本發(fā)明涉及一種銀杏葉提取物及其制備方法和應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

銀杏為銀杏科銀杏屬多年生落葉喬木，我國藥典中記載銀杏葉有潤肺、平喘、止痛作用，可用于肺虛咳嗽、冠心病心絞痛等，在臨床上應(yīng)用多年，取得了良好的臨床療效。銀杏葉主要活性成分為黃酮類化合物和內(nèi)酯類化合物，銀杏葉提取物具有廣泛的藥理作用:拮抗血小板活化因子、清除自由基、抗炎、抗過敏等方面，具有廣闊的應(yīng)用前景。眾所周知，中藥提取物的功效與提取物中的物質(zhì)組成有直接的關(guān)聯(lián)，不同來源的藥材、不同的提取方法均會影響中藥提取物中的物質(zhì)組成，進而影響中藥提取物的功效。

中國發(fā)明專利CN1827120A公開了一種含有銀杏葉提取物與腎上腺素受體激動劑的藥物組合物，較單獨使用藥物組合物中任一活性組分，本發(fā)明通過銀杏葉提取物與沙美特羅或福莫特羅組合使用取得了顯著的協(xié)同性作用，藥物組合物引喘潛伏期得到了延長、抽搐發(fā)生率更低。

但是上述技術(shù)方案仍然存在缺陷與不足：(1)銀杏葉提取物對內(nèi)酯和黃酮的含量有較高的要求，銀杏葉提取物內(nèi)酯含量需大于80％，或者黃酮含量大于70％，同時要求內(nèi)酯含量大于18％；(2)制備高含量內(nèi)酯和黃酮的銀杏葉提取物工序繁瑣，活性成分損失大，銀杏葉物料利用率低；(3)藥物組合物為銀杏葉提取物與β2-腎上腺素受體激動劑的復方，依然無法避免β2-腎上腺素受體激動劑臨床使用時引起骨骼肌震顫、低血鉀、心律紊亂等不良反應(yīng)。因此，我們迫切需要開發(fā)一種新型的、安全的、純中藥哮喘藥物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種銀杏葉提取物及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明制備方法簡單、條件溫和，所使用的試劑毒性小，所制備的銀杏葉提取物單獨使用能有效舒張氣管平滑肌，用于哮喘的治療。

實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種銀杏葉提取物，所述銀杏葉提取物包含銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯，所述銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯三者之和的質(zhì)量百分含量小于35％。

優(yōu)選的，所述銀杏葉提取物中銀杏黃酮的含量為20～25wt％、銀杏內(nèi)酯的含量為2～4wt％、白果內(nèi)酯的含量為2～4wt％。

一種銀杏葉提取物的制備方法，包括如下步驟：

(1)銀杏葉干燥后粉碎，過40～60目篩；

(2)向銀杏葉中加入銀杏葉重量4～8倍、體積濃度為60～80％乙醇提取2～3次，每次提取60～70min，合并提取液；

(3)將步驟(2)制備的提取液減壓蒸餾得到濃縮液，向濃縮液中加入等體積的純化水，沉淀12～15h，取上清液；

(4)將步驟(3)的上清液減壓干燥后上酸性氧化鋁柱，用含乙酸的乙醇洗脫，收集洗脫液，洗脫液減壓蒸餾得到流浸膏，流浸膏減壓干燥得到銀杏葉提取物，其中，所述含乙酸的乙醇為體積濃度為80～90％的乙醇和體積百分比0.1～0.5％的乙酸組成。

優(yōu)選的，步驟(3)所述濃縮液為提取液體積的1/10～1/5。

一種銀杏葉提取物在制備氣管平滑肌舒張藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述氣管平滑肌舒張藥物用于治療哮喘。

優(yōu)選的，所述氣管平滑肌舒張藥物的劑型為片劑或膠囊劑中的一種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:

(1)本發(fā)明制備的銀杏葉提取物中銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯、白果內(nèi)酯的含量分別為20～25wt％、2～4wt％、2～4wt％，避免了高含量黃酮和內(nèi)酯銀杏葉提取物的使用，提高了中藥銀杏葉的利用率，也簡化了制備工藝。

(2)本發(fā)明制備的銀杏葉提取物單獨使用便能有效舒張氣管平滑肌，用于哮喘藥物的制備和應(yīng)用，避免了高含量黃酮和內(nèi)酯銀杏葉提取物與β2-腎上腺素受體激動劑組合用藥，因而可克服β2-腎上腺素受體激動劑的不良反應(yīng)。

(3)本發(fā)明制備方法簡單、高效，提取液減壓蒸餾濃縮后加與濃縮液等體積的水沉淀，除去親水性強的無活性物質(zhì)，減少了后續(xù)上酸性氧化鋁柱的樣品量，便于銀杏葉提取物的制備。

(4)純化過程使用酸性氧化鋁柱，再用含乙酸的體積濃度為80～90％的乙醇洗脫，可實現(xiàn)銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯、白果內(nèi)酯的高效吸附和洗脫，減少銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯、白果內(nèi)酯的損失，提高了轉(zhuǎn)移率。

(5)本發(fā)明銀杏葉提取物的制備方法避免使用有毒性的有機試劑及其殘留，進一步提高了銀杏葉提取物的安全性。

具體實施方式

為使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實施，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述。

一、實施例部分

實施例1銀杏葉提取物的制備方法

(1)銀杏葉干燥后粉碎，過60目篩；

(2)加入銀杏葉重量4倍、體積濃度為65％乙醇提取3次，每次提取60min，合并提取液；

(3)提取液減壓回收得到濃縮液，向濃縮液中加入等體積的純化水，沉淀12h；

(4)取上清液減壓干燥后上酸性氧化鋁柱，用體積濃度為90％的乙醇(含乙酸0.5％，v/v)洗脫，收集洗脫液，洗脫液減壓蒸餾得到流浸膏，流浸膏減壓干燥得到銀杏葉提取物。

實施例2銀杏葉提取物的制備方法

(1)銀杏葉干燥后粉碎，過40目篩；

(2)加入銀杏葉重量8倍、體積濃度為60％乙醇提取2次，每次提取60min，合并提取液；

(3)提取液減壓回收得到濃縮液，向濃縮液中加入等體積的純化水，沉淀15h；

(4)取上清液減壓干燥后上酸性氧化鋁柱，用體積濃度為80％的乙醇(含乙酸0.2％，v/v)洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，浸膏減壓干燥得到銀杏葉提取物。

實施例3銀杏葉提取物的制備方法

(1)銀杏葉干燥后粉碎，過50目篩；

(2)加入銀杏葉重量6倍、體積濃度為80％乙醇提取2次，每次提取70min，合并提取液；

(3)提取液減壓回收得到濃縮液，向濃縮液中加入等體積的純化水，沉淀12h；

(4)取上清液減壓干燥后上酸性氧化鋁柱，用體積濃度為85％的乙醇(含乙酸0.1％，v/v)洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，浸膏減壓干燥得到銀杏葉提取物。

實施例4銀杏葉提取物的制備方法

(1)銀杏葉干燥后粉碎，過40目篩；

(2)加入銀杏葉重量5倍、體積濃度為70％乙醇提取3次，每次提取60min，合并提取液；

(3)提取液減壓回收得到濃縮液，向濃縮液中加入等體積的純化水，沉淀12h；

(4)取上清液減壓干燥后上酸性氧化鋁柱，用體積濃度為90％的乙醇(含乙酸0.3％，v/v)洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，浸膏減壓干燥得到銀杏葉提取物。

實施例5銀杏葉提取物片劑的制備

(1)銀杏葉提取物、淀粉、低取代羥丙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸鎂分別粉 碎，過60目篩；

(2)將銀杏葉提取物30g、淀粉65g、低取代羥丙基纖維素5g、聚乙烯吡咯烷酮4g混合均勻；

(3)將4g硬脂酸鎂加入步驟(2)的混合物中，混合均勻；

(4)將步驟(3)得到的混合物壓片，制備1000片銀杏葉提取物片。

實施例6銀杏葉提取物膠囊劑的制備

(1)銀杏葉提取物、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸鎂分別粉碎，過60目篩；

(2)將銀杏葉提取物30g、淀粉65g、聚乙烯吡咯烷酮3g、硬脂酸鎂4g混合均勻，填充于膠囊囊殼，制備1000粒銀杏葉提取物膠囊。

二、實驗例部分

實驗例1本發(fā)明實施例1～4所制備的銀杏葉提取物分析

本發(fā)明實施例1～4所制備的銀杏葉提取物以銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯、白果內(nèi)酯為指標成分進行含量分析，分析結(jié)果表明，本發(fā)明的實施例1～4制備的銀杏葉提取物中銀杏黃酮含量在20～25wt％之間，銀杏內(nèi)酯含量在2～4wt％之間，白果內(nèi)酯含量在2～4wt％之間，銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯、白果內(nèi)酯三者質(zhì)量百分含量波動小，提取方法穩(wěn)定、可靠。實施例1～4所制備的銀杏葉提取物檢測結(jié)果見表1。

表1實施例1～4所制備的銀杏葉提取物檢測結(jié)果

實驗例2銀杏葉提取物的非臨床藥效學研究

1.實驗材料

1.1實驗動物

性成熟且健康的昆明小鼠，平均年齡6～8周，購于湖北省疾病預防控制中心。小鼠飼養(yǎng)在20～25℃室溫溫度和50～60％濕度環(huán)境下，并且光-暗循環(huán)間隔時間為12小時。

1.2實驗儀器和試劑

銀杏葉提取物(自制)；無水乙醇(國藥化學試劑有限公司)；

乙酰膽堿(美國Sigma公司)；

倒置顯微鏡(Nikon公司)；

張力換能器JH-2型(中國北京航天醫(yī)學工程研究所)；

錐形瓶(崇州市蜀?；び邢挢熑喂?；

HV-4型離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；

超級恒溫水浴鍋HW-1000(成都泰盟科技有限公司)；

生物機能實驗系統(tǒng)BL-420S(成都泰盟科技有限公司)。

1.3實驗溶液配制

1.3.1高鈣溶液的配制

取氯化鈉7.889g、氯化鉀0.3728g、葡萄糖1.982g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.383g、氯化鎂0.2033g、氯化鈣0.2296g，加無菌水至1000mL，再用濃度為0.5mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 7.4。

1.3.2乙酰膽堿溶液的配制

取乙酰膽堿16.3mg，用高鈣溶液溶解并稀釋至1000mL。

1.4藥物材料

取實驗例1制備的銀杏葉提取物，研磨成粉狀，稱取0.3g于離心管中，加入3mL高鈣溶液，配置成100mg/mL的實驗藥物，備用。

2.實驗方法

2.1小鼠氣管的獲取

運用頸椎脫臼法將小鼠處死，然后將小鼠固定在解剖板上，噴灑75wt％酒精，用消過毒的剪刀沿著胸腔剪到頸部，暴露出氣管后，在喉結(jié)處剪開，用鑷子輕提喉結(jié)，剪刀斜著30度剪去左右兩邊的結(jié)締組織，最后分離出氣管與心肺組織，迅速置于預冷的高鈣溶液中。將組織固定于解剖盤中，清除氣管周圍的各種結(jié)締組織，然后將氣管上端到支氣管前端剪斷。

2.2張力換能器試驗系統(tǒng)調(diào)試

對儀器經(jīng)行校準后打開氧氣閥門，調(diào)節(jié)供氧量在合適的范圍，以保證組織的基本耗氧量但又不干擾測試基線，再打開張力換能系統(tǒng)，采樣率設(shè)為100HZ，打開恒溫控制系統(tǒng)，保證離體組織溫度恒定為37℃，每個浴槽置有6mL高鈣溶液，儀器預熱0.5小時，備用。

2.3氣管的處理及張力換能器的樣品上樣

截取長度為5mm的氣管，將小鼠氣管通過掛鉤銜接張力換能器試驗系統(tǒng)，置于含有6mL37℃高鈣溶液并持續(xù)通氧的恒溫水浴槽內(nèi)。前負荷設(shè)置為300mg，每15分鐘更換一次高鈣溶液，連續(xù)四次。平衡60分鐘后，用100μmol/L乙酰膽堿進行預刺激，使氣管處于最佳收縮狀態(tài)，洗脫后恢復至基線。

2.4銀杏葉提取物對乙酰膽堿預收縮的舒張作用

將小鼠氣管通過掛鉤銜接張力換能器試驗系統(tǒng)，置于含有6mL 37℃高鈣溶液并持續(xù)通氧的恒溫水浴槽內(nèi)。前負荷設(shè)置為300mg，每15分鐘更換一次高鈣溶液，連續(xù)四次。平衡60分鐘后，用100μmol/L乙酰膽堿進行預刺激三次，使氣管肌張力達到800mg以上，洗脫后恢復至基線，再加入乙酰膽堿使氣管預收縮15分鐘，再依次按濃度梯度0.01mg/mL、0.032mg/mL、0.1mg/mL、0.316mg/mL、1mg/mL、3.16mg/mL、5.62mg/mL、10mg/mL的銀杏葉提取物進行試驗，每個濃度作用10分鐘。

3.實驗結(jié)果

小鼠氣管用100μmol/L乙酰膽堿進行預刺激三次，使氣管肌張力達到800mg以上，洗脫后恢復至基線，再加入乙酰膽堿使氣管預收縮15分鐘，小鼠氣管張力為10mN，再給予不同濃度的銀杏葉提取物，測定各濃度項下小鼠氣管的舒張率。結(jié)果見表1。

表2不同濃度銀杏葉提取物對乙酰膽堿預收縮的舒張作用結(jié)果

小鼠氣管張力(mN)＝拉力(mg)/氣管重量(mg)，即單位重量的氣管平滑肌拉力；

舒張率(％)＝(加入藥物前張力—加入藥物后張力)/(加入乙酰膽堿后張力—加入乙酰膽堿前張力)×100％。

由表2可知，隨著銀杏葉提取物濃度的不斷增高，小鼠氣管張力不斷下降，在0.01～5.62mg/mL藥物濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性，當銀杏葉提取物濃度為5.62mg/mL時，小鼠氣管張力降至最低2mN，即使將銀杏葉提取物濃度提高至10mg/mL，小鼠氣管張力也不再下降。本發(fā)明制備的銀杏葉提取物能舒張小鼠氣管平滑肌，解除支氣管痙攣，實現(xiàn)治療哮喘的功效。