖說明

圖1為實(shí)例1中羥基喜樹堿納米粒高壓均質(zhì)前后及加入凍干保護(hù)劑后的平均粒徑分布圖

圖2為實(shí)例2中羥基喜樹堿納米粒高壓均質(zhì)后的平均粒徑分布圖

圖3為實(shí)例3中7-乙基-10-羥基喜樹堿納米粒高壓均質(zhì)后的平均粒徑分布圖

圖4為實(shí)例1中加入凍干保護(hù)劑后的投射電鏡照片

圖5為實(shí)例1中X-粉末衍射圖譜(從上到下依次為羥基喜樹堿納米晶、羥基喜樹堿原藥與P188的物理混合物、羥基喜樹堿原藥)

圖6為實(shí)例1中羥基喜樹堿在水中的體外釋放曲線(n＝3)

圖7為實(shí)例1中大鼠血藥濃度與時(shí)間變化的關(guān)系曲線(a圖0-24h，b圖0-4h)(n＝8)

圖8為實(shí)例1中納米晶在荷瘤小鼠腫瘤中的分布(n＝8)

具體實(shí)施方式

下面將描述本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容完全不局限于此。

實(shí)例1

稱取25mg羥基喜樹堿溶于2mL氫氧化鈉溶液(0.1mol·L-1)中，超聲條件(25℃，250W)下用注射泵控制器緩慢滴加稀鹽酸溶液(0.1mol·L-1)，控制速度：最初2mL/min×0.5min，接著1.0mL/min×0.5min，然后0.5mL/min×0.6min(此時(shí)pH＝5)，離心(離心半徑5cm，1000rpm離心10min)；取上清，繼續(xù)以0.5mL/min的速度滴加0.2mL稀鹽酸溶液(0.1mol·L-1)至pH＝4，然后再次離心(1000rpm離心10min)。合并兩次離心后的沉降物，加入5mL純化水重懸，高壓勻質(zhì)(25℃、2×105KPa)8次。所得納米晶粒徑為133.5±0.3nm(圖1)，多分散性指數(shù)(PDI)為0.13±0.02。

加入占總重量25％的凍干保護(hù)劑P188凍干后于4℃保存，半年后再?gòu)?fù)溶，粒徑為140.6±6.3nm，多分散性指數(shù)(PDI)為0.20±0.02，長(zhǎng)期穩(wěn)定性良好。

實(shí)例2

稱取1000.0mg羥基喜樹堿溶于40.0mL氫氧化鈉溶液(0.2mol·L-1)中，超聲條件(25℃，250W)下用注射泵控制器緩慢滴加稀鹽酸溶液(0.2mol·L-1)，控制速度：最初2mL/min×10min，接著1.0mL/min×10min，然后0.5mL/min×10min(此時(shí)pH＝5)，離心(離心半徑5cm，1000rpm離心10min)；取上清，繼續(xù)以0.5mL/min的速度滴加5.0mL稀鹽酸溶液(0.2mol·L-1)至pH＝4，然后再次離心(離心半徑5cm，1000rpm離心10min)。合并兩次離心后的沉降物，加入80mL純化水重懸，高壓勻質(zhì)(25℃、2×105KPa)8次。用粒徑/電位儀測(cè)得其粒徑為(141.0±0.4)nm(圖2)，PDI值為0.14±0.02，電位為(-26.0±1.1)mV。

實(shí)例3

稱取25mg 7-乙基-10羥基喜樹堿溶于2mL氫氧化鈉溶液(0.1mol·L-1)中，超聲條件(25℃，250W)下用注射泵控制器緩慢滴加稀鹽酸溶液(0.1mol·L-1)，控制速度：最初2mL/min×0.5min，接著1.0mL/min×0.5min，然后0.5mL/min×0.6min(此時(shí)pH＝5)，離心(離心半徑5cm，1000rpm離心10min)；取上清，繼續(xù)以0.5mL/min的速度滴加0.2mL稀鹽酸溶液(0.1mol·L-1)至pH＝4，然后再次離心(1000rpm離心10min)。合并兩次離心后的沉降物，加入5mL純化水重懸，高壓勻質(zhì)(25℃、2×105KPa)8次。所得納米晶粒徑為106.7±0.53nm(圖3)，多分散性指數(shù)(PDI)為0.185±0.012，電位為(-35.1±1.0)mV。

實(shí)例4

將實(shí)例1中制備的羥基喜樹堿納米晶稀釋至100μg/mL，吸取6μL滴到300目的銅網(wǎng)上，空氣中自然晾干，后用0.1％磷鎢酸染色10min，透射電鏡下觀察粒子的形態(tài)(圖4)。

實(shí)例5

實(shí)例1中樣品凍干粉的X-粉末射線衍射圖譜見圖5，樣品測(cè)量參數(shù)：Cu靶管照射，40kV，100mA，步寬：0.01°，掃描范圍：3-70°，結(jié)果可知羥基喜樹堿在納米晶凍干粉中依然以晶型形式存在。

實(shí)例6

羥基喜樹堿納米粒的體外釋放實(shí)驗(yàn)

方案：實(shí)驗(yàn)采用透析袋法對(duì)羥基喜樹堿納米粒進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)，同時(shí)用市售的羧酸鹽型羥基喜樹堿注射液(Injections)及藥物粗粉做對(duì)照。取以上樣品2mL(含藥100μg)于透析袋(截留分子量8000-14000)中，置于100mL釋放介質(zhì)中，于37℃、100rpm條件下恒溫?cái)嚢?，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取1mL釋放外液HPLC測(cè)其中的藥物含量，同時(shí)補(bǔ)充等溫等體積的釋放介質(zhì)，計(jì)算累積釋放度，釋放介質(zhì)采用純化水，同一樣品平行實(shí)驗(yàn)3份。

結(jié)果：納米粒顯著增強(qiáng)了藥物的緩釋效果，在水中均能緩釋72h(圖6)

實(shí)例7羥基喜樹堿納米粒藥代動(dòng)力學(xué)研究

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康SD大鼠16只，雄性，體重200～220g。

給藥方案：隨機(jī)分成兩組。給藥前禁食12h，自由飲水。以5mg/kg的劑量分別靜脈注射給予羥基喜樹堿納米粒和市售注射劑。

樣品采集：給藥后15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h眼眶后取血0.5mL，5000rpm離心取上清血漿；取收集的血漿200μL于EP管中，加冰醋酸20μL，于暗處轉(zhuǎn)化3h(將羧酸鹽型轉(zhuǎn)化成內(nèi)酯型)；加乙酸乙酯1mL，渦旋振蕩1min，10000rpm離心10min；取上清，氮?dú)獯蹈?；剩余物加甲?00μL超聲溶解，過0.22μm針頭式濾器，取20μL以HPLC檢測(cè)。

結(jié)果：藥-時(shí)曲線見圖7。平均血藥濃度數(shù)據(jù)用Phoenix WinNonlin(version 6.1)擬合，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下表(n＝8，mean±SD；**P＜0.01，***P＜0.001vs.市售注射劑)：

實(shí)施例8

羥基喜樹堿納米晶在H22荷瘤小鼠體內(nèi)分布

動(dòng)物模型的建立：

在培養(yǎng)箱體外培養(yǎng)4T1非熒光細(xì)胞，將指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化，用無(wú)菌PBS調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×107個(gè)/mL備用。給70只6周齡的BALB/C雌性小鼠右腋下注射0.2mL的4T1細(xì)胞(1×106/mL)的PBS懸液，隔天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，至體積大于100mm3，篩選腫瘤大小相對(duì)一致的72只小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

給藥方案：取荷瘤小鼠72只，隨機(jī)分為市售注射劑和納米粒2組，給藥前禁食12h，自由飲水，按照8mg/kg劑量尾靜脈注射給藥。

樣品采集：于給藥后0.5、1、4、8、12h、24h摘眼球取血后脫頸椎處死小鼠；取心、肝、脾、肺、腎、腦及腫瘤組織，生理鹽水洗凈浮血，濾紙吸干；各組織稱重后加3倍質(zhì)量生理鹽水組織勻漿；離心，取各組織勻漿液200μL加冰醋酸20μL暗處轉(zhuǎn)化3h，加乙酸乙酯1mL，渦旋振蕩1min，10000rpm離心10min；取上清，氮?dú)獯蹈桑瑲堄辔锛蛹状?00μL超聲溶解，過0.22μm針頭式濾器，取20μL以HPLC檢測(cè)。各參數(shù)用Phoenix WinNonlin(version 6.1)擬合計(jì)算。

結(jié)果：納米晶組延長(zhǎng)了藥物在各組織的滯留時(shí)間，如肝、肺中的平均駐留時(shí)間分別為注射劑組的2.01和2.44倍。這種滯留時(shí)間的延長(zhǎng)有利于藥物在組織蓄積，其中，心、肝、脾、肺、腎組織中的AUC0-24h分別為注射劑的6.71、39.53、6.23、13.45、14.08倍。給藥后，納米混懸劑組腫瘤組織的藥物濃度較注射劑組顯著提高，AUC0-24h為后者的7.25倍。在腫瘤中的分布圖見圖8(n＝6，mean±SD；***P＜0.001vs.市售注射劑)。

羥基喜樹堿納米晶及市售注射劑在各組織中的分布參數(shù)如下表：

Ra＝AUC(NSps)/AUC(Inj) Rb＝MRT(NSps)/MRT(Inj) Rc＝C_max(NSps)/C_max(Inj)

實(shí)例9

羥基喜樹堿納米晶在4T1荷瘤小鼠的抗腫瘤藥效研究

動(dòng)物模型的建立：同實(shí)施例8中相同。

給藥方案：將篩選出來(lái)的荷瘤小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，除正常飲食外，尾靜脈注射給藥，每2天給藥一次，實(shí)驗(yàn)18天?？瞻捉M給予生理鹽水溶液，注射劑組按照5mg/kg的劑量尾靜脈注射市售HCPT注射液(生理鹽水稀釋)，納米混懸劑組按照5mg/kg、2.5mg/kg、1.5mg/kg的劑量尾靜脈注射HCPT納米晶?？疾熘笜?biāo)：每日上午9點(diǎn)至10點(diǎn)，用電子秤稱量小鼠體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脫頸椎處死小鼠，完整剝離腋下腫瘤組織稱重，計(jì)算抑瘤率(％)＝(1-治療組平均瘤重/生理鹽水組平均瘤重)×100％。

結(jié)果：同樣給藥劑量下，納米粒表現(xiàn)出卓越的抗腫瘤治療，腫瘤抑制率較市售注射劑(74.84％vs.37.93％)有顯著性增強(qiáng)，P＜0.01。表明本發(fā)明方法制備的10-HCPT納米晶的用于腫瘤治療是一種很有前途的藥物遞送系統(tǒng)。納米粒及注射劑對(duì)4T1荷瘤小鼠的抑瘤率如下表(n＝8，mean±SD)：

注：^###p＜0.001vs.生理鹽水組；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vs.10-HCPT注射劑組。

本發(fā)明內(nèi)容僅僅舉例說明了要求保護(hù)的一些具體實(shí)施方案，其中一個(gè)或更多個(gè)技術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個(gè)或多個(gè)技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案也在本申請(qǐng)保護(hù)范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開內(nèi)容中具體記載一樣。