本發(fā)明屬于基因治療技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及Ddb1蛋白及其在治療Eco1基因缺失而引起的生長(zhǎng)缺陷中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

DNA復(fù)制是一切生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，約40種疾病的產(chǎn)生和DNA復(fù)制相關(guān)，目前至少有14種藥物靶向作用于DNA復(fù)制過程中的蛋白。研究DNA復(fù)制與人類疾病的關(guān)系能從深層次挖掘疾病發(fā)生的機(jī)制，為新藥研發(fā)和疾病治療提供理論基礎(chǔ)。遺傳物質(zhì)的正確傳遞對(duì)基因組的穩(wěn)定性至關(guān)重要，姐妹染色單體粘連在其中發(fā)揮不可或缺的作用。

姐妹染色單體粘連(sister chromatid cohesion，SCC)是兩條姐妹染色單體結(jié)合在一起建立粘連并解離的過程，其過程受到嚴(yán)格調(diào)控，SCC的建立對(duì)于姐妹染色單體的分離和遺傳物質(zhì)的正確傳遞具有重要的意義。SCC功能的發(fā)揮主要依靠粘連蛋白及其調(diào)節(jié)蛋白共同完成，其中粘連蛋白是由Smc1，Smc3，Scc1和Scc3構(gòu)成的四元環(huán)狀復(fù)合物。在細(xì)胞周期的G1期，粘連蛋白結(jié)合到染色體上，此時(shí)在負(fù)調(diào)控因子的作用下，結(jié)合是不穩(wěn)定的，環(huán)形的粘連蛋白會(huì)在染色體上進(jìn)行滑動(dòng)；隨著細(xì)胞周期的行進(jìn)，細(xì)胞進(jìn)入S期，乙酰轉(zhuǎn)移酶Eco1將粘連蛋白的Smc3亞基進(jìn)行乙?；?，乙?；蟮恼尺B蛋白穩(wěn)定結(jié)合在染色體上；在G2期，姐妹染色單體粘連穩(wěn)定建立，并能拮抗負(fù)調(diào)控因子的作用；細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期的后期以后，分離酶將粘連蛋白的Scc1亞基進(jìn)行切割，粘連蛋白從染色體上脫離，去乙?；窰os1對(duì)Smc3進(jìn)行去乙?；?，兩條姐妹染色單體被分向兩個(gè)子細(xì)胞的兩極，確保遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。SCC不僅參與DNA復(fù)制，DNA損傷修復(fù)等多種生物學(xué)過程也需要SCC的參與。已有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)SCC的建立發(fā)生問題后，將會(huì)造成包括黑色素瘤，結(jié)腸癌，胚胎癌，乳腺癌，前列腺癌等在內(nèi)的多種嚴(yán)重疾病的發(fā)生。研究SCC的建立和疾病的關(guān)系，將會(huì)給治療多種遺傳疾病帶來新的希望。

姐妹染色單體粘連的建立需要乙酰轉(zhuǎn)移酶Eco1參與其中。Eco1首次發(fā)現(xiàn)是在酵母突變體中，此突變體表現(xiàn)出染色體丟失率提高，且在異染色質(zhì)重組過程中也有缺陷。隨后，Eco1相繼在其它生物中被發(fā)現(xiàn)，并且都是必需基因。通過對(duì)不同物種中Eco1的序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)不同物種的N端長(zhǎng)度有所不同，但是其C端序列非常保守，為乙酰轉(zhuǎn)移酶活性中心。缺失乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的姐妹染色單體粘連缺陷，繼而導(dǎo)致死亡，表明Eco1的主要功能是其乙酰轉(zhuǎn)移酶的作用。

在人細(xì)胞中，存在兩種Eco1的同源蛋白ESCO1和ESCO2，此兩種蛋白都可以對(duì)Smc3進(jìn)行乙酰化，但它們的功能也有所不同，并非完全冗余。不管缺失哪個(gè)ESCO蛋白，另一個(gè)蛋白均無法完全回補(bǔ)其所引起的缺陷。ESCO2突變后會(huì)導(dǎo)致一種發(fā)育失常疾病，稱為羅伯茨綜合癥(Roberts syndrome，RBS)。羅伯茨綜合癥(Roberts Syndrome)是由并且僅僅由ESCO2基因的突變導(dǎo)致的疾病，癥狀包括患者生長(zhǎng)遲緩、肢體發(fā)生畸形、手畸形、顱面骨畸形等，還會(huì)引起心臟、腎、生殖器及頭發(fā)的異常。

ESCO2基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有3376個(gè)核苷酸，成熟的mRNA由1806個(gè)核苷酸組成，編碼601個(gè)氨基酸。ESCO2蛋白N端含有與染色質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，C端具有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。ESCO2突變會(huì)導(dǎo)致羅伯茨綜合癥。除兩例外，大部分突變都是移碼突變或者無義突變，造成蛋白質(zhì)截短或者無功能的蛋白質(zhì)。另外兩例屬于錯(cuò)義突變，由于乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域高度保守的氨基酸殘基被替代，造成乙酰轉(zhuǎn)移酶活性喪失。在人細(xì)胞中，ESCO2是建立染色單體粘連所必需的。

DNA的復(fù)制和修復(fù)過程受到泛素化修飾的調(diào)節(jié)，尤其是受到Cullin 4(Cul4)-RING E3泛素連接酶的調(diào)控。所有的Cullin通過C-端區(qū)域與RING finger protein Rbx1/Hrt1相互作用，然后招募E2泛素結(jié)合酶。Cullin的N-端結(jié)構(gòu)域分別與不同種類的底物特異的接頭蛋白(adaptor)相互作用。人基因組表達(dá)兩種Cul4的同源蛋白：Cul4A蛋白和Cul4B蛋白，它們通過N-端區(qū)域與Ddb1蛋白相互作用，然后Ddb1蛋白與各種底物特異的接頭蛋白相互作用。這些接頭蛋白(adaptor)叫做DCAFs(Ddb1-Cul4associated factors)。但是，對(duì)于DNA復(fù)制和修復(fù)中泛素化底物以及DCAFs參與的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。

目前常用的基因治療方法有兩種：一種方法是“體外法”，即將外源基因?qū)塍w外培養(yǎng)的受體細(xì)胞，經(jīng)過適當(dāng)?shù)暮Y選方法，把重組的受體細(xì)胞回輸患者體內(nèi)，讓外源基因表達(dá)發(fā)揮作用，以緩解患者癥狀。另一種稱為“體內(nèi)法”，指直接將外源DNA注射至機(jī)體內(nèi)，DNA可以單純注射，也可以與輔助物如脂質(zhì)體一起注射，使外源基因在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄、翻譯而發(fā)揮治療作用。體內(nèi)法的基因治療方式比體外法簡(jiǎn)單、直接、經(jīng)濟(jì)，療效也比較確切。常用的方式有病毒介導(dǎo)、寡核苷酸直接注射、脂質(zhì)體介導(dǎo)和體內(nèi)基因直接注射等。

現(xiàn)有技術(shù)中，涉及Ddb1蛋白的研究主要體現(xiàn)在降低Cul4和Ddb1相互作用的小分子化合物，用于制備或治療動(dòng)物體內(nèi)DNA損傷相關(guān)狀態(tài)的藥物，(申請(qǐng)?zhí)?00980115291.6)。目前沒有涉及到Ddb1在ESCO2引起的遺傳疾病方面的研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)目前的基因療法存在靶向性不夠精確、需要開發(fā)更多的治療基因以獲得更好的療效的現(xiàn)狀，提供與ESCO2突變引起的遺傳疾病相關(guān)的基因及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明通過在酵母中過表達(dá)Mms1(相當(dāng)于人類的Ddb1蛋白)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Ddb1蛋白能夠抑制Eco1基因缺失而引起的生長(zhǎng)缺陷。

進(jìn)而，本發(fā)明提供了Ddb1蛋白在制備治療ESCO2基因突變、缺失或ESCO2蛋白功能缺失引起的疾病藥物中的應(yīng)用，所述Ddb1蛋白含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

上述應(yīng)用中，所述的疾病為羅伯茨綜合癥。

本發(fā)明提供了編碼Ddb1蛋白的基因在制備治療ESCO2基因突變、缺失或ESCO2蛋白功能缺失引起的疾病藥物中的應(yīng)用，所述編碼Ddb1蛋白的基因含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

上述應(yīng)用中，所述的疾病為羅伯茨綜合癥。

本發(fā)明提供了一種蛋白過表達(dá)促進(jìn)劑在制備ESCO2基因突變、缺失或ESCO2蛋白功能缺失引起的疾病治療藥物中的應(yīng)用，所述蛋白Ddb1蛋白，其含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

上述應(yīng)用中，所述的疾病為羅伯茨綜合癥。

本發(fā)明提供了含有Ddb1蛋白編碼基因的生物材料在制備治療ESCO2基因突變、缺失或ESCO2蛋白功能缺失引起的疾病藥物中的應(yīng)用，所述Ddb1蛋白編碼基因含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

上述應(yīng)用中，所述的生物材料為表達(dá)載體或宿主細(xì)胞。所述的疾病為羅伯茨綜合癥。

本發(fā)明還提供了含有Ddb1蛋白或其編碼基因的藥物，所述Ddb1蛋白含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；Ddb1蛋白編碼基因含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明能夠解決目前的基因療法存在的不足：靶向性不夠精確；需要開發(fā)更多的治療基因以獲得更好的療效。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)Ddb1基因可作為新的治療基因，具有廣闊的前景。本發(fā)明在酵母中過表達(dá)Mms1能夠抑制Eco1基因缺失而引起的生長(zhǎng)缺陷(圖1)，同時(shí)也可以回補(bǔ)由于Eco1基因缺失而引起的Smc3乙?；降南陆?圖2)。這一機(jī)制在真核生物中是保守的。因此，對(duì)于ESCO2基因功能缺陷引起惡性羅伯茨綜合癥的患者，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)該疾病的治療：(1)在體細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入Ddb1基因，使Ddb1蛋白在患者體內(nèi)過表達(dá)，利用病毒方法或非病毒方法兩種方式之一。病毒方法可以采用將Ddb1構(gòu)建至腺病毒載體中，非病毒方法可以將外源DNA片段直接導(dǎo)入至細(xì)胞中，以抑制ESCO2基因功能缺陷，達(dá)到治療的目的。(2)直接注射Ddb1重組蛋白，彌補(bǔ)ESCO2基因功能缺陷。例如可通過構(gòu)建表達(dá)Ddb1重組蛋白質(zhì)粒，令Ddb1重組蛋白大量表達(dá)，對(duì)表達(dá)的Ddb1重組蛋白進(jìn)行純化，將純化后的Ddb1蛋白直接注射至羅伯茨綜合癥患者體內(nèi)。

附圖說明

圖1為過量表達(dá)泛素連接酶復(fù)合物Rtt101^Mms1的Mms1亞基能抑制eco1-1突變體的高溫生長(zhǎng)缺陷示意圖。用梯度稀釋實(shí)驗(yàn)觀察各突變菌株在25℃，30℃，34℃，37℃的生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過量表達(dá)Mms1使在30℃，34℃，37℃致死的突變體得以正常生長(zhǎng)。AD-Eco1為正對(duì)照。

圖2為過量表達(dá)泛素連接酶Rtt101^Mms1的Mms1亞基能修復(fù)eco1-1突變體中Smc3的乙?；毕菔疽鈭D，野生型和各突變體菌株中通過TCA提取的全細(xì)胞蛋白分別用圖中所示抗體進(jìn)行免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)。結(jié)果顯示在eco1-1突變體中過量表達(dá)Mms1時(shí)，可將突變體中較低量的Smc3乙?；匮a(bǔ)至與野生型同一水平。其中Western Blot結(jié)果以微管蛋白(Tubulin)作為上樣量對(duì)照。AD為載體pGADT7的簡(jiǎn)稱，指在酵母細(xì)胞中表達(dá)了pGADT7的空載體作為對(duì)照。AD-Mms1為載體pGADT7-Mms1的簡(jiǎn)稱,在酵母細(xì)胞中表達(dá)了pGADT7-Mms1作為實(shí)驗(yàn)組。α-ac-Smc3指識(shí)別Smc3乙?；目贵w，α-Smc3指識(shí)別Smc3的抗體，α-Tubulin指識(shí)別Tubulin的抗體。

圖3為人細(xì)胞ESCO2與酵母Eco1蛋白序列比對(duì)結(jié)果圖，ESCO2和Eco1在NCBI中g(shù)i號(hào)分別為gi62899035和gi14318550，從圖中可以看出此兩種蛋白N端變化較大，但是C端乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域非常保守(ESCO2 534-601位氨基酸,Eco1 211-281位氨基酸)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，下列實(shí)施例中，Phusion高保真聚合酶購(gòu)自Thermo fisher，Pfu購(gòu)自全式金生物公司，Tag聚合酶購(gòu)自Takara公司，限制性內(nèi)切酶購(gòu)買自NEB公司，T4連接酶購(gòu)買自NEB公司，pRS313,pRS316,pGADT7,pAG25購(gòu)自Addgene，引物由生工生物公司合成。若未特別說明，所用原料均為市售商品。

實(shí)施例1 eco1-1突變體菌株的構(gòu)建

1、構(gòu)建釀酒酵母中乙酰轉(zhuǎn)移酶Eco1的表達(dá)載體：pRS316-Eco1,pRS313-Eco1

注：pRS316是以URA為營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)記的酵母表達(dá)載體,

pRS313是以HIS為營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)記的酵母表達(dá)載體

(1)以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741的基因組DNA為模板，用Pfu聚合酶PCR擴(kuò)增Eco1目的片段：

Eco1-F：5’-CGCGGATCCCAATTTGATCTTTTTATAAA-3’；

Eco1-R：5’-CCGGAATTCTCATATGTATACCGGCAATA-3’然后用

多功能DNA純化試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

(2)用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切Eco1目的片段和載體pRS316。反應(yīng)體系：反應(yīng)緩沖液5μL，分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ1.5μL，DNA2μg，加水至50μL，37℃酶切2小時(shí)。

(3)電泳，用膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。

(4)取3μL回收產(chǎn)物進(jìn)行電泳，估測(cè)DNA濃度。設(shè)置連接反應(yīng)體系：載體100ng，目的片段(目的片段與載體摩爾比為3:1-10:1)，T4DNA連接酶1μL，加水至10μL，16℃過夜連接。

(5)取5μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于LB固體培養(yǎng)基(含氨芐霉素)，37℃倒置培養(yǎng)16小時(shí)。

(6)挑取菌落至5mL LB液體培養(yǎng)基(含氨芐霉素)中，37℃、220rpm培養(yǎng)12小時(shí)。

(7)用堿裂解法提取質(zhì)粒。

(8)將質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，反應(yīng)體系為：反應(yīng)緩沖液1μL，BamHⅠ和EcoRⅠ各0.5μL，質(zhì)粒3μL，加水至10μL，37℃酶切1小時(shí)，電泳檢測(cè)大小。

(9)將酶切正確的質(zhì)粒送測(cè)序,得到正確的pRS316-Eco1載體，pRS313-Eco1載體的構(gòu)建與pRS316-Eco1載體的構(gòu)建方法相同。

2、構(gòu)建釀酒酵母中乙酰轉(zhuǎn)移酶Eco1突變體eco1-1的表達(dá)載體

pRS313-eco1-1

(1)設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)引物。點(diǎn)突變引物為：

eco1-1(G211D)-F：

5-CCCGATTTTAAGATTGACATATCGAGAATTTGGGTGTG-3’；

eco1-1(G211D)-R：

5-CCAAATTCTCGATATGTCAATCTTAAAATCGGGGTAC-3’。

(2)以pRS316-Eco1，pRS313-Eco1為模板，進(jìn)行PCR。設(shè)置PCR反應(yīng)體系：5×HF Buffer10μL；dNTPs(10mM)1μL；Template(5-50ng)1μL；上述上下游引物各0.5μL；Phusion高保真聚合酶0.5μL；DMSO 1.5μL加H₂O至50μL。注意Phusion聚合酶需要熱啟動(dòng)，應(yīng)最后加入，加入后立即反應(yīng)。反應(yīng)程序：98℃5分鐘；98℃10秒，58℃30秒，72℃4分鐘(延伸時(shí)間＝模板長(zhǎng)度/2kb/分鐘)，17個(gè)循環(huán)；72℃20分鐘；采用如上PCR體系和程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

(3)取10μL PCR產(chǎn)物加入1μL DpnⅠ，37℃消化模板(因?yàn)橘|(zhì)粒DNA存在甲基化修飾，而PCR產(chǎn)物沒有甲基化修飾，而DpnⅠ只作用于存在甲基化修飾的DNA)。

(4)將消化后的體系取5μL轉(zhuǎn)化DH5α，將轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒并測(cè)序。得到正確的pRS313-eco1-1載體。

3、運(yùn)用Plasmid Shuffling實(shí)驗(yàn)獲得eco1-1突變菌株

因乙酰轉(zhuǎn)移酶對(duì)于釀酒酵母的生長(zhǎng)是必需的，因此對(duì)基因組上的ECO1基因進(jìn)行改造時(shí)，需提前轉(zhuǎn)入一個(gè)能夠表達(dá)Eco1蛋白的質(zhì)粒。

(1)pRS316-Eco1和pRS313-eco1-1質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化

1)以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741作為背景菌株接入液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至2×10⁷個(gè)細(xì)胞/mL(OD600＝1.0)。

2)5mL的培養(yǎng)菌液以2500g，30s的離心條件將細(xì)胞收集至無菌1.5mL離心管中，去掉上層液體培養(yǎng)基。

3)將細(xì)胞懸浮于1mL無菌超純水中，再以2500g，30s的離心條件將細(xì)胞收集于離心管中，去掉上清。

4)將細(xì)胞懸浮于1mL 0.1mol/L乙酸鋰溶液中，再以2500g，30s的離心條件將細(xì)胞收集于離心管中，去掉上清。

5)將1mL單鏈載體DNA樣品煮沸5min，快速在冰水中冷卻。

6)在離心后的細(xì)胞上層添加轉(zhuǎn)化混合液，轉(zhuǎn)化混合液組成如下，按下列順序添加：PEG3350(50％W/V)240μL，1mol/L LiOAc(乙酸鋰)36μL，單鏈載體DNA(2mg/mL)50μL，需轉(zhuǎn)化的pRS316-Eco1和pRS313-eco1-1各1μL,無菌超純水32μL，總體積360μL。添加完成后劇烈震蕩至整個(gè)體系完全混勻，置于冰上3min。

7)42℃熱激40min。

8)以2500g，30s的離心條件將細(xì)胞收集于離心管中，去掉上清。

9)將細(xì)胞懸浮于1mL無菌超純水中，再以2500g，30s的離心條件將細(xì)胞收集于離心管中，去掉上清。

10)將細(xì)胞懸浮于100μL無菌超純水中，均勻涂抹于SC-URA-HIS固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)24-72h，即可得到帶有pRS316-Eco1

(2)利用同源重組對(duì)基因組上的ECO1進(jìn)行敲除

1)以pAG25質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)5’末端含有目標(biāo)序列位置上下游各39nt同源臂的一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增該置換片段。所用引物如下：

eco1-del-F:

5’-ACATATTAGGGTTCAACAGAATATAAATCGTTGCACAAAACATGGAGGCCCAGAATACCCT–3’；

eco1-del-R:

5’-ATTTTTCCAGTGTCCCTTCTCGCTGTCTTTTCGAAAGAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC–3’。

2)以pAG25質(zhì)粒為模板，用Tag聚合酶PCR擴(kuò)增能同源替換基因組上ECO1的帶有表達(dá)NAT抗性的目的片段。PCR反應(yīng)體系：2×Tag聚合酶25μL；Template(5-50ng)1μL；Primer F 2μL；Primer R 2μL；；加H₂O至50μL。反應(yīng)程序：95℃5分鐘；95℃1分鐘，58℃30秒，72℃2分鐘(延伸時(shí)間＝模板長(zhǎng)度/1kb/分鐘)，30個(gè)循環(huán)；72℃20分鐘；采用如上PCR體系和程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

(3)利用上述酵母轉(zhuǎn)化的方法將PCR得到的目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入BY4741 pRS316-Eco1 pRS313-eco1-1菌株中。均勻涂抹于SC-URA-HIS+NAT的固體培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化子單菌落，劃線于新固體平板上。挑取菌體，快速提取酵母基因組，PCR鑒定DNA片段是否發(fā)生置換。最后得到基因組上ECO1敲除的菌株：BY4741 eco1Δ::NAT pRS316-Eco1 pRS313-eco1-1。

(4)運(yùn)用Plasmid Shuffling實(shí)驗(yàn)獲得eco1-1突變菌株。5-氟乳清酸(5-FOA)是作為一種負(fù)篩選藥物，在酵母細(xì)胞能表達(dá)URA3時(shí)，URA3基因編碼的酶可以使5-FOA變成對(duì)細(xì)胞有毒性的物質(zhì)，使酵母細(xì)胞在含5-FOA的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。而上述實(shí)驗(yàn)提到的pRS316-Eco1質(zhì)?？杀磉_(dá)URA3，因此通過加入5-FOA可篩選到pRS316-Eco1丟失的菌株。

將上述步驟得到的菌株：BY4741 eco1Δ::NAT pRS316-Eco1pRS313-eco1-1劃在SC-HIS+5-FOA的平板上進(jìn)行篩選，得到的菌株即為乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷突變體eco1-1：BY4741 eco1Δ::NAT pRS313-eco1-1。

實(shí)施例2 泛素連接酶Rtt101^-Mms1的亞基Rtt101回補(bǔ)乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷突變體eco1-1的鑒定

1、泛素連接酶Rtt101^-Mms1回補(bǔ)乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷突變體eco1-1的相關(guān)載體pGADT7-Eco1、pGADT7-Mms1的構(gòu)建

pGADT7是以LEU為營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)記的酵母表達(dá)載體

(1)以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY4741的基因組DNA為模板，用Pfu聚合酶PCR擴(kuò)增Eco1、Mms1的目的片段。

所用引物序列如下：

Eco1-2-F：5’-CCGGAATTCATGAAAGCTAGGAAATCGCA-3’

Eco1-2-R：5’-CGCGGATCCTCATATGTATACCGGCAATA-3’

Mms1-F：5’-TCCCCCCGGGTATGCTAGGTTTGCGAACTCAT-3’

Mms1-R：5’-CCGCTCGAGGGGAATTATACTGTGTTCTTGC-3’

然后用多功能DNA純化試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

(2)用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切目的片段ECO1和載體pGADT7。反應(yīng)體系：反應(yīng)緩沖液5μL，分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ1.5μL，DNA2μg，加水至50μL，37℃酶切2小時(shí)。

(3)用XmaⅠ和XhoⅠ雙酶切目的片段MMS1和載體pGADT7。反應(yīng)體系：反應(yīng)緩沖液5μL，分別加入XmaⅠ和XhoⅠ1.5μL，DNA2μg，加水至50μL，37℃酶切2小時(shí)。

(4)電泳，用膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。

(5)取3μL回收產(chǎn)物進(jìn)行電泳，估測(cè)DNA濃度。設(shè)置連接反應(yīng)體系：載體100ng，目的片段(目的片段與載體摩爾比為3:1-10:1)，T4DNA連接酶1μL，加水至10μL，16℃過夜連接。

(6)取5μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于LB固體培養(yǎng)基(含氨芐霉素)，37℃倒置培養(yǎng)16小時(shí)。

(7)挑取菌落至5mLLB液體培養(yǎng)基(含氨芐霉素)中，37℃、220rpm培養(yǎng)12小時(shí)。

(8)用堿裂解法提取質(zhì)粒。

(9)將質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，1)pGADT7-Eco1反應(yīng)體系為：反應(yīng)緩沖液1μL，BamHⅠ和EcoRⅠ各0.5μL，質(zhì)粒3μL，加水至10μL，37℃酶切1小時(shí)，電泳檢測(cè)大小。2)pGADT7-Mms1反應(yīng)體系為：反應(yīng)緩沖液1μL，XmaⅠ和XhoⅠ各0.5μL，質(zhì)粒3μL，加水至10μL，37℃酶切1小時(shí)，電泳檢測(cè)大小。

(10)將酶切正確的質(zhì)粒送測(cè)序，得到正確的pGADT7-Eco1、pGADT7-Mms1載體。構(gòu)建得到泛素連接酶Rtt101^-Mms1回補(bǔ)乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷突變體eco1-1的相關(guān)載體pGADT7-Eco1、pGADT7-Mms1。

2、泛素連接酶復(fù)合物Rtt101^-Mms1回補(bǔ)乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷突變體eco1-1的菌株構(gòu)建

利用酵母轉(zhuǎn)化的方法將步驟1中得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入實(shí)施例1制得的乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷突變體eco1-1中即：BY4741eco1Δ::NAT pRS313-eco1-1中，最后得到泛素連接酶復(fù)合物亞基的過量表達(dá)回補(bǔ)菌株。

1)以實(shí)施例1制得的乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷突變體eco1-1中即：BY4741eco1Δ::NAT pRS313-eco1-1作為背景菌株接入液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至2×10⁷個(gè)細(xì)胞/mL(OD600＝1.0)。

2)5mL的培養(yǎng)菌液以2500g，30s的離心條件將細(xì)胞收集至無菌1.5mL離心管中，去掉上層液體培養(yǎng)基。

3)將細(xì)胞懸浮于1mL無菌超純水中，再以2500g，30s的離心條件將細(xì)胞收集于離心管中，去掉上清。

4)將細(xì)胞懸浮于1mL 0.1mol/L乙酸鋰溶液中，再以2500g，30s的離心條件將細(xì)胞收集于離心管中，去掉上清。

5)將1mL單鏈載體DNA樣品煮沸5min，快速在冰水中冷卻。

6)在離心后的細(xì)胞上層添加轉(zhuǎn)化混合液，轉(zhuǎn)化混合液由組成如下，按下列順序添加：PEG3350(50％W/V)240μL，1mol/L LiOAc(乙酸鋰)36μL，單鏈載體DNA(2mg/mL)50μL，需轉(zhuǎn)化的pGADT7，pGADT7-Eco1,或pGADT7-Mms1各1μL,無菌超純水32μL，總體積360μL。添加完成后劇烈震蕩至整個(gè)體系完全混勻，置于冰上3min。

7)42℃熱激40min。

8)以2500g，30s的離心條件將細(xì)胞收集于離心管中，去掉上清。

9)將細(xì)胞懸浮于1mL無菌超純水中，再以2500g，30s的離心條件將細(xì)胞收集于離心管中，去掉上清。

10)將細(xì)胞懸浮于100μL無菌超純水中，均勻涂抹于SC-HIS-LEU固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)24-72h。

11)挑取轉(zhuǎn)化子單菌落，劃線于新固體平板上。

12)同時(shí)在乙酰轉(zhuǎn)移酶Eco1功能正常的細(xì)胞中(即背景菌株BY4741)，轉(zhuǎn)入pGADT7的空載體作為對(duì)照，轉(zhuǎn)化方法見上述即步驟2)-11)。

13)最后得到泛素連接酶復(fù)合物亞基的過量表達(dá)回補(bǔ)菌株。即

BY4741 eco1Δ::NAT pRS313-eco1-1 pGADT7；

BY4741 eco1Δ::NAT pRS313-eco1-1 pGADT7-ECO1；

BY4741 eco1Δ::NAT pRS313-eco1-1 pGADT7-MMS1；

3、通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)泛素連接酶Mms1對(duì)乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷突變體eco1-1的回補(bǔ)。

(1)TCA-丙酮法提取酵母細(xì)胞總蛋白收集5OD的酵母細(xì)胞，用1mL 0.25mol/L NaOH，1％β-巰基乙醇重懸菌體，用移液器吹打均勻，冰上放置10min。加入160μL 50％TCA溶液，振蕩混勻后置冰上10min。以15000g轉(zhuǎn)速、4℃離心10min，除盡上清。用1mL預(yù)冷丙酮重懸沉淀，使用微量移液器吹打至沉淀至其充分分散，以15000g轉(zhuǎn)速、4℃離心10min，除盡上清。將沉淀在60℃烘箱中烘干，用1×SDS蛋白加樣緩沖液懸浮沉淀，沸水浴5min。其中1×SDS蛋白加樣緩沖液組分：Tris-Cl(pH6.8)50mmol/L,SDS 2％，溴酚0.1％,甘油10％,β-巰基乙醇100mM。

(2)免疫印跡將上述樣品進(jìn)行8％的SDS-PAGE凝膠分離。將完成電泳的SDS-PAGE凝膠放置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡。裁取與凝膠等大的PVDF膜，甲醇中浸泡1min激活后，置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡。打開夾板，將黑色夾板一側(cè)浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，從下到上分別放置已浸泡過的海綿墊和兩張合適大小的濾紙。整個(gè)部分浸沒于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，防止氣泡產(chǎn)生。在濾紙上以從下到上的順序放置，凝膠、PVDF膜和兩張浸泡過的濾紙。整個(gè)動(dòng)作浸沒于轉(zhuǎn)膜緩沖液中以防止氣泡產(chǎn)生。最后放置浸泡過的海綿墊于最上層，收緊閉合轉(zhuǎn)膜夾板，對(duì)準(zhǔn)電極，插入轉(zhuǎn)膜槽中。250mA，1h，4℃轉(zhuǎn)膜電泳。轉(zhuǎn)膜完成后，取出PVDF膜，置于用PBST配制的5％脫脂牛奶中，室溫封閉1h。去掉封閉液，將抗體用PBST配制的2％脫脂牛奶稀釋至合適濃度，室溫孵育1h。(anti-ac-Smc3，anti-Smc3，anti-Tubulin)去掉一抗液，室溫下用PBST洗PVDF膜3次，每次10min。將相應(yīng)二抗用PBST配制的2％脫脂牛奶稀釋至合適濃度，室溫孵育1h。去掉二抗孵育液，室溫下用PBST洗PVDF膜3次，每次10min。將ECL顯色液A、B等量混合后，與PVDF膜室溫反應(yīng)3min，去掉膜上多余顯色液，將PVDF膜封好后固定在暗匣中，暗室曝光顯影。結(jié)果見圖2。

實(shí)施例3 酵母中過表達(dá)Mms1(相當(dāng)于人類的Ddb1蛋白)能夠抑制Eco1基因缺失而引起的生長(zhǎng)缺陷

用實(shí)施例2中得到菌株進(jìn)行梯度敏感實(shí)驗(yàn)。即：

BY4741 eco1Δ::NAT pRS313-eco1-1 pGADT7；

BY4741 eco1Δ::NAT pRS313-eco1-1 pGADT7-ECO1；

BY4741 eco1Δ::NAT pRS313-eco1-1 pGADT7-MMS1

具體操作如下：

1)將上述菌株過夜培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并將所有實(shí)驗(yàn)菌株的細(xì)胞濃度用水調(diào)至2×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL。

2)吸取250微升各實(shí)驗(yàn)菌株細(xì)胞，滴加到96孔板第一列，用多通道微量移液器在96孔板第二列至第五列滴加200微升滅菌超純水。

3)從96孔板第一列至第六列共設(shè)五個(gè)稀釋度，使用多通道微量移液器從第一列吸取50微升的細(xì)胞至第二列充分混勻，再?gòu)牡诙形?0微升細(xì)胞至第三列，以此步驟進(jìn)行5倍的梯度稀釋。

4)使用多通道微量移液器吸取從各稀釋度吸取5微升細(xì)胞滴加至-HIS-LEU平板上，每個(gè)稀釋度滴加的酵母斑點(diǎn)之間的距離為1.5cm。溫度梯度平板分別在25℃，30℃，34℃和37℃進(jìn)行培養(yǎng)。

5)在培養(yǎng)48小時(shí)后進(jìn)行拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果見圖1。圖1為過量表達(dá)泛素連接酶復(fù)合物Rtt101^Mms1的Mms1亞基能抑制eco1-1突變體的高溫生長(zhǎng)缺陷示意圖。用梯度稀釋實(shí)驗(yàn)觀察各突變菌株在25℃，30℃，34℃，37℃的生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過量表達(dá)Mms1使在30℃，34℃，37℃致死的突變體得以正常生長(zhǎng)。AD-Eco1為正對(duì)照，AD為負(fù)對(duì)照，AD-Mms1為實(shí)驗(yàn)組。因?yàn)槿旧珕误w粘連(SCC)的機(jī)制從酵母到人都是保守的，人乙?；疭mc3的乙?；窫SCO2和酵母中的Eco1也是高度保守的(圖3)，所以該結(jié)果可以運(yùn)用到由人類ESCO2引起的疾病治療。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、具體實(shí)施方式及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。