本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，具體涉及冠心丹參復(fù)方制劑在制備改善心臟相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

冠心病是心血管疾病中死亡率最高的疾病，其死亡人數(shù)已從1990年的573.7萬增加到了2013年813.9萬。在冠心病眾多類型中，急性心肌梗死為引發(fā)心源性猝死的重要原因，臨床表現(xiàn)為劇烈的胸后疼痛，并伴有血清心肌酶學(xué)指標(biāo)升高以及心電圖、血流動力學(xué)的進(jìn)行性惡化；病理特征為心肌細(xì)胞壞死，并分為凝固型壞死和/或收縮帶壞死。臨床上，強(qiáng)調(diào)以ST段是否呈弓背樣抬高進(jìn)行分類，即分為ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI)和非ST段抬高型心肌梗死(Non-ST-segment elevation myocardial infarction,NSTEMI)。其中，針對STEMI治療的有效策略為溶栓和充分持久的血管再灌注，而一般血管再通外科手術(shù)優(yōu)于藥物溶栓治療，因此多采用心血管外科手術(shù)如經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention,PCI)和冠狀動脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass grafting,CABG)進(jìn)行治療。但是，持續(xù)有效的血液灌注易造成心肌組織損傷，如氧化應(yīng)激、鈣超載、纖維化等，其終末期特征為心室重構(gòu)，進(jìn)而發(fā)展為心力衰竭，導(dǎo)致死亡，這是目前臨床上心肌梗死治療效果不佳的關(guān)鍵因素所在?？梢婎A(yù)防心室重構(gòu)的產(chǎn)生或者逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的進(jìn)程是降低死亡率的關(guān)鍵。

冠心丹參方是收載于2005和2010版藥典中的經(jīng)典活血化瘀中藥復(fù)方，由丹參、三七、降香油制成。該復(fù)方含有丹酚酸B、丹參酮IIA、三參皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1等多種活性成分，方中選用具有行氣止痛作用的降香油為佐使藥，配合活血化瘀的丹參和散血定痛的三七，對以氣滯血瘀為主要病機(jī)的冠心病具有顯著療效。藥理活性研究表明，冠心丹參制劑具有抗炎、抗氧化、抗心肌缺血、抗心律失常、降血壓等多種治療心血管相關(guān)疾病的作用。基于傳統(tǒng)功效，冠心丹參復(fù)方制劑主要用于治療胸痹、胸悶刺痛、心悸氣短、冠心病心絞痛等癥狀；基于現(xiàn)代研究，冠心丹參復(fù)方制劑主要用于心肌缺血、缺氧等疾病的保護(hù)作用。但是，目前沒有關(guān)于該復(fù)方制劑及其單味藥丹參、三七和降香油預(yù)防或治療STEMI冠脈再通后心室重構(gòu)的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用報道。本發(fā)明通過建立公認(rèn)的STEMI冠脈再通后心室重構(gòu)動物模型，研究冠心丹參復(fù)方制劑在改善急性ST段抬高型心肌梗死冠脈再通后心室重構(gòu)的作用，為中草藥及其復(fù)方的二次開發(fā)提供研究范例，也為開發(fā)治療STEMI后心室重構(gòu)的中藥新藥提供科學(xué)基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了冠心丹參復(fù)方制劑在制備用于改善心臟相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。

更具體地，本發(fā)明公開了冠心丹參復(fù)方制劑在制備用于改善急性ST段抬高型心肌梗死冠脈再通后心室重構(gòu)的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明使用的冠心丹參復(fù)方制劑由丹參、三七、降香油制成，配比為丹參﹕三七﹕降香油＝200g﹕200g﹕1.75mL，各個單味藥材所含的指標(biāo)性成分符合2015版《中國藥典》的規(guī)定，可以由商購獲得，也可以按照上述配比以藥典中規(guī)定的方法獲得活性成分，進(jìn)而制備成本領(lǐng)域常用的其它劑型。

本發(fā)明建立了公認(rèn)的急性ST段抬高型心肌梗死冠脈再通后心室重構(gòu)動物疾病模型，即對SD大鼠實行左冠狀動脈前降支結(jié)扎手術(shù)，引起急性ST段抬高型心肌梗死損傷，從心肌三酶(谷草轉(zhuǎn)氨酶AST、乳酸脫氫酶LDH、肌酸激酶同工酶CK-MB)，超聲心動指標(biāo)(左室射血分?jǐn)?shù)LVEF，左室短軸縮短率LVFS)，心肌組織HE染色以及馬松染色等多指標(biāo)驗證模型建立成功。

本發(fā)明通過建立公認(rèn)的動物疾病模型，分別從心肌三酶(谷草轉(zhuǎn)氨酶AST、乳酸脫氫酶LDH、肌酸激酶同工酶CK-MB)，超聲心動指標(biāo)(左室射血分?jǐn)?shù)LVEF，左室短軸縮短率LVFS)，梗死面積，馬松染色以及心肌纖維化標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)水平等多指標(biāo)，充分研究冠心丹參復(fù)方制劑改善急性ST段抬高型心肌梗死冠脈再通后心室重構(gòu)的作用，為該復(fù)方的上市后二次開發(fā)提供堅實的科學(xué)基礎(chǔ)。

本發(fā)明冠心丹參復(fù)方制劑可以顯著抑制STEMI冠脈再通后谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CKMB)的水平，對心肌組織有明顯保護(hù)作用；顯著提高了左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)和等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升的最大速率(+dp/dt)，劑量依賴性降低反映心臟舒張功能的等容舒張時間(Tau)，有效提高冠脈再通后心功能水平；同時冠心丹參復(fù)方制劑能抑制心肌組織中的平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達(dá)，顯著降低心肌纖維化的面積，發(fā)揮抗心室重構(gòu)的重大作用。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1.建立了成熟的急性ST段抬高型心肌梗死冠脈再通后心室重構(gòu)動物疾病模型，為后續(xù)的藥物開發(fā)提供堅實的基礎(chǔ)。

2.基于建立的動物疾病模型，發(fā)現(xiàn)了一種改善急性ST段抬高型心肌梗死冠脈再通后心室重構(gòu)的中藥復(fù)方制劑。

3.該復(fù)方制劑在改善急性ST段抬高型心肌梗死冠脈再通后心室重構(gòu)中的作用顯著，為該復(fù)方新的臨床研究和應(yīng)用提供堅實的藥效學(xué)基礎(chǔ)，系統(tǒng)開發(fā)后市場前景廣闊，也為中草藥及其復(fù)方的上市后二次開發(fā)提供范例。

4.該復(fù)方制劑可以顯著抑制STEMI冠脈再通后AST、LDH和CK-MB的水平，保護(hù)心肌組織；顯著提高LVEF、LVFS和+dp/dt值，劑量依賴性降低Tau值；有效提高心肌組織再灌注后心功能水平；同時該復(fù)方制劑通過抑制心肌組織中α-SMA表達(dá)，顯著降低心肌纖維化的面積，發(fā)揮抗心室重構(gòu)的作用。

附圖說明

圖1不同復(fù)灌時間對心肌三酶AST、LDH、CK-MB指標(biāo)的影響(n＝8)，注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖2不同復(fù)灌時間的心肌組織HE染色的結(jié)果

圖3不同復(fù)灌時間的心肌組織馬松染色的結(jié)果

圖4不同復(fù)灌時間的心肌組織超聲心動指標(biāo)LVEF和LVFS檢測的結(jié)果(n＝8)，注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01，***P<0.001。

圖5冠心丹參方對血漿心肌三酶AST、LDH、CK-MB指標(biāo)的影響(n＝10)，注：與假手術(shù)組比較，^###P<0.001；與模型組比較，***P<0.001。

圖6冠心丹參方對心臟功能LVEF和LVFS的影響(n＝10)，注：與假手術(shù)組比較，^###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖7冠心丹參方對心臟功能LVSP、LVEDP、±dp/dt、Tau值的影響(n＝10)，注：與假手術(shù)組比較，^#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖8冠心丹參方對心肌纖維化的影響(n＝3)，注：與假手術(shù)組比較，^###P<0.001；與模型組比較，**P<0.01。

圖9冠心丹參方對心肌缺血再灌注所致心室重構(gòu)的改善作用(n＝3)，注：與假手術(shù)組比較，^###P<0.001；與模型組比較，***P<0.001。

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，不構(gòu)成對本發(fā)明的進(jìn)一步限制。

實施例1：急性ST段抬高型心肌梗死冠脈再通后心室重構(gòu)動物疾病模型的建立

實施例1.1 實驗動物

健康成年雄性SD大鼠90只，SPF級，體重300～330g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

實施例1.2 實驗材料和儀器

戊巴比妥鈉，生理鹽水，AD Instruments多導(dǎo)生理記錄儀，ALC-V8S型小動物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)，外科手速器械快速按照消毒器Germinator 500(美國Harvard apparatus)，動物保溫毯ALC-HTP(上海奧爾科特生物科技有限公司)，一次性靜脈輸液針、醫(yī)用無菌紗布、醫(yī)用手術(shù)剪、醫(yī)用鑷子、醫(yī)用縫合針、醫(yī)用針織編織線6-0、可吸收性外科縫合線PGA均購于上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司。

實施例1.3 模型制作

大鼠禁食8～12h后，用戊巴比妥鈉(按體重40mg/kg)腹腔注射麻醉(刺激后臀部物收縮反應(yīng)，角膜反射消失)，取仰臥位固定于鼠板。徑口插管后，連接小動物呼吸機(jī)，呼吸頻率70次/分，呼吸比例1:1，潮氣量1mL。采用AD Instruments多導(dǎo)生理記錄儀實時記錄大鼠心電圖。將大鼠頸部及其胸部皮膚脫毛后，行胸廓切開術(shù)，于胸骨左側(cè)約0.5cm處，3至4肋間剪開約2～3cm，用擴(kuò)胸器撐開肋骨，呼氣時剪開心包膜，暴露心臟。以左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，于肺動脈圓錐與左心耳之間，約左心耳下方2mm處，用6-0絲線進(jìn)針穿過心肌表層約1～1.5mm，跨度為2～3mm。待穩(wěn)定5min之后，將絲線穿過一根長約3.5cm的一次性靜脈輸液軟管，線穿出后輕提線頭，向下推軟管，用止血鉗夾緊后固定。缺血30min后，松開止血鉗，除去結(jié)扎線后復(fù)灌1d、3d、7d以及14d，建立心肌缺血再灌注損傷模型。判斷結(jié)扎成功的標(biāo)準(zhǔn)為：心電圖中ST段抬高，局部心肌組織顏色由紅變灰白；再灌注30min后，ST段回落50％以上，心肌顏色由灰白變紅。

實施例1.4 分組

70只SD雄性大鼠按體重隨機(jī)分成7組，每組10只；按照復(fù)灌時間的不同分配組別：假手術(shù)組、復(fù)灌1d組、復(fù)灌3d組、7d假手術(shù)組、復(fù)灌7d組、14d假手術(shù)組、以及復(fù)灌14d組。

實施例1.5 模型評價

實施例1.5.1 心肌三酶指標(biāo)檢測

復(fù)灌結(jié)束后，腹主動脈取血。用全自動生化儀檢測血漿中的心肌三酶(AST、LDH、CKMB)水平。

結(jié)果如圖1所示，心肌缺血再灌注引起急性心肌損傷，在復(fù)灌14d時達(dá)到峰值，反應(yīng)心臟病理損傷的最佳時間點。

實施例1.5.2 組織病理學(xué)檢查

取大鼠心臟，將其浸泡于10％中性緩沖福爾馬林(固定≥24h)，固定后的組織經(jīng)修塊取材，逐級酒精脫水，石蠟包埋，滑動切片機(jī)切片，經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下進(jìn)行檢查。

結(jié)果如圖2所示，假手術(shù)組，左心室未見明顯異常；復(fù)灌3d，左心室心肌細(xì)胞變性壞死，炎細(xì)胞浸潤，梗死區(qū)少量纖維組織增生；復(fù)灌7d，左心室和心尖部部分心肌細(xì)胞被纖維組織代替，炎癥細(xì)胞浸潤；復(fù)灌14d，左心室中下部及心尖部局部心肌細(xì)胞消失，不規(guī)則條索狀纖維組織及血管增生，炎細(xì)胞浸潤，并可見左心室壁下部變薄。

實施例1.5.3 馬松染色

取大鼠心臟，將其浸泡于10％中性緩沖福爾馬林(固定≥24h)，固定后的組織經(jīng)修塊取材，逐級酒精脫水，石蠟包埋，滑動切片機(jī)切片，經(jīng)馬松(Masson)染色，光鏡下進(jìn)行檢查。

結(jié)果如圖3所示，假手術(shù)組和復(fù)灌1d，血管周圍可見少量纖維組織，但未見明顯纖維組織增生；復(fù)灌3d，血管周圍可見纖維組織，梗死區(qū)少量纖維組織增生；復(fù)灌7d，左心室壁變薄，梗死區(qū)纖維組織增生；復(fù)灌14d，左心室下部部分心肌細(xì)胞消失，纖維組織及血管增生。

實施例1.5.4 超聲心動指標(biāo)LVEF和LVFS檢測

采用超高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)，對復(fù)灌7d、復(fù)灌14d、7d假手術(shù)組以及14d假手術(shù)組，檢測大鼠左室射血分?jǐn)?shù)LVEF和大鼠左室短軸縮短率LVFS兩個指標(biāo)。

結(jié)果如圖4所示，M-mode超聲心動結(jié)果顯示，與14d假手術(shù)比較，14d模型組心臟前壁顯著變??；而且心臟功能相關(guān)指標(biāo)LVEF和LVFS都顯著的下降(7d vs 7d假手術(shù)組；14d vs 14d假手術(shù)組)。

實施例2：冠心丹參方改善急性ST段抬高型心肌梗死冠脈再通后心室重構(gòu)的保護(hù)作用

實施例2.1 實驗動物

健康成年雄性SD大鼠60只，SPF級，體重300～330g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

實施例2.2 分組及給藥

60只SD大鼠按體重隨機(jī)分為6組，每組10只：假手術(shù)組、模型組、辛伐他汀組(5mg/kg)、冠心丹參方低劑量組(臨床常用量4倍)、冠心丹參方中劑量組(臨床常用量8倍)、冠心丹參方高劑量組(臨床常用量16倍)。通過建立的動物疾病模型，選取復(fù)灌14d作為急性ST段抬高型心肌梗死冠脈再通后所致心室重構(gòu)模型，術(shù)后連續(xù)給予硫酸慶大霉素預(yù)防感染。術(shù)后24h后，以上各組均以灌胃方式給藥(按體重10mL/kg)，連續(xù)14d。末次給藥后，檢測大鼠心臟功能變化、心肌三酶水平、心臟病理變化及纖維化情況，同時考察纖維化指標(biāo)α-SMA的表達(dá)情況。

實施例2.3 統(tǒng)計方法

用SPSS 19.0軟件，各組實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組均數(shù)比較采用方差分析，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

實施例2.4 實驗結(jié)果

實施例2.4.1 冠心丹參方對心肌三酶指標(biāo)的影響

結(jié)果如圖5所示，與假手術(shù)組比較，模型組的血漿心肌三酶AST、LDH以及CKMB水平顯著升高，陽性藥辛伐他汀能顯著降低心肌三酶水平，冠心丹參方低、中、高三個劑量能顯著降低心肌三酶的水平。其中，LDH和CK-MB指標(biāo)的劑量依賴性關(guān)系較明顯。

實施例2.4.2 冠心丹參方對心功能指標(biāo)LVEF和LVFS的影響

結(jié)果如圖6所示，心肌缺血再灌注14d后，體現(xiàn)心臟收縮功能的左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)顯著降低。與模型組比較，冠心丹參方干預(yù)組，左室變薄受到抑制、LVEF、LVFS顯著升高(P<0.01)，與陽性藥辛伐他汀的效果相當(dāng)，且冠心丹參方高劑量組效果更好。

實施例2.4.3 冠心丹參方對心功能指標(biāo)LVSP、LVEDP、±dp/dt、Tau值的影響

結(jié)果如圖7所示，心肌缺血再灌注14d后，體現(xiàn)心臟收縮功能的左室收縮壓(LVSP)和等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升的最大速率(+dp/dt)顯著降低，體現(xiàn)心臟舒張功能等容舒張時間(Tau)顯著升高。與模型組比較，冠心丹參方干預(yù)組，+dp/dt顯著升高(P<0.01)，且冠心丹參方高劑量組作用強(qiáng)于陽性藥辛伐他汀的效果；Tau顯著降低(P<0.001)，有劑量依賴性，且冠心丹參方高劑量組作用強(qiáng)于陽性藥辛伐他汀的效果。

實施例2.4.4 冠心丹參方對心肌纖維化的影響

結(jié)果如圖8所示，心肌缺血再灌注14d后，與假手術(shù)相比，模型組心肌發(fā)生明顯的纖維化病變，纖維化面積與假手術(shù)有顯著差異(P<0.001)，辛伐他汀能逆轉(zhuǎn)心肌纖維化，同樣冠心丹參方也能顯著降低心肌纖維化，減小心肌梗死面積(P<0.001)。

實施例2.4.5 冠心丹參方對心肌纖維化指標(biāo)α-SMA表達(dá)的影響

結(jié)果如圖9所示，Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)比較，模型組心肌組織中心肌纖維化標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)。經(jīng)冠心丹參方干預(yù)后，心肌組織中α-SMA的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)。

顯然，本發(fā)明的上述實施例僅是為了說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而這些屬于本發(fā)明的精神所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。