本發(fā)明屬于牙科材料制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗菌效應(yīng)的種植體基臺(tái)及其制備方法。

背景技術(shù)：

牙列缺損缺失是常見病和多發(fā)病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)35～44歲的人群中，缺牙患者占36.4％；65～74歲人群中占77.89％。種植義齒因其不損傷鄰牙、功能好、壽命長(zhǎng)、美觀舒適等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為缺牙修復(fù)的首選方案。種植時(shí)，基臺(tái)穿齦部位直接暴露于口腔有菌環(huán)境，基臺(tái)周圍軟組織結(jié)合的形成與維持會(huì)一直受到細(xì)菌的侵襲和干擾，一旦軟組織封閉形成初期遭遇細(xì)菌侵襲或者軟組織結(jié)合形成后被破壞會(huì)導(dǎo)致種植體周圍炎。文獻(xiàn)顯示：種植體周圍炎的發(fā)病率為56％。種植體周圍炎目前沒有有效的治療方案，最終會(huì)導(dǎo)致種植體失敗。

目前，臨床最常用的牙科種植體基臺(tái)通常是光滑的，研究表明這種結(jié)構(gòu)周圍主要形成機(jī)械扣鎖封閉，容易形成纖維包囊，軟組織與種植體結(jié)合界面難以形成良好的生物封閉，并難以長(zhǎng)期抵御細(xì)菌侵襲。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗菌效應(yīng)的種植體基臺(tái)及其制備方法，該方法操作簡(jiǎn)單，實(shí)用性強(qiáng)，通過該方法制得的種植體基臺(tái)能夠達(dá)到有效抑制細(xì)菌粘附和侵襲的目的。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明公開了一種具有抗菌效應(yīng)的種植體基臺(tái)的制備方法，包括以下步驟：

1)采用微弧氧化(MAO)法，在純鈦種植體基臺(tái)表面制備具有微米結(jié)構(gòu)的多孔涂層；

2)采用溶膠凝膠法，制備慶大霉素-二氧化硅納米顆粒；

3)采用明膠交聯(lián)法，將步驟2)制得的慶大霉素-二氧化硅納米顆粒在明膠溶液中均勻分散，然后滴加至步驟1)制得的具有微米結(jié)構(gòu)的多孔涂層的純鈦種植體基臺(tái)表面，發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，制得具有長(zhǎng)期抗菌效應(yīng)的種植體基臺(tái)。

步驟1)中，微弧氧化法的具體操作條件為：

陽極為純鈦片，陰極為不銹鋼鍋；電解質(zhì)溶液由0.04mol/L的β-甘油磷酸二鈉鹽五水及0.2mol/L乙酸鈣的去離子水溶液組成；電源電壓為300V，頻率為600Hz，占空比為8％，處理時(shí)間為5min。

步驟1)中，所用的純鈦種植體基臺(tái)在微弧氧化處理之前，將其表面打磨拋光后，依次用丙酮、無水乙醇及去離子水超聲清洗20min，干燥后備用。

步驟2)中，采用溶膠凝膠法，制備慶大霉素-二氧化硅納米顆粒，具體操作為：

將鹽酸慶大霉素溶解于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25％的氨水中，充分混勻后滴加于無水乙醇中，然后再向反應(yīng)體系中加入正硅酸乙酯，充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)24h，將反應(yīng)產(chǎn)物反復(fù)離心、洗滌處理，真空冷凍干燥后，制得慶大霉素－二氧化硅納米顆粒。

鹽酸慶大霉素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25％的氨水、無水乙醇及正硅酸乙酯的用量比為：(15～25)mg：(3～5)ml：(65～80)ml：(180～220)μL。

步驟3)具體操作，包括以下步驟：

(1)將步驟2)制備的慶大霉素-二氧化硅納米顆粒加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的明膠溶液中，采用細(xì)胞破碎儀超聲處理20min；

(2)將步驟(1)制得的液體滴加至具有微米結(jié)構(gòu)的多孔涂層的純鈦種植體基臺(tái)表面，漩渦振蕩器上振蕩30min，4℃干燥過夜；

(3)將經(jīng)步驟(2)處理的種植體基臺(tái)浸泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％～3％的戊二醛溶液中發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，再用無水乙醇清洗數(shù)次，在種植體基臺(tái)表面制得復(fù)合緩釋涂層，即得到具有抗菌效應(yīng)的種植體基臺(tái)。

步驟(1)中，慶大霉素-二氧化硅納米顆粒與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的明膠溶液的用量比為(1.5～3)mg：(1～2)ml。

本發(fā)明還公開了采用上述的方法制得的具有抗菌效應(yīng)的種植體基臺(tái)，該種植體基臺(tái)外表面具有微米形貌的微弧氧化涂層，且該微弧氧化涂層交聯(lián)有慶大霉素-二氧化硅納米顆粒。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明公開的具有抗菌效應(yīng)的種植體基臺(tái)及其制備方法，首先采用微弧氧化法，在純鈦種植體基臺(tái)表面制備具有微米結(jié)構(gòu)的微弧氧化涂層；然后，采用溶膠凝膠法制備慶大霉素-二氧化硅納米顆粒；最后，利用明膠交聯(lián)法，將慶大霉素-二氧化硅納米顆粒復(fù)合在微弧氧化涂層上，形成微納米二級(jí)結(jié)構(gòu)，建立復(fù)合緩釋涂層，長(zhǎng)期緩釋慶大霉素，可以有效抑制細(xì)菌的粘附和侵襲，降低種植體周圍炎的發(fā)病率并降低口腔種植的失敗率。

經(jīng)本發(fā)明方法制得的具有抗菌效應(yīng)的種植體基臺(tái)，其表面涂層可長(zhǎng)期緩釋慶大霉素，實(shí)現(xiàn)有效抑制細(xì)菌粘附和侵襲的目的。涂層體外緩釋實(shí)驗(yàn)證實(shí)，慶大霉素可緩釋數(shù)十天，抗菌實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)菌的粘附和繁殖得到明顯抑制，且對(duì)細(xì)胞沒有毒性，這將有利于種植體周圍軟組織封閉的形成與維持。

附圖說明

圖1為種植體基臺(tái)微弧氧化處理后的掃描電鏡圖像；

圖2為慶大霉素－二氧化硅納米顆粒的透射電鏡圖像；

圖3為牙科種植體基臺(tái)抗菌涂層的掃描電鏡圖像；

圖4為種植體基臺(tái)接種細(xì)菌24h后的菌落計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)圖；

圖5為牙科種植體基臺(tái)接種細(xì)菌后的激光共聚焦圖，其中，a、b、c分別為光滑組、微弧氧化組和抗菌涂層組種植體基臺(tái)；

圖6為種植體基臺(tái)接種細(xì)胞后的掃描電鏡圖像；

圖7為本發(fā)明的種植體基臺(tái)釋放慶大霉素的緩釋曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。

本發(fā)明公開的具有抗菌效應(yīng)的種植體基臺(tái)的制備方法，包括以下步驟：

(1)制備微弧氧化涂層

①選用純鈦種植體基臺(tái)，將其表面用碳化硅砂紙打磨拋光后，依次用丙酮、無水乙醇、去離子水超聲清洗20分鐘后，干燥后備用；

②采用微弧氧化技術(shù)在種植體基臺(tái)表面制備具有微米結(jié)構(gòu)的多孔涂層。

微弧氧化具體方法：

微弧氧化電解質(zhì)溶液由0.04mol/L的β-甘油磷酸二鈉鹽五水、0.2mol/L的乙酸鈣的去離子水溶液組成，電源電壓為300V，頻率為600Hz，占空比8％，處理時(shí)間5分鐘，陽極為純鈦片，陰極為不銹鋼鍋。試件依次用丙酮、無水乙醇、去離子水超聲清洗10分鐘，干燥后備用。制得的具有微米結(jié)構(gòu)的多孔涂層的純鈦種植體基臺(tái)表面，掃描電鏡圖像如圖1所示。

(2)制備慶大霉素-二氧化硅納米顆粒

溶膠凝膠法制備慶大霉素-二氧化硅納米顆粒。

具體方法如下：

①取15～20mg鹽酸慶大霉素溶解在3～5ml的25％氨水中；

②將上述液體滴加至65～80ml無水乙醇，然后在其中緩慢加入180～220μL正硅酸乙酯；磁力攪拌下反應(yīng)24小時(shí)；

③將產(chǎn)物反復(fù)離心洗滌，真空冷凍干燥后得到白色粉末即為慶大霉素-二氧化硅納米顆粒。透射電鏡圖像參見圖2，從圖中可以看出，慶大霉素-二氧化硅納米顆粒較均勻，粒徑約為30～50nm。

(3)制備復(fù)合緩釋涂層

明膠交聯(lián)法制備復(fù)合緩釋涂層。

具體方法:

①取1.5～3mg步驟(2)制得的慶大霉素-二氧化硅納米顆粒，加入至1～2ml0.1％明膠溶液中，細(xì)胞破碎儀超聲處理20分鐘，使其在明膠溶液中分散均勻；

②吸取200μL上述液體滴至步驟2制備的基臺(tái)表面，漩渦振蕩器上振蕩30分鐘；4度干燥過夜；

③將其浸泡在1％～3％戊二醛溶液中30分鐘使明膠發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，無水乙醇清洗3次。

參見圖3，為種植體基臺(tái)抗菌涂層的掃描電鏡圖像，從圖中可以看出，慶大霉素-二氧化硅納米顆粒較均勻的交聯(lián)到了MAO表面。

實(shí)驗(yàn)方法：

1、菌落計(jì)數(shù)

具體步驟如下：

(1)用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基將金黃色葡萄球菌稀釋為濃度10⁶CFU/ML。

(2)各組基臺(tái)與1ml上述細(xì)菌懸液共培養(yǎng)24h。

(3)將黏附在基臺(tái)上的細(xì)菌超聲振蕩至PBS溶液內(nèi)。

(4)將步驟(3)中的細(xì)菌PBS懸液稀釋100倍后涂板。

進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果參見圖4，從圖中可見，與傳統(tǒng)的光滑種植體基臺(tái)和微弧氧化基臺(tái)相比，本發(fā)明的種植體基臺(tái)表面菌落明顯減少。

2、滅菌實(shí)驗(yàn)

具體步驟如下：

(1)用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基將金黃色葡萄球菌稀釋為濃度10⁶CFU/ml。

(2)各組基臺(tái)與1ml上述細(xì)菌懸液共培養(yǎng)24h。

(3)用PBS和去離子水分別漂洗基臺(tái)表面以去除未黏附的細(xì)菌。

(4)在其表面滴加死菌/活菌熒光染色劑使細(xì)菌著色。

置于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。結(jié)果參見圖5，其中a、b、c分別為光滑組、微弧氧化組和本發(fā)明的抗菌涂層組種植體基臺(tái)，顯微鏡下綠色為活菌，紅色為死菌。與光滑組和微弧氧化組基臺(tái)相比，本發(fā)明的種植體基臺(tái)表面基本無活菌，絕大部分為紅色的死菌，表明本發(fā)明的種植體基臺(tái)可有效殺滅細(xì)菌。

3、接種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

具體步驟如下：

(1)細(xì)胞接種及培養(yǎng)

(i)制備細(xì)胞懸液：成纖維細(xì)胞鋪滿瓶底約80％時(shí)，于室溫條件用0.25％胰蛋白酶消化離心稀釋后，制備成5000/ml懸液。

(ii)將抗菌種植體基臺(tái)安放48孔板，然后將細(xì)胞接種于材料表面，細(xì)胞的接種濃度為1500/孔。

(iii)加入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。

(2)細(xì)胞固定脫水：

(i)將達(dá)到培養(yǎng)時(shí)間的孔板中的培養(yǎng)液去除，用PBS將未粘附的細(xì)胞漂洗洗干凈。

(ii)將抗菌種植體基臺(tái)置于2.5％戊二醛溶液中4℃過夜固定。

(iii)30％～100％乙醇溶液梯度脫水，干燥噴金后電鏡觀測(cè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖6，從圖中可以看出，基臺(tái)表面細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，說明本發(fā)明的種植體基臺(tái)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無影響，具有較好的生物相容性。

4、緩釋實(shí)驗(yàn)

具體步驟如下：

(1)將抗菌種植體基臺(tái)置于分子量為100kDa的透析袋內(nèi)。

(2)把透析袋浸沒在50ml PBS溶液中。

(3)密封后置于振蕩培養(yǎng)箱中恒速振蕩。

(4)在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)從袋外緩沖液中取樣1ml，并立即補(bǔ)加等量PBS。

(5)用ELISA試劑盒測(cè)定相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的藥物濃度，并繪制曲線。

結(jié)果如圖7所示，從圖7中可以看出，本發(fā)明的抗菌種植體基臺(tái)可有效釋放慶大霉素60天，且初期突釋不明顯。

綜上所述，本發(fā)明制備的種植體基臺(tái)為具有微米結(jié)構(gòu)的微弧氧化涂層，先制備慶大霉素-二氧化硅納米顆粒；然后利用明膠交聯(lián)法，將慶大霉素-二氧化硅納米顆粒復(fù)合在微弧氧化涂層上，形成微納米二級(jí)結(jié)構(gòu)，建立復(fù)合緩釋涂層，長(zhǎng)期緩釋慶大霉素，可以有效抑制細(xì)菌的粘附和侵襲，促進(jìn)軟組織封閉的形成，降低種植體周圍炎的發(fā)病率并降低口腔種植的失敗率。