本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品及其制備方法。

背景技術(shù)：

偽狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）屬于皰疹病毒（Herpesviridae）α皰疹病毒亞科（Alphaher-pesririnae）水痘病毒屬（Varicello virus）的皰疹病毒亞科Ⅰ型（Porcine herpesvirus Typel），能引發(fā)豬的嚴(yán)重疾病。同時(shí)，豬既是偽狂犬病毒的貯存者，也是偽狂犬病毒的傳染源，控制豬偽狂犬病不僅對養(yǎng)豬事業(yè)本身，而且對其它動物養(yǎng)殖的順利發(fā)展也有著十分重要的意義。在歐美等達(dá)國家，得利于PRV基因缺失活苗和相應(yīng)鑒別方法的應(yīng)用，該病得到控制或根除；但在發(fā)展中國家，該病仍頻繁發(fā)生，嚴(yán)重制約了這些國家和地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

脂質(zhì)體(liposomes)是一種具有類似于生物膜結(jié)構(gòu)的雙分子小囊，因?yàn)樗慕M成結(jié)構(gòu)和細(xì)胞生物膜相似，所以容易與細(xì)胞發(fā)生吸附、融合、脂交換、內(nèi)吞，從而被細(xì)胞攝取和被細(xì)胞膜融合，最后將藥物或生物顆粒送入細(xì)胞內(nèi)部，是一種靶向給藥系統(tǒng)中的新劑型。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，脂質(zhì)體作為藥物的載體，既能包封脂溶性藥物，又能包封水溶性藥物，提高生物利用率，具有和脂質(zhì)體細(xì)胞的親和性和與組織相容性等特點(diǎn)。

天然產(chǎn)物活性成分是指從自然存在的再生資源中提取的具有獨(dú)特功能和生物活性的化合物，其中許多有效成分是疾病防治、強(qiáng)身健體的物質(zhì)基礎(chǔ)。天然產(chǎn)物安全性高，已成為醫(yī)藥、食品及飼料的重要來源。天然產(chǎn)物活性成分包括有黃酮、多酚、萜類等幾百種，其分子主要特點(diǎn)有：相對分子質(zhì)量較低，從幾百到幾千；具有一定的極性，可溶于許多有機(jī)溶劑中。

獸用生物制品質(zhì)量評定最重要的指標(biāo)之一就是免疫保護(hù)期，然而在實(shí)際生產(chǎn)過程中豬偽狂犬活疫苗保護(hù)時(shí)間長短不一，本發(fā)明宗旨在于延長豬偽狂犬病毒抗原在體內(nèi)的作用時(shí)間，誘導(dǎo)動物機(jī)體免疫，進(jìn)而也大幅度提高豬偽狂犬病毒的抗體水平。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品及其制備方法的技術(shù)方案。

所述的一種偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品，其特征在于每1000mlPBS中包含以下組分：喬松素1-6g、紫花前胡素2-8g、大豆甙元5-10g、芍藥苷1-3g、脂質(zhì)體5-10g和凍干保護(hù)劑5-15g。

所述的一種偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品，其特征在于每1000mlPBS中包含以下組分：喬松素2-5g、紫花前胡素3-7g、大豆甙元6-9g、芍藥苷2-3g、脂質(zhì)體6-9g和凍干保護(hù)劑8-12g。

所述的一種偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品，其特征在于所述的脂質(zhì)體通過以下步驟得到：稱取大豆卵磷脂和甘氨膽酸，用氯仿進(jìn)行溶解，并使其混合均勻，并通過減壓法去除溶液中氯仿，制備脂質(zhì)體膜；取pH值為7.0～8.0的枸緣酸和枸緣酸鉀緩沖溶液，將該緩沖溶液加入到脂質(zhì)體膜溶液中，脫水后用勻漿機(jī)制備成脂質(zhì)體。

所述的一種偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品，其特征在于所述的凍干保護(hù)劑為蔗糖。

所述的一種偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品，其特征在于稱取大豆卵磷脂3-4g和甘氨膽酸2-3g用400-500ml氯仿進(jìn)行溶解；將100-200ml的枸緣酸和枸緣酸鉀緩沖溶液加入到脂質(zhì)體膜溶液中。

所述的一種偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

取所述重量的各組分充分混合后，加入到1000ml pH 7 磷酸鹽緩沖液中水化，再經(jīng)過0.22um的濾器進(jìn)行過濾，分裝于凍干瓶中；先放低溫冰箱預(yù)凍，再放真空凍干機(jī)中干燥，即得到偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品。

所述的一種偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品的制備方法，其特征在于所述的pH 7的磷酸鹽緩沖液通過以下步驟得到：取氯化鈉6-10g、氯化鉀0.05-0.5g、磷酸氫二鈉1-1.2g、磷酸二氫鉀0.05-0.5g、氯化鈣0.05-0.2g、含6個(gè)結(jié)晶水的氯化鎂0.05-0.2g；將以上各成分混合后，溶于1000ml雙蒸水中，經(jīng)116℃，高壓滅菌30分鐘即得。

本發(fā)明涉及的組分均為現(xiàn)有產(chǎn)品，其中大豆甙元購于成都瑞芬思生物科技有限公司，芍藥苷購于南京春秋生物工程有限公司。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1）本發(fā)明所制備的一種偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品可以使豬只提前產(chǎn)生抗體，降低免疫空白期。

2）本發(fā)明所制備的一種偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品不僅可以增強(qiáng)豬只免疫力，還能延長疫苗保護(hù)期，提高豬偽狂犬活疫苗的免疫效果。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

實(shí)施例1：脂質(zhì)體的制備

稱取大豆卵磷脂4g和甘氨膽酸3g，用500ml氯仿進(jìn)行溶解，并使其混合均勻，并通過減壓法去除溶液中氯仿，制備脂質(zhì)體膜；取pH值為7.0～8.0的枸緣酸和枸緣酸鉀緩沖溶液200ml，將該緩沖溶液加入到脂質(zhì)體膜溶液中，脫水后用勻漿機(jī)制備成脂質(zhì)體。

實(shí)施例2：脂質(zhì)體的制備

稱取大豆卵磷脂3g和甘氨膽酸2g，用400ml氯仿進(jìn)行溶解，并使其混合均勻，并通過減壓法去除溶液中氯仿，制備脂質(zhì)體膜；取pH值為7.0～8.0的枸緣酸和枸緣酸鉀緩沖溶液100ml，將該緩沖溶液加入到脂質(zhì)體膜溶液中，脫水后用勻漿機(jī)制備成脂質(zhì)體。

實(shí)施例3：pH 7磷酸鹽緩沖液的制備

取氯化鈉8g、氯化鉀0.3g、磷酸氫二鈉1g、磷酸二氫鉀0.3g、氯化鈣0.3g、含6個(gè)結(jié)晶水的氯化鎂0.1g；將以上各成分混合后，溶于1000ml雙蒸水中，經(jīng)116℃，高壓滅菌30分鐘即得。

實(shí)施例4：pH 7磷酸鹽緩沖液的制備

取氯化鈉10g、氯化鉀0.5g、磷酸氫二鈉1.2g、磷酸二氫鉀0.5g、氯化鈣0.2g、含6個(gè)結(jié)晶水的氯化鎂0.2g；將以上各成分混合后，溶于1000ml雙蒸水中，經(jīng)116℃，高壓滅菌30分鐘即得。

實(shí)施例5：一種偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品

取喬松素5g、紫花前胡素6g、大豆甙元8g、芍藥苷2g、脂質(zhì)體6g（實(shí)施例1制得）、蔗糖8g；

上述各組分充分混合后，加入到1000ml pH 7 磷酸鹽緩沖液（實(shí)施例3制得）中水化，再經(jīng)過0.22um的濾器進(jìn)行過濾，分裝于凍干瓶中；

先放低溫冰箱預(yù)凍，再放真空凍干機(jī)中干燥，即得到偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品。

實(shí)施例6：一種偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品

取喬松素4g、紫花前胡素4g、大豆甙元6g、芍藥苷1g、脂質(zhì)體5g（實(shí)施例1制得）、蔗糖5g；

上述各組分充分混合后，加入到1000ml pH 7 磷酸鹽緩沖液（實(shí)施例3制得）中水化，再經(jīng)過0.22um的濾器進(jìn)行過濾，分裝于凍干瓶中；

先放低溫冰箱預(yù)凍，再放真空凍干機(jī)中干燥，即得到偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品。

實(shí)施例7：一種偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品

取喬松素6g、紫花前胡素8g、大豆甙元10g、芍藥苷3g、脂質(zhì)體10g（實(shí)施例2制得）、蔗糖15g；

上述各組分充分混合后，加入到1000ml pH 7 磷酸鹽緩沖液（實(shí)施例4制得）中水化，再經(jīng)過0.22um的濾器進(jìn)行過濾，分裝于凍干瓶中；

先放低溫冰箱預(yù)凍，再放真空凍干機(jī)中干燥，即得到偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品。

試驗(yàn)例1 本發(fā)明的應(yīng)用

1材料

1.1偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品：按本發(fā)明實(shí)施例5-7制得。

1.2 偽狂犬活疫苗：市購

1.3 試驗(yàn)用豬：28日齡健康斷奶仔豬60頭，檢測偽狂犬抗體、抗原雙陰性。70日齡健康育肥豬60頭，檢測偽狂犬抗體、抗原雙陰性。

2 方法

2.1包封率的測定

分別取空白的凍干脂質(zhì)體和處理過的脂質(zhì)體凍干粉，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行復(fù)溶，超速離心，取上清，按一定比例稀釋，測定其吸光度（參考獸藥典），平均每個(gè)樣品測3次，算其平均值。

2.2 形態(tài)觀察和粒徑

脂質(zhì)體稀釋液凍干粉復(fù)溶后，在透射電鏡（×20000）下觀察

2.3 28日齡斷奶仔豬免疫效果

將本發(fā)明實(shí)施例5-7制備的偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品置于PH7的PBS磷酸鹽緩沖液中完全溶解，備用。試驗(yàn)將60頭28日齡健康斷奶仔豬分為四組，每組15頭， A組采用本發(fā)明實(shí)施例5制備的偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液進(jìn)行疫苗稀釋；B組采用本發(fā)明實(shí)施例6制備的偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液進(jìn)行疫苗稀釋；C組采用本發(fā)明實(shí)施例7制備的偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液進(jìn)行疫苗稀釋；D組采用疫苗自帶稀釋液進(jìn)行疫苗稀釋。免疫后于7d、14d、21d、42d、63d、84d分別前腔靜脈采血，分離血清，采用IDEXX豬偽狂犬抗體檢測試劑盒檢測各組gB IgG抗體。

2.4 70日齡豬免疫效果

實(shí)施例3-5制備的偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品的處理方法同2.3,備用。試驗(yàn)將60頭70日齡健康陰性豬分為四組，每組15頭，E組采用本發(fā)明實(shí)施例5制備的偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液進(jìn)行疫苗稀釋；F組采用本發(fā)明實(shí)施例6制備偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品進(jìn)行疫苗稀釋；G組采用本發(fā)明實(shí)施例7制備偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液進(jìn)行疫苗稀釋；H組采用疫苗自帶稀釋液進(jìn)行疫苗稀釋。免疫后于7d、14d、21d、42d、63d、84d分別采血，分離血清，采用IDEXX偽狂犬抗體檢測試劑盒檢測各組gB IgG抗體。

3 結(jié)果

3.1包封率結(jié)果

按照公式：包封率（％）＝系統(tǒng)中包封的藥量（A1）/ 系統(tǒng)中包封與未包封的總藥量（A2）×100％，結(jié)果見表1。

表1包封率測定結(jié)果

3.2 形態(tài)觀察和粒徑

脂質(zhì)體稀釋液凍干制品為多室脂質(zhì)體，粒度規(guī)則，為圓形，粒徑基本一致，結(jié)果見表2。

表2 形態(tài)觀察和粒徑測定結(jié)果

3.3 28日齡斷奶仔豬免疫效果

表3 28日齡健康斷奶仔豬gB IgG抗體檢測結(jié)果

3.4 70日齡育肥豬免疫效果

表4 70日齡育肥豬gB IgG抗體檢測結(jié)果

4 結(jié)論

綜上所述，本發(fā)明偽狂犬病活疫苗脂質(zhì)體稀釋液凍干制品可以提高機(jī)體免疫力，一方面誘導(dǎo)動物機(jī)體提前產(chǎn)生抗體降低免疫空白期；另一方面延長疫苗保護(hù)期。鑒于此，本發(fā)明可以大幅度提高偽狂犬病活疫苗的免疫效果。